MiR-214 Ameliorates Akutna poškodba ledvic, ki jo povzroči sepsa, preko PTEN/AKT/mTOR regulirana avtofagija
Feb 28, 2022
Abstrakten. Prejšnje študije so pokazale, da oksidativni stres in avtofagijapoškodba ledvic (AKI) med sepso in mikroRNA (miR)-214 ima ključno vlogo pri zaščitiLedviceoksidativni stres. Namen sedanje študije je bil preizkusiti, ali je renozaščita miR-214 povezana z avtofagijo pri sepsi. Vloga avtofagije je bila raziskana v mišjem modelu vezi in punkcije cekal (CLP). Za analizo izraza miR-214 so uporabili povratno trankripcijo-kvantitativno verižno reakcijo polimeraze (RT-qPCR). Struktura in funkcijaLedviceovrednoteni.Ledvicaz imunohistokemično, imunofluorescentno in zahodno napihnjenostjo. Ugotovili so, da lahko miR-214 ublaži AKI pri septi nih miših z zaviranjem ravniledvicaavtofagija. Poleg tega je miR-214 zavirala avtofagijo z utišanim izražanjem PTEN vledvicatkiv septičnih miši. Ti fifindingi so kazali, da je AKI, ki ga je miR-214 amelioral CLP, z zmanjšanjem oksidacijskega stresa in zaviranjem avtofagije z urejanjem poti PTEN/AKT/mTOR.
Ključne besede:mikroRNA-214, sepsa, akutna poškodba ledvic, avtofagija, ledvična
Uvod Akutnapoškodba ledvic(AKI) je eden najpogostejših zapletov sepse in se pojavi pri 40-50% septičnega bolnika, z umrljivostjo kar 60% (1). Vendar pa patogeneza AKI, ki jo povzroči sesa, ostaja nejasna. Poročali so, da avtofagija služi ključni vlogi pri AKI, ki jo povzroči sepsa, in zaviranju avtofagije pri razvoju AKI med sepso (2,3). Prejšnje študije (4,5) so potrdile, da sepsa sproži avtofagijo v več organih, vključno zledvica(6) in avtofagični procesi so vključeni v odstranjevanje poškodovanih mitohontrij in oksidativnega stresa (7). Vendar pa lahko prekomerna avtofagija povzroči neželeno in zbrisajoče celice smrt (8). Zato je zmerna stopnja avtofagije ključ za zmanjšanje AKI, ki ga povzroči sepsa. V prejšnjih študijah so poročali, da miR-214 ameliorates ischemia-reperfusion-induced AKI z zaviranjem apoptoze (9) in miR-214 zavira oksidativni stres pri diabetični nefropatiji preko reaktivne vrste kisika (ROS)/AKT/mTOR signalne poti (10). V sedanji študiji so ugotovili, da miR-214 z zaviranjem avtofagije (11) lahko zmanjša disfunkcijo miokarda, ki jo povzroči sepsa. Vendar pa, ali miR-214 lahko ameliorate AKI, ki jo povzroči sepsis, je treba razkuževanje. V sedanji študiji je bilo poudarjena hipoteza, da miR-214 zavira AKI, ki ga povzroči CLP, z zmanjšanjem oksidacijskega stresa in zaviranjem avtofagije z urejanjem poti PTEN/AKT/mTOR.
CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNO/LEDVIČNO BOLEZEN
Materiali in metode
Živali.V sedanji študiji so uporabili skupno 100 kunming moških miši (teža± 20,40±2,92 g; starost, 6-8 tednov), ki jih je dobavljal Zdravstveni laboratorijski živalski center Medicinske univerze Hebei (Shijiazhuang, Kitajska). Vse miši so bile aklimirane na 12-h svetlobni/temni cikel pri 24 °C s 50% vlažnostjo in so dobile prost dostop do hrane in vode ≥1 teden pred poskusi. Vsi poskusni postopki so bili izvedeni strogo v skladu s smernicami Nacionalnega inštituta za zdravje (publikacija NIH št. 85-23, revidirana 1996) in odobritvijo institucionalnih odborov za varstvo in uporabo živali Centralne bolnišnice Cangzhou (odobritev št. 2017-020-01). Vse operacije so bile izvedene pod anestezijo in vsak trud je bil narejen za zmanjšanje trpljenja.
