MikroRNA pri razvoju in bolezni ledvic Ⅱ

Razvoj ledvic

Theledvica sesalcev(ali metanefros) je vitalni organ, ki ima ključno vlogo priizločanje presnovnih odpadkov,uravnavanje volumna zunajcelične tekočine, invzdrževanje elektrolitainkislinsko-bazična homeostaza. Poleg tega ledvice proizvajajo pomembne hormone, kot soeritropoetin, kalcitriol,renin, inprostaglandini(48). Funkcionalna zmogljivost ledvice je v korelaciji s številom delujočih nefronov, ki nastanejo med razvojem ledvic pred rojstvom, kar imenujemo tudi nefronska obdarjenost. Vsaka človeška ledvica vsebuje v povprečju 1,000,000 nefrona, čeprav se to število precej razlikuje, ocene pa segajo od 200,000 do 2,000,{{8 }} nefronov (49, 50). zstaranje,izguba funkcionalne rezerve nefronase pojavi čez čas (51, 52); zato je nizka obdarjenost z nefronom ob rojstvu povezana s povečanim tveganjem za razvoj hipertenzije in kronične ledvične bolezni (CKD) pozneje v življenju (53–55). Poleg tega je CAKUT, ki vodi v zmanjšano obdarjenost z nefronom in delovanje nefrona, glavni vzrok za odpoved ledvic pri otrocih, kar ima za posledico znatno obolevnost in umrljivost, povezano s presaditvijo in dializo (56, 57). Tako boljše razumevanje celičnih in molekularnih mehanizmov, na katerih temelji vzpostavitev števila nefronov in normalne tvorbe nefronov, zagotavlja vpogled v nove poti za napovedovanje, preprečevanje in zdravljenje bolezni ledvic pri otrocih.

KOLIKO ČASA TRAJA, DA CISTANCHE DELUJE PRI BOLNIKIH Z LEDVIČNO BOLEZNIJO?

Razvoj metanefrične ledvicese začne okoli embrionalnega dne 10,5 (E10.5) pri miših in okoli petega tedna gestacije pri ljudeh (58). Kot odgovor na induktivne signale iz metanefričnega mezenhima se ureterični popek razširi od kavdalnega konca Wolffijevega voda in prodre v sosednji mezenhim (slika 2). Hkrati morfogeni, ki izvirajo iz sečničnega popka, inducirajo kondenzacijo metanefričnega mezenhima, da nastane pokrovni mezenhim (imenovan tudi nefronski progenitorji) okoli konic ureteričnega popka. Ko nefrogeneza napreduje, se ureterični brstič podvrže zaporednim krogom razvejanja, raztezanja in diferenciacije, da nastanejo zbiralni kanali ledvic. Subpopulacija prednikov nefrona je podvržena mezenhimsko-epitelnemu prehodu, da tvorijo ledvične vezikle, ki po polarizaciji in raztezku postanejo telesne strukture v obliki vejice in S. Končno se distalni del telesa v obliki črke S zlije z zbiralnim kanalom in tvori funkcionalen nefron (59–61). Telo v obliki črke S je podvrženo nadaljnji diferenciaciji, da se oblikujejo zrele celične vrste nefrona, razen zbiralnega kanala. Foxd1+ stromalne progenitorne celice mejijo na nefrone progenitorje v zunanji kortikalni ali nefrogeni coni razvijajoče se ledvice (slika 2) (62). Signali iz kortikalne strome naj bi zavirali ekspanzijo nefronskih matičnih celic in spodbujali njihovo diferenciacijo, saj ablacija ledvične strome povzroči moteno diferenciacijo nefronskih matičnih celic (63). Progenitorne celice Foxd1+ povzročijo nastanek vseh stromalnih celic v metanefrični ledvici, vključno s kortikalnimi in medularnimi intersticijskimi celicami ledvic, periciti, perivaskularnimi fibroblasti, mezangialnimi celicami in gladkimi mišičnimi celicami žil (64, 65). Motnje v katerem koli koraku tega procesa lahko privedejo do CAKUT, glavnega vzroka KLB v otroštvu (66, 67).

