Mortalin/glukozno regulirani protein 75 spodbuja odpornost želodčnega raka na cisplatin

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

Povzetek

Zdravljenje s platinastimi zdravili je ena najbolj prevladujočih kemoterapevtskih strategij za bolnike z rakom želodca (GC). Vendar je terapevtski učinek manj kot zadovoljiv, predvsem zaradi pridobljene odpornosti na platinasta zdravila. Zato lahko boljše razumevanje osnovnih mehanizmov močno izboljša terapevtsko učinkovitost GC. V tej študiji smo želeli raziskati funkcije/mehanizme, povezane s kemoterapevtsko odpornostjo, in klinični pomen z glukozo reguliranega proteina 75 (GRP75) pri GC. Tukaj so naši podatki pokazali, da je bila ekspresija GRP75 v primerjavi s celicami SGC7901 opazno višja pri odpornosti na cisplatin (celice (SGC7901 *). Knockdown GRP75 je odpravil vzdrževanje potenciala mitohondrijske membrane (MP) in zaviral jedrski faktor eritroid{{ 10}}povezani faktor 2 (NRF2), fosfatidilinozitol 3 kinaza/protein kinaza B (Pl3K/AKT), faktor 1a, inducibilen s hipoksijo (HIF-1a), in c-myc, kar je povzročilo blokiranje aktivacije Ti procesi so oslabili sposobnosti antioksidacije/apoptoze in spremenili presnovno reprogramiranje v celicah SGC7901, kar je povzročilo ponovno senzibilizacijo teh celic na cisplatin. Vendar pa je prekomerna ekspresija GRP75 v celicah SGC7901 povzročila nasprotne učinke. Model ksenograftov potrdil zgoraj omenjene rezultate.Pri bolnikih z GC, ki so prejemali kemoterapijo s platino in meta-analizo, je bila visoka raven GRP75 pozitivno povezana z agresivnimi značilnostmi in slabo prognozo, vključno z, vendar ne omejeno na gastr raka črevesja in je bil neodvisen napovedovalec celotnega preživetja. Skupaj je naša študija pokazala, da je bil GRP75 vključen v odpornost GC na cisplatin in da bi lahko bil GRP75 potencialna terapevtska tarča za obnovitev odziva na zdravilo v celicah, odpornih na platino, in koristno aditivno prognostično orodje pri usmerjanju kliničnega upravljanja bolnikov z GC.

Za več informacij kliknite tukaj

Uvod

Rak želodca (GC) je bil prva vodilna pojavnost in druga vodilna umrljivost raka prebavnega sistema na Kitajskem. Sedanje zdravljenje napredovalega GC je bilo kirurško delovanje v kombinaciji s sistemsko kemoterapijo, vendar je bila dolgoročna stopnja preživetja manj kot zadovoljiva zaradi visokega pooperativnega recidiva2. V klinični praksi so bila zdravila s platino eno izmed zdravil prve izbire za napredovalo GC kemoterapija3. Vendar se je pridobljena odpornost na zdravila vedno pojavila po več ciklih zdravljenja na osnovi platine in kaže na slabo prognozo.cistanchZato je bilo nujno nujno osvetlitev potencialnih mehanizmov in prepoznavanje novih terapevtskih strategij za premagovanje odpornosti na platinasta zdravila pri bolnikih z GC.