Cecal ligacija in punkcija (CLP).CLP so izvedli na miših, da bi ustvarili model murine sepsis, kot je bilo prej opisano (12). Po anestezi z inhalacijo izoflurana (induciran pri 3 % in vzdrževati pri 0,5 %), je bil 1 cm srednji rez zmanjšan. Izpostavljeni cekum (1 cm oddaljenost od konca) je bil veziran z dvema vbodoma s 23-merilno iglo. Cecum je nežno iztisnjena majhna količina iztoka in je bila spet v anatomski položaj. Trebušna stena je bila zasičena v plasteh s svileno pletenico 3-0. Po postopku so subkutano injicirali 1 ml 0,9% raztopine. Miši so bile zagotovljene prost dostop samo do vode. Miši modela Sham so delovale enako kot model CLP brez CLP.
Eksperimentalna zasnova.Miši (n=6 za goljufijo in CLP) so bile naključno dodeljene sedmim skupinam: CLP skupina, adenovirus (Ad)-zeleni fluorescentni protein (GFP) + CLP skupina, Ad-miR-214 + CLP skupina, anti-miR-214 + CLP skupina, PTEN inhibitor + CLP skupina i Ad-miR-214 + PTEN inhibitor + CLP skupina. Miši skupine Sham so bile izpostavljene istemu postopku, vendar brez vezi in punkcije cecuma. Miši v drugih skupinah so prejele cekalno ligacijo in perforacijo. Vse miši so hitro anestestizirali z vdihavanju izoflurana za zbiranje krvi, urina inledvica24 h po zadnjem zdravljenju.
Ad-miR-214, anti-miR-214 ali Ad-GFP, posredovan z Adenovirusomin vivo in zaviralca PTEN. Ad-miR-214, anti-miR-214 ali Ad-GFP (Shanghai GenePharma Co, Ltd.) je bil dostavljen v trebušno votlino miši 4 dni pred CLP. Na kratko so miši anestestizirali z vdihavanju izoflurana. Kateter, ki vsebuje 200 μl adenovirusa (2x1011 pfu, izražen miR-214, anti-miR-214 ali Ad-GFP) so dajali normalnim mišem z intraperitonealno injekcijo. Zaviralec PTEN (VO-OHpic, intraperitoneal, Sigma-Aldrich; Merck KGaA) so dajali mišem CLP, ki so prejemale antimiR-214 z intraperitonealno injekcijo v enem odmerku 10 μg/kg 30 min pred dajanjem adenovirusa.
Ocena delovanja ledvic. Vzorci krvi so bili pridobljeni iz mišjega srca, sledila je centrifugacija (pri sobni temperaturi 15 min pri 3.000 x g) za zbiranje seruma. Vrednosti dušika sečnine v krvi (BUN) in kreatinina v serumu (Cr) so bile določene z avtomatskim analizatorjem Hitachi 7600 (Hitachi, Ltd.). ELISA so uporabili za analizo ravnipoškodba ledvicmolekula-1 (KIM-1; mačka. št. RKM100; R&R Sistemi,Inc.) in lipokalin, povezan z nevtrofilno želatino (NGAL; mačka. št. DY3508; R&R Sistemi, Inc.) vzorcih urina.
Preverite za serumsko vnetje citokina.Serum TNF-α (mačka. št. H052) in IL-6 (mačka št. H007) so bili pregledani z uporabo komercialnih kompletov ELISA (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) v skladu z navodili proizvajalca.Merjenje oksidativnih označevalcev stresa. Ustrezni komplet za testiranje (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kitajska) je bil uporabljen za merjenje ravni malondialdehida (MDA) in testiranje aktivnosti superoksidne dismutaze (SOD) v skladu z navodili proizvajalca.