Zreli nefron je sestavljen iz glomerula, ki deluje kot filtracijska enota, in tubulnega zadnjega sorpcijskega oddelka, ki je razdeljen na proksimalni zaviti tubul, Henlejevo zanko, distalni zaviti tubul in zbiralni kanal (slika 2). Filtracijska pregrada glomerula (ki obsega fenestriran endotelij, glomerulno bazalno membrano, nožne procese in razrezane diafragme podocitov) omogoča filtracijo plazme in majhnih topljencev, medtem ko selektivno zadržuje beljakovine, kot so albumin in imunoglobulini v krvi (68, 69). Medtem je tubularni reabsorpcijski predel odgovoren za vzdrževanje homeostaze vode, reabsorpcijo raztopljenih snovi (vključno z natrijem, kalijem, kalcijem, fosforjem, magnezijem, glukozo in mnogimi drugimi) ter izločanje kisline in drugih odpadkov.

MiRNA v razvijajočih se ledvicah

V študijah na pogojnih transgenih miših so se miRNA pojavile kot kritični regulatorji morfogeneze ledvic v več celičnih linijah. Začetne študije, ki so ocenjevale funkcionalno vlogo miRNA pri razvoju ledvic, so uporabile pogojno izbris Dicerja (70) v različnih ledvičnih linijah. Vendar je znano tudi, da ima Dicer vloge, neodvisne od miRNA (71), kar je zapletlo interpretacijo teh modelov. Pogojna delecija Dicerja v zgodnjem metanefričnem mezenhimu ali potomcih nefrona povzroči povečano apoptozo matičnih celic nefrona, povišane ravni proapoptotičnega proteina Bim in prezgodnjo prekinitev nefrogeneze (72–75) (tabela 1). Zanimivo je, da izguba izražanja Bim v progenitorjih nefrona s pomanjkanjem Dicer zmanjša apoptozo in delno obnovi tvorbo nefrona. Dve miRNA, izraženi v progenitorjih nefrona, miR-17 in miR-106, sta bili opredeljeni kot zaviralci izražanja BIM (76). Te ugotovitve skupaj kažejo, da miRNA nadzorujejo ravnovesje med preživetjem in apoptozo v nefronskih potomcih, da zagotovijo nastanek pravilnega števila nefronov skozi celotno nefrogenezo.

Slika 2. Shematski prikaz stopenj razvoja metanefrične ledvice. Signali iz sečničnega popka sprožijo kondenzacijo metanefričnega mezenhima, da se oblikuje kapica nefronskih prednikov (kapa mezenhima) okoli konic ureteričnih popkov. Mezenhim kapice je podvržen mezenhimsko-epitelnemu prehodu, da tvori ledvične vezikle, ki se zaporedno razvijejo v telesca v obliki vejice in S. Te strukture se povezujejo s steblom popka sečevoda, ki vodi do zbiralnega kanala. Celice v proksimalni domeni telesa v obliki črke S se diferencirajo v specializirane epitelijske celice zrelega ledvičnega telesca (tj. podocite in celice Bowmanove kapsule), medtem ko se celice v srednjem in distalnem delu diferencirajo v tubularne segmente nefrona (proksimalne tubule). , Henlejeve zanke in distalni tubuli). Ustvarjeno z BioRender.com.

Pogojna delecija Dicerja v liniji sečničnega popka povzroči spekter nepravilnosti, ki so zelo podobne CAKUT, vključno z ledvično displazijo in razvojem cist zbiralnega kanala (73, 77, 78). Prezgodnja prekinitev razvejane morfogeneze (kot odziv na zmanjšano izražanje Wnt11 in c-Ret iz sečničnega popka) je verjetno glavni dejavnik, ki prispeva k ledvični displaziji (73). Začetek tvorbe ciste se pojavi pri približno E15.5 in je povezan z okvarami v primarni dolžini migetalk, povečano apoptotično celično smrtjo in čezmerno celično proliferacijo (73). Ker ima Dicer v celici pomembne vloge, neodvisne od miRNA, je bila pogojna delecija Dgcr8 uporabljena za potrditev, da so fenotipi, opaženi v pogojnih Dicer-nockout modelih, res posledica izgube miRNA. Živali z delecijo Dgcr8 v distalnem nefronu in derivatih zbiralnega kanala razvijejo hidronefrozo in ciste zbiralnega kanala (79), fenotip, podoben CAKUT-u, ki je podoben izgubi aktivnosti Dicer v liniji ureteričnih popkov.

