Stabilizacija mitohondrijske membrane s polisaharidom Angelica Sinensis pri mišji aplastični anemiji

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Povzetek

Da bi raziskali mehanizem stabilizacije mitohondrijske membrane s polisaharidom Angelica Sinensis (ASP) pri mišji aplastični anemiji (AA), so miši ICR naključno razdelili na kontrolne. Skupini, zdravljeni z AA in ASP. Miši iz skupine AA smo zdravili s 60Co Y in intraperitonealnimi injekcijami ciklofosfamida in kloramfenikola. Kontrolne živali so bile zdravljene z obsevanjem s svinčeno zaščito in injiciranjem fiziološke raztopine. Zdravljene AA miši smo hranili z ASP 2 tedna. Mitohondrijsko ultrastrukturo kostnega mozga smo opazovali s transmisijsko elektronsko mikroskopijo, transmembranski potencial celic z jedrom kostnega mozga (BMNC) pa smo pregledali s fluorescenčno spektrofotometrijo. V treh skupinah so preučevali tudi vsebnosti Cox in MDH v mediju. Mitohondrijsko število in transmembranski potencial BMNC v kostnem mozgu sta se zmanjšala v skupini AA v primerjavi s kontrolno skupino, vendar sta se izboljšala v skupini, zdravljeni z ASP, v primerjavi z skupina AA. Popolna mitohondrijska cepitev v skupini, zdravljeni z ASP, je bila znatno zakasnjena (P< 0.05)="" as="" compared="" to="" the="" aa="" group.="" we="" conclude="" that="" asp="" might="" improve="" mitochondrial="" membrane="" stabilization,="" and="" suppress="" the="" downregulation="" of="" transmembrane="" potential="" and="" apoptosis="" of="" bmnc="" in="">

Ključne besede: aplastična anemija, polisaharid Angelica Sinensis, mitohondriji, membranski potencial, miši ICR

izvleček cistanche: spodbuja tvorbo kosti in povečuje gostoto kosti

Ozadje

Aplastična anemija (AA) je krvna motnja, pri kateri so poškodovani kostni mozeg in povezane matične celice krvi, kar povzroči pomanjkanje rdečih krvnih celic, belih krvnih celic in trombocitov. Te pomanjkljivosti so posamezno znane kot anemija, levkopenija oziroma trombocitopenija, skupaj pa so znane kot pancitopenija. Izpostavljenost kemikalijam, zdravilom, sevanju, radioaktivnim materialom, napravam, ki proizvajajo sevanje, okužbi. imunska bolezen, dednost (v 50 odstotkih primerov) in neznana etiologija lahko vodijo tudi do razvoja AA.

Mitohondriji veljajo za "elektrarne celice", ker proizvajajo adenozin trifosfat (ATP) s sistematičnim črpanjem energije iz hranilnih molekul (substratov) [1]. Poleg tega se mtDNA replicira z visoko stopnjo mutacije, saj nima zaščitnih histonov in učinkovitega sistema popravljanja DNA. Mutacije v mtDNA so povezane s hematološkimi boleznimi, kot so pridobljena sideroblastna anemija, mielodisplastični sindromi in pridobljena AA [2-4]. Naša prejšnja študija 5] je pokazala, da je lahko funkcionalna okvara mitohondrijske dihalne verige, ki jo povzročajo mutacije, vpletena v hematopoetsko odpoved pri bolnikih z AA. Ne glede na morfološke značilnosti končne celične smrti (apoptotična, nekrotična, avtofagna ali mitotična) je permeabilizacija mitohondrijske membrane (MMP) pogosto odločilni dogodek med preživetjem in smrtjo [6]

Po tradicionalni kitajski medicini Angelica Sinensis pomaga pri poenotenju krvi in ​​spodbujanju njenega kroženja [7]. Nedavne študije so pokazale, da imajo izvlečki Angelice Sinensis antioksidativne in nevroprotektivne učinke [8,9]. Vendar ostaja antioksidativna funkcija ASP nejasna. Ta študija je preučevala zgodnje poškodbe celic z uporabo časovne krivulje mitohondrijske lize in stabilizacijskega učinka ASP na mitohondrijsko membrano pri AA.

dodatek cistanche poveča kostno gostoto in pospeši tvorbo kosti

Materiali in metode

Združevanje živali

Zdrave mišje samce ICR, težke 18-22 g, stare 6-8 tednov, je zagotovil Experimental Animal Center univerze Shandong (Kitajska). Živali so bile nameščene v toplem, tihem okolju s prostim dostopom do hrane in vode. in aklimatizirani en teden pred začetkom poskusov.