Histologija in cevne poškodbe. Vse miši so bile izpostavljeneledvicaperfuzijo pod anestezijo 24 h po CLP. Vledvica4% paraformaldehida za 72 h pri 4 °C. Vzorci tkiva so bili nato dehidrirani v razredčeni seriji raztopin etanola, vgrajenih v parafin in cutinto 4-μm odsekov. Odseki (4 μm) so bili rezani z mikrotomom, dele tkiv pa so obmazali s hematoksilinom (5 min) in eozinom (1 min) pri sobni temperaturi za histološki pregled. Diapozitiv je bil ovrednoten in ocenjen z mikroskopom (BX51, Olympus Corporation).Ledvicpoškodbe tkiv z naslednjimi histopatološkimi spremembami: izguba obrobe čopiča, vakuolizacija, nastanek odlitka, cevna dilacija in motnje, celična liza in celična nekroza. Poškodba tkiva je bila preverjena zaslepljeno in zadeta za odstotek poškodovanih tubulov: 0, ni škode; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75 % (13).
Prenosna elektronska mikroskopija (TEM).SvežiLedviceso bili umiti v fosfatni buffered raztopino, in razrezati na 1 mm kocke in zaporedno pritrjena v 2,5% glutaraldehid za 24 h pri 4 °C. Odseki so bili za 2 h pri 4°C dehidrirani v 1% osmijevega tetroksida, dehidrirani v razvrščani etanol in vdelani v epoksiresin. Nazadnje so bili ultratinski odseki (60 nm) podvojeni z uranil acetat in svinčenim citratom pri 20 °C 60 min. Opazovanje je bilo opravljeno na prenosnem elektronski mikroskop (Tecnai; Hitachi, Ltd.) pri 80 kV z uporabo elektrskega mikroskopskega filma 4489 (debela baza ESTAR; Kodak).
imunohistokemijo (IHC).Svežiledvica4% paraformaldehida (za 72 h pri 4 °C) in vdelani v parafin. Primerki so bili razrezani na 4 μm debele dele in deparafinizirani v ksilenu. Po izpihovanju tkiv s PBS so jih 4 min za pridobivanje antigena v PBS v 10 mM citratnega puferja (pH 6.0) za pridobivanje antigena in nato blokirali z 10% serumom koze v PBS pri sobni temperaturi 1 h. Primarno protitelo (anti-LC3B; 1:400; mačka št. 4412; Tehnologija signaliziranja celic, Inc.) inkubiranje pri 4 °C za 12 h. Sekundarno protitelo (kozji antirabbit HRP; 1:2.000; mačka. št. BS13278; Bioworld Technology, Inc.) je bila dodana in inkubatorna pri sobni temperaturi 10 min. DAB (100 μl) je bil dodan in se je 5 min uperil z madežem, opaženim pod svetlobnim mikroskopom (model CX31-P; Olympus Corporation). Intenzivnost pozitivnega maženja, ki se je zdel rjava, je bila določena z uporabo image-Pro Plus 6.0 programske opreme za analizo slike (Media Cybernetics, Inc.). Integralna optična gostota (IOD) je bila izračunana tako, da predstavlja intenzivnost. Vrednosti IOD so se povečale, ko se je zvišal izraz beljakovin.