Študije dveh neodvisnih skupin so pokazale, da ablacija Dicerja iz linije ledvične strome Foxd1+ in njegovih derivatov povzroči spekter ledvičnih anomalij, z doslednimi ugotovitvami glede hipoplastičnih ledvic, zmanjšanega števila glomerulov, nenormalnega zorenja glomerulov in okvarjenega žilja vzorčenje (80, 81). Čeprav sta obe skupini opisali večinoma skladne fenotipe z uporabo podobnih modelov miši, sta bili opaženi dve različni razliki. Nakagawa et al. opazili pomanjkanje notranje medule in papile ter zmanjšanje nefrogene cone (80). V nasprotju s tem Phua et al. je pokazala ekspanzijo populacije progenitorjev nefrona in ohranjeno ledvično papilo (81). Nakagawa et al. domnevajo, da so te okvare povezane z motnjami signalizacije poti Wnt, kar ima za posledico spremembe v migraciji in proliferaciji stromalnih celic zaradi znižane regulacije miRNA stromalnih celic, miR-214, miR-199a{{7 }}p in miR-199a-3p (80). Študija Phua et al. predlagali, da spremembe v apoptotičnih programih (vključno z povečano ekspresijo efektorskih genov Bim in p53) prispevajo k fenotipskim okvaram (81). Možno je, da so razlike v genetskem ozadju in/ali učinkovitost rekombinacije, posredovane s Cre, lahko odgovorne za razlike, ki jih opisujejo te študije. Kljub temu so opisani fenotipi skladni z znanimi večplastnimi vlogami ledvične strome pri razvoju ledvic in mehanizmi, na katerih temeljijo ti fenotipi, so verjetno zapleteni glede na naravo delecije Dicer. Potrebne so nadaljnje študije, ki preučujejo specifične miRNA v različnih stromalnih subpopulacijah, da bi bolje opredelili regulativne mehanizme v igri.

Novejše delo je obravnavalo vprašanje delovanja specifičnih miRNA v razvijajočih se ledvicah in nefronskih potomcih. Z uporabo modela človeških embrionalnih matičnih celic so Bantounas et al. je pokazalo, da zaviranje skupine miR-199a~214 povzroči dismorfne glomerule, aberantne proksimalne tubule, zmanjšano izražanje WT1 in povečane intersticijske kapilare v organoidih, podobnih ledvicam (82). Zanimivo je, da globalna delecija miR-210, ki se odziva na hipoksijo, povzroči primanjkljaj nefrona, značilen za moškega (83). Na primer, pogojna delecija grozda miR-17~92 v matičnih nefronih in njihovih derivatih pri miših poslabša proliferacijo matičnih celic in zmanjša število razvijajočih se nefronov. Kot rezultat, mutirane miši razvijejo proteinurijo, ledvično fibrozo in okvarjeno delovanje ledvic (84). Disregulirane ravni ciljnega gena miR-17~92, CFTR, so vpletene v okvarjeno proliferacijo matičnih celic in zmanjšano obdarjenost z nefronom v tem mišjem modelu (85).

Sekvenciranje majhne RNA (smRNA-Seq) se vedno bolj uporablja za profiliranje vzorcev izražanja miRNA in za odkrivanje novih vrst miRNA. smRNA-Seq nefrogenih mezenhimskih celic E15.5 je identificirala 162 označenih miRNA, ki so različno izražene v tej celični populaciji v primerjavi s celimi ledvicami in 49 novimi vrstami miRNA (86). Zanimivo je, da so bile ravni miRNK iz družine miR-200 znatno zmanjšane v prednikih nefrona. Glede na to, da so člani družine miR-200 ključni regulatorji mezenhimsko-epitelijskega prehoda v zbirnem kanalu (87), špekuliramo, da bi lahko njihovo izražanje strogo regulirali, da bi zagotovili normalno epitelno diferenciacijo prednikov nefrona med razvojem ledvic.

Delovanje miRNA v zrelem nefronu

Poleg tega, da so potrebne med razvojem ledvic, miRNA uravnavajo številne biološke procese v glavnih celičnih linijah, ki tvorijo zreli nefron (69, 88–91). V skladu s tem je bilo opisano segmentno specifično izražanje miRNA vzdolž nefrona, vključno z miR-143 in miR-195a v glomerulu, miR-107 in miR{{7} }a v proksimalnem tubulu, miR-193 in miR-378a v debelem ascendentnem delu, miR-874 in miR-155 v distalnem zavitem tubulu in miR{{ 12}}c v zbirnem kanalu (87). Poleg tega funkcionalne študije v predelih zrelega nefrona podpirajo različne vloge miRNA.