Miši so bile naključno razdeljene v tri skupine: normalno skupino, AA skupino in zdravljeno skupino. Model aplastične anemije je bil ustvarjen, kot je opisano prej [10].

Na kratko, miši so bile obsevane z 2.0Gy 60Coy in nato zdravljene z dnevnimi intraperitonealnimi injekcijami 40 mg/kg/dan ciklofosfamida in 50 mg/kg/dan kloramfenikola naslednje tri dni. Zdravljena skupina je bila intragastrično hranjena z ASP (200 mg/kg/dan, v skladu s kitajskim medicinskim slovarjem). Kontrolna skupina in miši skupine AA so bile intragastrično hranjene s fiziološko fiziološko raztopino (10 ml/kg/d), dopolnjeno z dieto. Poleg tega so vse miši med študijo prejele standardno prehrano. Po zdravljenju z ASP ali fiziološko raztopino 2 tedna so miši žrtvovali z izpahom materničnega vratu.

Hematološki pregled

Vzorci krvi repa iz treh skupin so bili zbrani prvi oziroma štirinajsti dan. V vzorcih periferne krvi so prešteli WBC in trombocite ter določili raven Hb. Po zaključku poskusov so miši žrtvovali in pripravili razmaze stegnenice za diferencialno štetje jedrnih celic kostnega mozga (BMNC) (slika 1).

Transmisijska elektronska mikroskopija

Femoralni mozeg je bil razmazan in narezan na ultratanke dele. Mitohondrije hematopoetskih celic v femoralnem mozgu so analizirali in prešteli s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (JEM-2000EX, Japonska) pod 50 vidnimi polji.

Časovna krivulja mitohondrijske lize

Mitohondrije so ekstrahirali iz mišjih BMNC v skladu s protokolom proizvajalca kompleta za izolacijo mitohondrijev (Pierce Biotechnology Inc., ZDA). Koncentracija monoaminooksidaze (MAO) kaže koncentracijo mitohondrijev in je bila določena z uporabo 200U/ml mitohondrijskih suspenzij iz 20 serumskih kultur, v 12 urah v različnih časovnih točkah (intervali 30 min). V gojišču smo določili tudi vsebnosti citokrom oksidaze (Cox) in malat dehidrogenaze (MDH). Analiza časa vrha mitohondrijske membrane in krivulje koncentracija-čas specifičnih encimov za matriks so pokazale obseg lize mitohondrijske membrane.

Potencial mitohondrijske membrane

Po predinkubaciji z MAO ali ASP smo izolirane mitohondrije iz treh skupin resuspendirali v 0.5 ml fiziološke raztopine s fosfatnim pufrom (Wuhan Boster Biotechnology, Ltd., Kitajska) in 10 ul delovne raztopine rodamina 123 ( Sigma-Aldrich, ZDA) smo dodali in 15 minut inkubirali pri 37 stopinjah C v 5 odstotkih CO2. Potencial mitohondrijske membrane smo analizirali s pretočno citometrijo z uporabo valovne dolžine vzbujanja 490 nm in valovne dolžine emisije 520 nm.