Povratni prepis-kvantitativen(RT-q) PCR. Skupaj RNK je bil izvleček izledvično tkivopo indukciji modela z reagentom TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Po navodilih kompleta za reverzibilni prepis TaqMan (mačka. št. N8080234; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), RNA je bila reverzibilna transcribed v cDNA. Uporabljeni so bili naslednji termocikliranje (miR-214): začetna denaturacija pri 95 °C 5 min; sledi 40 ciklov denaturacije pri 95 °C za 30 sekund, Anealing at 60°C for 30 sec and elongation at 72°C for 30 sec. RT-qPCR was performed using a ABI Prism 7500 Sequence Detection System (PerkinElmer, Inc.) and a standard SYBR Green PCR kit (Toyobo Life Science). U6 je bil uporabljen kot notranji nadzor za MIR-214. Zaporedja primera so bila naslednja: miR-214, naprej, 5'-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3" in obratno, 5'-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCAC-3"; U6, naprej, 5'-ATTGGAACGATACAGAGAGAGAGATT-3' in obratno, 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'. Ti izkustveni ukrepi so bili replicirani šestkrat. Rezultati so bili analizirani z metodo 2-ΔΔCq (14). Vrednosti mRNA izrazov LC3, p62, PTEN, AKT in mTOR so bile ovrednotene prek RT-qPCR. Z β-aktinom kot notranjim sklicevanjem teh genov je bil 2-ΔCq uporabljen za merjenje relativnega izražanja ciljnih genov. Zaporedja primera, prikazana v tabeli I, je sintetiziziral Sangon Biotech Co., Ltd.
Zahodno napihnjenost. Ledvicazdravilo RIPA lisat (Beyotime Institute of Biotechnology), da bi homogenat in lizo ustavili, ko niso opazili vidnega tkivo. Vzorci so bili centrifugirana na 13.000 x g 10 min pri -4°C, supernatant pa so našli za analizo zahodnega blota. Na kratko, koncentracije beljakovin so bile določene z mikro BCA kompletom za analizo beljakovin (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Vzorci beljakovin (80 μg na vzorec) so bili ločeni z zmanjšanjem 12% natrijevega dodecil sulfata-poliakrilamidegalove elektroforeze in nato prenešeni na polivinilidene difluoridne membrane pri 4 °C čez noč. Ločeni proteini so bili preneseni na membrane PVDF. Po zaviranju 5% posnetega mleka pri sobni temperaturi 2 h so bile membrane inkubatorne čez noč (pri 4 °C) s primarnimi protitelesi. Uporabljena so bila naslednja primarna protitelesa (vsa tehnologija signaliziranja celic, Inc.) : Lahka veriga 3B (1:1.000; cat. no. 4412), p62 (1:1,000; cat. no. 4412), Anti-PTEN (1:1.000; cat. no. 9188), anti-fosforiled (p)-AKT (Ser473) (1:1.000; cat. no. 4060), anti-AKT (1:1.000; cat. no. 9272), anti-p-mTOR (Ser 2448) (1:1.000; cat. no. 5536), anti-mTOR (1:1.000; cat. no. 2972) i β-actin (1:2.000; cat. no. 4970). Po pomivanju so membrane inkubirajo (pri sobni temperaturi 2 h) s hrp konjugirajočimi protitelesi proti kuncem (1:3.000; mačka. št. A0208; Beyotime Institute of Biotechnology). Proteinski pasovi so bili odkriti z Immobilon Western (MilliporeSigma) in analizirani z uporabo Total-Lab TL120 soft- ware (Nonlinear Dynamics, 2.01). Izraz beljakovin se je normaliziral na β-aktin.
Statistična analiza. Statistična analiza je bila izvedena z uporabo GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc.). Vsi podatki so bili predstavljeni kot ± standardnih odstopanj ali medianov (medkvartilnih razponov) za neprekinjene spremenljivke, odvisno od njihove porazdelitve. Izhodiščne značilnosti in rezultati so bili primerjani z enos smerjo ANOVA, ki ji je sledil Tukeyjev posthočni test ali Kruskal-Wallisov test, ki mu je po potrebi sledil Dunnov test. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Rezultati
Časovna točka 24 h po CLP. V prejšnjih študijah so poročali (6,15,16), da biokemična (torej analiza LC3 in p62) razkriva, da se avtofagični tok zavira s napredovanjem sepse po 6-8 h CLP. V sedanji študiji je bilo število avtolisosomov vledvicamiši, zdravljenih s CLP, so se povečale v 24 h po operaciji. Poleg tega je analiza označevalcevpoškodba ledvicje pokazala, da jedelovanje ledvichudo poškodovana 24 h po CLP. Zato se je za naslednje poskuse izbrala časovna točka 24 h po CLP.