Miši brez Dicerja ali Droshe v podocitih kažejo izrazito proteinurijo, glomerulosklerozo in hitro napredovanje do odpovedi ledvic, ki je posledica motenj glomerulne filtracijske pregrade (90–93). Analize in silico so pokazale, da različni navzgor regulirani transkripti v mutiranih glomerulih vsebujejo ciljna zaporedja za člane družine miR-30. Kot vsi štirje družinski člani miR-30 (miR-30c-1, miR-30b, miR-30d in miR-30c{ {9}}) so običajno močno izražene v podocitih, so lahko te miRNA odgovorne za nenormalnosti podocitov in motnje glomerulne filtracijske pregrade pri mutantnih miših (91).

Nekoliko presenetljivo je, da izbris Dicerja iz postnatalnih proksimalnih tubulov sesalcev ne vpliva na razvoj ledvic, histologijo ali funkcijo, vendar ščiti pred ledvično ishemijo/reperfuzijsko poškodbo. Mutirane miši kažejo boljše delovanje ledvic, zmanjšano poškodbo ledvic, nižjo tubularno apoptozo in izboljšano preživetje v primerjavi z njihovimi WT sorodniki iz legla (94). To verjetno odraža "vsoto" učinka delecije več miRNA v proksimalnem tubulu, saj je drugo delo od takrat pokazalo, da je izražanje specifičnih miRNA zaščitno pri ledvični ishemiji/reperfuzijski poškodbi (npr. miR-16 in miR-21; ref. medtem ko so drugi škodljivi (npr. miR-182; ref. 97).

Čeprav se zdi, da so miRNA nepogrešljive za delovanje proksimalnih tubulov, so bistvene za distalne nefrone in homeostazo zbiralnega kanala (79, 88, 98). Zbiranje za kanal specifične inaktivacije Dicerja in drugih kritičnih genov, povezanih z biogenezo miRNA (vključno z Dgcr8, Ago1, 2, 3 in 4), povzroči odpoved ledvic pri odraslih miših zaradi progresivne tubulointersticijske fibroze in intersticijskega vnetja (88). Pred tem sledi delni epitelno-mezenhimski prehod (EMT) zbiralnih kanalskih celic in znižana regulacija članov družine miR-200, ki zavirajo EMT (88). Podobno povzroči ablacija Dicerja ali Dgcr8 iz distalnega nefrona oziroma derivatov sečničnega popka do ledvičnih nepravilnosti in odpovedi ledvic (78, 98), kar je na koncu povezano z znižano regulacijo družinskih članov miR-200 (98). Povečano izražanje miR-200 ciljnega gena Pkd1 pri teh mutiranih miših moti tubulogenezo in proizvaja ciste podobne strukture (98). Te razlike v zahtevah po funkcionalnih miRNA v proksimalnih tubulih in distalnem nefronu/zbiralnem kanalu je mogoče pojasniti s segmentno porazdelitvijo miRNA vzdolž dolžine nefrona in zbiralnega voda v ledvicah WT (88).

Delecija Dicerja v celicah, ki izločajo renin, v jukstaglomerularnem aparatu povzroči pomanjkanje jukstaglomerularnih celic, zmanjšano raven renina v obtoku s posledičnim znižanjem arterijskega krvnega tlaka, zmanjšano delovanje ledvic, črtast vzorec intersticijske fibroze in vaskularne nenormalnosti (89). Zmanjšanje jukstaglomerularnih celic kaže na potrebo po zrelih miRNA pri vzdrževanju njihovega fenotipa. Kasneje sta bila miR-330 in miR-125b-5p opredeljena kot potencialna kandidata, ki zavirata oziroma spodbujata fenotip gladkih mišic jukstaglomerularnih celic (99).

Druga aktivna področja raziskav miRNA pri akutni poškodbi ledvic (8–10), policistični ledvični bolezni (11) in presaditvi ledvice (10) so bila celovito obravnavana v drugih nedavnih pregledih.