Statistična analiza

Statistična analiza je bila izvedena s programsko opremo SPSS 19.0. Podatki so izraženi kot srednje vrednosti in standardni odkloni. Za primerjavo različnih skupin je bil uporabljen študentov t-test. P < 0.05="" je="" veljalo="" za="" statistično="">

zelišče cistanche: za boljšo kakovost kosti

Rezultati

Število periferne krvi in ​​BMC

Z uporabo popolnoma avtomatskega analizatorja krvnih celic je bilo ugotovljeno, da se je število perifernih krvnih celic in BMC pri miših AA opazno zmanjšalo (P<0.05), indicating="" that="" the="" aa="" mouse="" model="" was="" successfully="" established="" (table="">

Mitohondrijska ultrastruktura pri miših z aplastično anemijo

Transmisijska elektronska mikroskopija kostnega mozga miši AA je pokazala, da se je mitohondrijska ultrastruktura znatno izboljšala z ASP v zdravljeni skupini (tabela 2 in slika 1), kar kaže, da ASP stabilizira mitohondrije pri miših AA. Velikost in oblika mitohondrijev kontrolne skupine sta bili normalni. V nasprotju. mitohondriji skupine AA so imeli povečane globularne strukture, skupaj z motnjami ali izginotjem krist (slika 1A-C).

Potencial mitohondrijske membrane (MMP) pri miših z aplastično anemijo

Ker je transmisijska elektronska mikroskopija razkrila mitohondrijsko poškodbo, smo določili učinek ASP na MMP pri miših AA z merjenjem relativnih razlik v fluorescenci Rh 123 med tremi skupinami z uporabo fluorescenčnega spektrofotometra.

Rezultati so pokazali, da je bila fluorescenca Rh 123 celic kostnega mozga v skupini AA (19,6±3,03) nižja kot v kontrolni skupini (31,7±2,59, P<0.0). however,="" the="" rh="" 123="" fluorescence="" of="" the="" asp-treated="" aa="" group="" was="" higher="" than="" that="" in="" the="" aa="" group=""><0.0i)(table 2="" and="" figure="" 2),="" indicating="" that="" asp="" facilitated="" the="" recovery="" of="" the="" mmp="" in="" aa="">

Krivulja mitohondrijske lize zgodnje celične poškodbe

V kontrolni skupini je vsebnost mitohondrijske in vitro kulture Cox in MDH trajala 3,5 ure, da je dosegla vrh. Vsebnost MAO v kulturi se s časom ni bistveno spremenila, vsebnosti COX in MDH pa sta se s časom postopoma povečevala, dosegla vrh in nato postopoma upadala. Tako je celotna mitohondrijska vsebina, ki so jo sprostile celice, potrebovala približno 3,5 ure, da je dosegla vrh cepitve.

Najvišja vrednost COX in MDH v skupini z AA sta se pojavila po 1,5 ure, 1,375 U/, oziroma 36,732 U/l. Najvišje vrednosti COX in MDH v zdravljeni skupini so se pojavile pri 5,5 ure, 6,5 ure, 1,341U/l, 33,994U/. Za statistično analizo sta bila uporabljena dva niza podatkov v vsaki časovni točki. Po 1,5 urah sta bili ravni COX in MDH v skupini z AA znatno višji kot v zdravljeni skupini (P < 0.05).="" zato="" je="" bila="" popolna="" mitohondrijska="" cepitev="" v="" serumu="" po="" dodatku="" asp="" znatno="" zakasnjena="" (p=""><0,05), z="" rahlim="" zmanjšanjem="" vrha="" (slika="">

Diskusija

Aplastična anemija (AA) je sindrom odpovedi kostnega mozga, za katerega sta značilni periferna pancitopenija in hipoplazija kostnega mozga. Mutacije in nestabilnost mtDNA so bile dokazane pri več boleznih. Mitohondrijska disfunkcija in zmanjšanje števila mitohondrijev lahko povzročita zmanjšanje mtDNA. Ugotovljeno je bilo, da se pridobljene delecije mtDNA v hematopoetskem predelu pojavijo pri hudi pancitopeniji in retikulocitopeniji [11]. Na podlagi naših prejšnjih raziskav [5] smo preverili, ali lahko ASP stabilizira mitohondrijsko membrano miši AA.