Regulativni učinek na miR-214 v ledvičnih tkivih. Rt-qPCR analiza je bila uporabljena za odkrivanje miR-214 izražanja pri miših, obdelanih s CLP. Ugotovilo je, da je bil izraz MIR-214 nekoliko upreguliran vledvicatkiv po operaciji CLP 24 h, v primerjavi s skupino s prevarami (1,47-kratna, P<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">ledvicatkivo, v primerjavi s skupino sham (oba P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).
CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNO/LEDVIČNO ODPOVED
Učinek miR-214 na ledvično disfunkcijo pri septi nih miših.Vse miši so bile žrtvoval za zbiranje krvi, urina inledvicavzorcih 24 h po operaciji CLP. BUN in Cr sta pomembna kazalnika resnostiLedvic(17). Poleg tega sta bila NGAL in KIM-1 opredeljena kot posebna biomarkerjipoškodba ledvicin njihovo povečano izražanje je povezano z zgodnjimiLedviccevne poškodbe pri AKI (17). Kot je prikazano na slikah 2A-D, so se ravni BUN, Cr, KIM-1 in NGAL po operaciji CLP v primerjavi s skupino s shamom znatno povečale. Ad-miR-214 pa se je v primerjavi s skupino CLP znatno zmanjšala ravni BUN, Cr, KIM-1 in NGAL (vsi P<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">delovanje ledvicParametrov. Vendar so bili po predzdravljaju z zaviralnikom PTEN okrepljeni zaščitni učinki zdravila Ad-miR-214. Rezultati kažejo, da miR-214 zmanjša motnje delovanja ledvic pri septičnih miših.
Učinek miR-214 na vnetje ledvic in oksidativni stres.Kot je prikazano na slikah 3A in B, je CLP znatno zvišal ravni TNF-α in IL-6, ad-miR-214 pa se je znatno zmanjšala raven teh označevalcev. V primerjavi z
Učinek miR-214 na ledvično avtofagijo pri septi nih miših.V sedanji študiji so bile preuledvicatkiv prek IHC-ovega barvanja. Kot je prikazano na slikah 6, se je intenzivnost pozitivnih madežov LC3 v skupini CLP v primerjavi s skupino s shamom znatno povečala (P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">
miR-214 aktivira pot AKT/mTOR za zaviranjeavtofagija z utišajo PTEN v ledvičnih tkivih.Učinek CLP na avtofagijo priledvicaraziskali z oceno ravni LC3-II/I in p62. Signalna pot PTEN/AKT/mTOR ima pomembno vlogo pri avtofagijah (18). Za preiskavo učinka miR-214 na pot PTEN-AKT/mTOR so analizirali ravni beljakovin LC3-II/I, p62, AKT, p-AKT, mTOR, p-mTOR in PTEN prek zahodnega blottinga in RT-qPCR anal- ysis. Kot je prikazano na slikah 7A-C, hitro pride do spremembe teh beljakovin s povečanjem stopnje LC3-II/LC3-I in zmanjšanjem ravni p62 (oba P<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">ledvicatkiv (tako P>0,05). Dva kazalnika LC3-II/LC3-I in p62 med skupino Ad-miR-214, skupino zaviralcev PTEN in zaviralcem Ad-miR-214 + PTEN (vsi P>0,05). Ti rezultati so pokazali, da je bila avtofagija inducirana s CLP, in overexpression miR-214 lahko delno zavira.