MiRNA pri pediatričnih ledvičnih boleznih V tem razdelku nudimo pregled vloge miRNA pri razvojnih ledvičnih boleznih, vključno s tumorji CAKUT in Wilms. CAKUT so med najpogostejšimi oblikami malformacij ob rojstvu, saj prizadenejo približno 3–7 od 1000 živorojenih otrok (100). Motnje v razvoju ledvic in spodnjega urinarnega trakta vodijo do širokega spektra kliničnih manifestacij, opaženih pri CAKUT, vključno z anomalijami ledvic (tj. ledvično agenezo, ledvično hipoplazijo in displazijo ter multicistične displastične ledvice), ureteropelvičnimi anomalijami (tj. obstrukcijo ureteropelvičnega spoja), duplex zbiralni sistem ter anomalije mehurja in sečnice (101–103). Ta fenotipska heterogenost je verjetno posledica kompleksnih interakcij med genetskimi, epigenetskimi in/ali prenatalnimi okoljskimi dejavniki, ki vplivajo na razvoj ledvic in spodnjih sečil, kar povzroči CAKUT (101). Večina našega trenutnega znanja o patogenezi CAKUT je nastala na mišjih modelih in sindromskih oblikah CAKUT. Te študije so pripeljale do identifikacije več genov CAKUT, od katerih so številni vpleteni v zgodnji razvoj ledvic, vključno z PAX2, SALL1, HNF1B, EYA1, GATA3, RET, WNT4, GDNF, SIX1, SIX2 in drugimi (101, 104, 105). Vendar posamezne mutacije ali različice števila kopij v genih, ki kodirajo beljakovine, ne pojasnijo večine primerov CAKUT (~80 %) (101, 106).

Kot je navedeno zgoraj, izčrpavanje zrelih miRNA iz različnih celičnih linij razvijajoče se ledvice v mišjih modelih povzroči ledvične nenormalnosti, ki posnemajo človeški CAKUT (73, 74, 78, 79). Poleg tega delecije zarodne linije MIR17HG, ki kodira skupino miR-17~92, povzročajo Feingoldov sindrom tipa 2 pri ljudeh (107). Čeprav ledvični fenotip pri bolnikih s Feingoldovim sindromom tipa 2 z mutacijami MIR17HG ostaja nedefiniran, so poročali o 18-odstotni pojavnosti CAKUT v primerih Feingoldovega sindroma, povezanih z mutacijami MYCN (108, 109). Ta opažanja skupaj kažejo, da lahko mutacije v miRNA, izražene med razvojem ledvic, povzročijo CAKUT pri ljudeh, zlasti ker je veliko miRNA zelo ohranjenih med mišmi in ljudmi.

Da bi preizkusili to hipotezo, je ena študija preiskala 1248 bolnikov z nesindromskim CAKUT iz 980 družin in iskala mutacije v 96 regijah zanke stebla 73 genov miRNA za ledvični razvoj (106). V tej kohorti je bilo identificiranih 31 posameznikov s 17 različnimi različicami posameznega nukleotida, ki vplivajo na 16 različnih genov miRNA. Med temi je bilo ugotovljeno, da sta dve novi različici miRNA potencialno patogeni. MIR19B1 (član skupine miR-17~92) je bil povezan s prisotnostjo ageneze desne ledvice, MIR99A pa s hudim vezikoureteralnim refluksom in ptozo ledvic. To presenetljivo nizko število kandidatnih patogenih variant je deloma posledica omejitev te študije, saj je analiza upoštevala samo mutacije v genih miRNA, ki so bili vključeni v pristop kandidatnih genov, in ni zaznala variacij števila kopij in velikih preureditev DNA (106). .

Pri alternativnem pristopu so bili segmenti sečevodov pri bolnikih z različnimi CAKUT analizirani na izražanje diferencialnih transkriptov prek mikromrež, na prisotnost bioinformatično predvidenih tarč miRNA in zrele miRNA prek qPCR (110). Z uporabo tega večkrakega pristopa je bilo identificiranih sedem miRNA s potencialnimi vlogami pri CAKUT, med njimi pa je bil has-miR-144 znatno povečan pri bolnikih s CAKUT. Analiza genske ontologije je pokazala, da predvideni has-miR-144 ciljni geni prispevajo k biološkim procesom, vključenim v razvoj CAKUT, vključno z razvojem cevk (22 ciljnih genov), razvojem urogenitalnega sistema (18 ciljnih genov), razvojem ledvic (14 ciljnih genov) in razvoj embrionalnih organov (18 ciljnih genov) (110).

Potrebne so nadaljnje študije za opredelitev molekularnih mehanizmov, na katerih temeljijo patogene vloge miRNA v CAKUT. Ugotovitve takšnih študij bodo ključnega pomena pri izboljšanju oskrbe bolnikov s CAKUT in preprečevanju njihovega napredovanja v kronično ledvično bolezen, zagotavljanju ustreznega genetskega svetovanja za bolnike in njihove družine ter razvoju novih terapevtskih strategij.