Kompleks polisaharidov in železa Angelice Sinensis (APIC) nima samo odličnega terapevtskega učinka na IDA, temveč tudi na dopolnjevanje krvi in ​​spodbujanje krvnega obtoka [12]. ASP je lahko koristen za zdravljenje bolezni, ki jih povzroča prekomerna ekspresija hepcidina, tako da prepreči Janus-kinazo (JAK), sin mater proti zunajcelični dekapentaplegični (SMAD) in poti 1 signalno regulirane kinaze (ERK) za znižanje ekspresije hepcidina pri podganah IDA [13]. ]. Qin J je ugotovil, da lahko ASP izboljša sintezo proteoglikanov (PG) v hondrocitih v podganjem modelu OA in vivo in hondrocitih, stimuliranih z IL-1B in vitro, s spodbujanjem ekspresije agrekana in GT, vključenih v sintezo PG [14].

V naši študiji je bil model miši AA induciran s kombinacijo acetil fenilhidrazina, rentgenskih žarkov in ciklofosfamida. Miši AA so pokazale statistično značilno zmanjšanje levkocitov v periferni krvi, Hb in trombocitov (tabela 1) ter močno zmanjšanje celic humeralnega kostnega mozga in progenitornih celic, povezanih s kostnim mozgom, kar so klinične značilnosti AA. Miši AA, zdravljene z ASP, so pokazale postopno povečanje celic BM v primerjavi s skupino AA. Poleg tega je bilo prizadeto tudi število mitohondrijev v hematopoetskih celicah. ASP je povzročil znatno večje število mitohondrijev v zdravljeni skupini v primerjavi s skupino AA (slika 1). Ti rezultati so pokazali, da lahko ASP spodbuja proliferacijo celic z jedrom kostnega mozga, poveča število mitohondrijev in stabilizira mitohondrijsko membrano pri miših AA.

Poškodba mitohondrijev se odraža s poškodbo mtDNA in upadom ravni transkriptov mtRNA, sinteze beljakovin in delovanja mitohondrijev, kar lahko povzroči zmanjšano celično energijo, motnjo celične signalizacije in motnje v celični diferenciaciji in apoptozi. Poleg tega lahko pomanjkljiva mitohondrijska proizvodnja ATP spodbuja kromosomsko nestabilnost [15]. Ker mtDNA kodira komponente štirih od petih mitohondrijskih respiratornih kompleksov, spremembe v mtDNA povzročijo mitohondrijsko bolezen [16-18]. Poleg mitohondrijske bolezni so mutacije v mtDNA povezane z rakom, sladkorno boleznijo. bolezni srca in ožilja. nevrodegenerativne motnje, hematološke bolezni, kot je levkemija, kot tudi normalni proces staranja [19]. Pomembno je, da so lahko mutacije mtDNA, pa tudi zmanjšanje števila kopij mtDNA, patogene [20, 21]. Razumevanje celičnih mehanizmov za vzdrževanje celovitosti mtDNA in števila kopij je izrednega pomena, saj lahko zagotovi cilje za klinične posege, namenjene preprečevanju in zdravljenju hematoloških bolezni, kot je AA. Ti dejavniki lahko povzročijo tudi zmanjšano energijsko presnovo, kar bo vplivalo na samoobnavljanje in diferenciacijo hematopoetskih matičnih celic.

Ugotovitve te študije kažejo, da lahko ASP izboljša mitohondrijsko ultrastrukturo in zavre znižanje transmembranskega potenciala in apoptozo mieloidnih elementov za zdravljenje odpovedi kostnega mozga.

Cistanche in izvleček cistanche: bebefit kosti

Reference

1 Chinnery PF, Schon EA. Mitohondrije. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2003, 74: 1188-1199.

2. Gattermann N. Mutacije mitohondrijske DNA v hematopoetskem sistemu. Leukemia 2004,18:18-22.

3. Gattermann N, Retzlaff S, Wang YL, et al. Heteroplazemske točkovne mutacije mitohondrijske DNA, ki vplivajo na podenoto I citokrom c-oksidaze pri dveh bolnikih s pridobljeno idiopatsko sideroblastno anemijo. Blood 1997,90:4961-4972.