Kot je prikazano na slikah 7A in D-F, je raven izraza PTEN (P<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">ledvica(vse P>0,05). Med skupino Ad-miR-214, skupino zaviralcev PTEN in zaviralcem Ad-miR-214 + PTEN (vse P>0,05) ni bilo razlike v zgornjih kazalnikih. Te ugotovitve kažejo, da CLPledvicaavtofagijo tkiv z zaviranjem poti AKT/mTOR. Ad-miR-214 je aktiviral pot AKT/mTOR z utišanjem PTEN vledvicaTkiva. V primerjavi s skupino CLP pa anti-miR-214 ni bistveno zaviral izražanja mTOR. Zato so rt-qPCR še dodatno uporabili za določitev izražanja mRNA genov, povezanih s signalno potjo PTEN/AKT/mTOR. Glede na rezultate rt-qPCR (sl. 8) so se v primerjavi s skupino Sham znatno povečale vrednosti izrazov mRNA p62, LC3 in PTEN, medtem ko se je mRNA izraz AKT in mTOR v skupini CLP zmanjšal. V primerjavi s skupino CLP je ad-miR-214, PTEN
zaviralca in ad-miR-214 + PTEN inhibitorske skupine so prikazale zmanjšano mRNA izražanje LC3 in PTEN, vendar povečano mRNA izražanje p62, AKT in mTOR (vse P<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0.05). Tako se lahko učinek p62 na avtofagijo pojavi na trankripcijskem nivoju in ne na potrankripcijskem nivoju. Trenutni rezultati so pokazali, da je miR-214 downreg- ulated izraz PTEN in aktiviral SIGNALNO POT AKT/mTOR.
Razpravo
V sedanji študiji so ugotovili, da je prekomerna avtofagija škodljiva zadelovanje ledvicpri septi nih miših. Prejšnje študije so pokazale, da je miR-214 povezan s povečano proliferacijo, metastazo, invazijo in delovanjem kot onkogen za celice in tkiva (19-22). Študije poročajo, da miR-214 služi zaščitnorolo proti AKI prek olajšujočo apoptozo, oksidativni stres in zmanjšanje vnetnih dejavnikov (21,23). V sedanji študiji so dodatno preučili mehanizme, ki so bili v skladu z zaščitnim učinkom miR-214 na AKI, ki ga je povedla sepsa, s poudarkom na potencialni vključenosti miR-214 v modulacijo avtofagije. Rezultati so pokazali, da se je oksidativni stres pojavil vledvicapo dajanju operacije CLP. Medtem se aktiviranje avtofagije pojavi vledvica.Zvišan LC3 II/I in zmanjšanje p62 vledvicaso opazili po zdravljenju z operacijo CLP. Kot je bilo pričakovano, se je čezmerni odtis miR-214 bistvenoledvicapatološke poškodbe inledvicadisfunkcijo, ki jo povzroča sepza. Zaviranje miR-214 pa je prikazovalo nasprotno nagnjenje k renoproteciji. Poleg tega je zaviralec PTEN okrepil zaščitni učinek ad-miR-214.
V septičniledvica, prekomerno vnetje spremlja množično povečanje proizvodnje ROS in veliko število ROS sproži spremembe mitohondrialne strukture in ovira mitohontrijsko funkcijo, zaradi česar telo vstopi v zacio krog, ki poslabšaledvica(24,25). Zato je lahko oksidativni stres eden glavnih patoloških mehanizmov AKI, ki ga povzroči sesa. V tej študiji so bili predstavljeni dodatni dokazi, ki dokazujejo čezmerni oksidativni stres, kar je kazalo s povečano proizvodnjo MDA in zmanjšano aktivnostjo SOD vledvicatkiv po operaciji CLP. Poleg tega je bilo odkrilo, da bi lahko čezmerni odtis miR-214 zaščitilledvicaoksidativno poškodbo, ki jo povzroči CLP, ki je vključena v avtofagično inhibicijo. To je skladno s prejšnjimi študijami, da miR-214 ščiti različne celice in tkiv pred oksidativnim stresom (26,27).