Kim HR, Shin MG, Kim MJ, et al. mitohondrijski

4. Aberacije DNK celic kostnega mozga bolnikov z aplastično anemijo. Korean Med Sci 2008, 23:1062-1067. X Cui, JO Wang, ZG Cai, et al. Popolno zaporedje

5. analiza mitohondrijske DNK in dolžine telomer pri aplastični anemiji.Int J Mol Med 2014.34:1309-1314.

6. Chiu TL, Su CC. Tanshinone IA inducira apoptozo v celicah človeškega pljučnega raka A549 z indukcijo reaktivnih kisikovih vrst in zmanjšanjem potenciala mitohondrijske membrane. Int J Mol Med 2010, 25: 231-236.

7. Liu PJ. Hsieh WT. Huang SH, et al. Hematopoetski učinek vodotopnih polisaharidov iz Angelice Sinensis na miši z akutno izgubo krvi. Exp Hematol 2010, 38: 437-445.

8. Kuang X, Yao Y, Du JR, et al. Nevroprotektivna vloga 8F Z-ligustilida proti ishemični poškodbi prednjih možganov pri miših ICR. Brain Res 2006,1102:145-153.

9. Xin J. Zhang J. Yang Y, et al. Radi Angelica Sinensis, ki vsebuje komponento Z-ligustilid, spodbuja nevrogenezo pri odraslih, da posreduje pri okrevanju po kognitivni motnji Curr Neurovasc Res 203, 10: 304-315.

10. Chen YF, Wu ZM, Xie C, et al. Raven izražanja IL-6, ki ga izločajo stromalne celice kostnega mozga pri miših z aplastično anemijo.ISRN Hematol 2013:986219.

11. Hatfill SJ, LaCock CJ, Laubscher R, et al. Arole za mitohondrijsko DNK v patogenezi z obsevanjem povzročene mielodisplazije in sekundarne levkemije.Leuk Res 1993,17:907-913.

12. Wang PP, Zhang Y, Dai LQ, et al. Učinek polisaharid-železovega kompleksa Angelica Sinensis na anemijo zaradi pomanjkanja železa pri podganah. Chin J Integr Med 2007, 13: 297-300.

13. Zhang Y, Cheng Y, Wang N, et al. Delovanje signalnih poti JAK, SMAD in ERK na supresijo hepcidina s polisaharidi iz Angelice Sinensis pri podganah z anemijo zaradi pomanjkanja železa. Food Funct2014.5: 1381-1388.

14. Qin J, Liu YS, Liu J, et al. Vpliv polisaharidov Angelice Sinensis na osteoartritis in vivo in in vitro: možen mehanizem za spodbujanje sinteze proteoglikanov. Dokazno dopolnilo Alternat Med 2013,79476.

15. Gattermann N. Mutacije mitohondrijske DNK v hematopoetskem sistemu. Leukemia 2004,18:18-22.

16. Holt IJ, Harding AE, Morgan-Hughes JA. Delecije mišične mitohondrijske DNA pri bolnikih z mitohondrijsko miopatijo. Nature 1988, 331:717-719.

17. Lestienne P, Ponsot G Kearns-Sayrov sindrom z izbrisom mišične mitohondrijske DNA. Lancet 1988, 1:885.

18. Wallace DC, Singh G, Lott MT, et al. Mutacija mitohondrijske DNK, povezana z Leberjevo dedno optično nevropatijo.Science 1988,242:1427-1430.

19. Wallace DC. Mitohondrijska paradigma presnovnih in degenerativnih bolezni, staranja in raka: zora za evolucijsko medicino. Annu Rev Genet 2005, 39: 359-407.

20. Clay Montier LL, Deng JJ, Bai Y. Število je pomembno: nadzor števila kopij mitohondrijske DNA sesalcev. J Genet Genomics 2009,36:125-131.

21. Rötig A, Poulton J. Genetski vzroki za izčrpavanje mitohondrijske DNK pri ljudeh. Biochim Biophys Acta 2009,1792:1103-1108.

izvleček cistanche: pospešuje tvorbo kosti in povečuje gostoto kosti