Avtofagija služi kot "dvorezni meč" pri razvoju sepse: Bazalna avtofagija lahko povzroči zaščitne učinke z odstranjevanjem strupenih oksidativnih beljakovin, vendar lahko prekomerna avtofagija privede do avtofagične celične smrti pod hudim stresom, kot je izbruh ROS (28,29). Izkazalo se je, da se avtofagija sprva aktivira v sepsi, nato pa sledi naslednja faza disfunkcije zaradi avtofagične smrti celic (30), ki oteži oksidativno poškodbo, ki jo povzroči sepsa. V sedanji študiji je zaviralec PTEN ali overexpression miR-214 prikazal antioksidativno renoprotekcijo pri miših, zdravljenih s CLP. Zaviranje miR-214 pa je prikazovalo nasprotno nagnjenost k antioksidativni renoprotekciji. Tako prekomerna ali neustrezna avtofagija lahko povzročipoškodbe ledvic; in sčasoma izzovejo celično smrt. Zato je ohraniti zmerno raven avtofagije ključ za oteževanje oksidativnih poškodb v septičnem stanju.
CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNO/LEDVIČNO BOLEČINO
Kopičenje dokazov kaže, da miR-214 zavira avtofagijo v različnih celicah in tkivih (31-33). V sedanji študiji so ugotovili, da je bila pri overekspresiji miR-214 inhibicijo avtofagije, ki jo jeledvično tkivo,kot je navedeno s spremembami proteinskih označevalcev, kot sta LC3-II/I in p62. Poleg tega so rezultati pokazali, da je prekomerna ekspresija miR-214 s prekomerno avtofagijo ublažila oksidacijo, ki jo je povzročila CLP. V sedanji študiji so preučili tudi molekularne mehanizme, s katerimi miR-214 moduliraledvicaavtofagija pri AKI, ki je bila poudarjena z sepso. PTEN/AKT/mTOR je pomembna signalna pot, ki uravnavaledvicaavtofagija (34,35) in ki služi keyrole v AKI, ki jo povzroči sepsa, in PTEN je negativen zaviralec signalne poti PI3K/AKT/mTOR. V prejšnjih študijah so poročali, da lahko miR-214 regulira avtofagijo prek signalne poti PI3K/AKT/mTOR v različnih modelih (36-38). Ma et al (39) je ugotovilo, da miR-214 lahko navzdol- regulira avtofagijo pri diabetičnih ledvicah. Zato je bilo predpostavka, da bi lahko učinki miR-214 na AKI, ki ga je pognala CLP, vključeni v ureditev poti PTEN/AKT/mTOR. Predvsem so rezultati sedanje študije pokazali, da je operacija CLP znatno zvišala ravni PTEN, vendar je zmanjšala ravni p-AKT in p-mTOR, kar kaže, da je operacija CLP aktivirala pot AKT/mTOR. Poleg tega je čezmerni odtis miR-214 aktiviral pot AKT/mTOR z utišanjem PTEN v avtofagijo, ki jo jeledvicaTkiva. Vendar pa anti-miR-214 ni bistveno zaviral izražanja mTOR v zahodnih analizah blot. Tako so rt-qPCR še dodatno uporabili za določanje izražanja mRNA genov, povezanih s signalno potjo PTEN/AKT/mTOR. V sedanji študiji je bilo ugotovljeno, da je miR-214 zniževal izraz PTEN in aktiviral signalno pot AKT/mTOR za zaviranje avtofagije. Vendar pa je treba izvesti dodatne izčrpne študije za pridobitev dodatnih podrobnosti, povezanih z mehanizmomledvicaavtofagija v septi kem stanju.
Za zaključek, rezultati sedanje študije kažejo, da je miR-214 služila zaščitni vlogi pred seso, ki jo jepoškodba ledvicz zmanjšanjem oksidacijskega stresa in zaviranjem avtofagije z urejanjem poti PTEN/AKT/mTOR. Sedanji fifindingi kažejo, da je lahko miR-214 potencialni terapevtski cilj za AKI, ki ga povzroči sesa. Vendar so v sedanji študiji miši stare od 6 do 8 te dni, zato so pri odraslih miših potrebna dodatna raziskovanja mehanizma miR-214.