Cistanche lahko upočasni staranje

Z glukozo reguliran protein 75 (GRP75) je bil molekularni spremljevalec, ki ga povzroča stres in je pripadal družini proteinov toplotnega šoka4. Prekomerna ekspresija GRP75 je bila tesno povezana z napredovanjem tumorja pri različnih vrstah raka pri ljudeh5-7. Tukaj smo z raziskovanjem meta-analize ugotovili, da visoka raven GRP75 kaže na znatno slabo prognozo pri več vrstah raka prebavnega sistema (kolorektalni rak, holangiokarcinom in rak trebušne slinavke). Za odpornost na zdravila je inhibicija GRP75 obrnila odpornost na cisplatin in doksorubicin pri hepatocelularnem karcinomu in raku jajčnikov. GRP75 je klasično zasegel p53 v citoplazmi, kar je povzročilo inaktivacijo funkcije p53 in zatiranje app-toze10. Prejšnja študija je poročala, da je GRP75 pozitivni tumorji so imeli slabšo prognozo v primerjavi z GRP75 negativnimi tumorji pri GC z normalno funkcijo p53. Vendar je bil p53 eden najpogosteje mutiranih genov pri GC (prizadene več kot 50 odstotkov bolnikov)l2-15. Zato smo domnevali da je poleg klasične represije aktivnosti p53 lahko GRP75 vključen v indukcijo/vzdrževanje odpornosti na zdravila platine pri GC z uporabo ap53-neodvisnega načina.

V tej študiji je večja ekspresija GRP75 prispevala k odpornosti na cisplatin v celicah SGC7901 in v modelu ksenograftov. Mehansko gledano je GRP75 induciral/vzdrževal odpornost na cisplatin z uravnavanjem antioksidacijskih/apoptotičnih sposobnosti in lastnosti presnovnega reprogramiranja.cistanche AvstralijaPri bolnikih z GC je prekomerna ekspresija GRP75 prispevala k agresivnim značilnostim in slabi prognozi. Naši rezultati so pokazali, da GRP75 spodbuja odpornost na cisplatin pri GC in bi lahko bil biomarker za napovedovanje odziva na zdravljenje s platino.koristi cistancheUsmerjanje na GRP75 bi lahko zagotovilo novo razumevanje sistemske kemoterapije GC.

Rezultati

Učinki GRP75 na odpornost proti cisplatinu v GC Testi viabilnosti celic so bili uporabljeni za preverjanje odpornosti celic SGC7901~, Ipsos (uM) cisplatina za celice SGC7901 in SGC7901CR je bil: 5,518 proti 72,46 (slika 1A). Na podlagi podatkovnih zbirk KM-Plotter je povečana ekspresija GRP75 pokazala slabo prognozo (slika 1B). Poleg tega so izrazito povečane ekspresije GRP75 v celicah SGC7901CR v primerjavi s starševskimi celicami SGC7901 (slika 1C), kar kaže, da lahko GRP75 prispeva k odpornosti proti cisplatinu. Da bi preverili to hipotezo, so bile celice SGC7901~ transfektirane s kodirano ali GRP75 siRNA in vrednosti IC50 (uM) cisplatina za kodirane ali GRP75 siRNA transficirane celice SGC7901CK so bile: 50,83 v primerjavi z 20.86 (sl. .1D). V nasprotju,

čezmerna ekspresija GRP75 s transfekcijo plazmidov GRP75 v celice SGC7901 je pokazala, da so bili IC50 cisplatina za celice SGC7901, transficirane s kodiranimi ali plazmidi GRP75, 3,825 proti 6,98 (slika 1E). Skupaj so ti rezultati pokazali, da je imel GRP75 ključno vlogo pri ohranjanju/induciranju odpornosti na cisplatin pri GC, vendar so mehanizmi ostali v nadaljnji preiskavi.

Možni mehanizmi, na katerih temelji GRP75, so povzročili odpornost na cisplatin

Z GEO smo prenesli nabore podatkov mikromrež GSE122130 (SGC7901CR v primerjavi s SGC7901) in GSE14209 (tkiva, odporna na cisplatin vs. občutljiva na cisplatin), nato pa smo izvedli analizo obogatitve GO-Biological process in KEGG-Pathway na podlagi DAVID ter 10 najboljših rezultati so bili prikazani na slikah 2A-D. Bistvene razlike bioloških procesov med celicami SGC7901C* in celicami SGC7901 so vključevale redukcijo oksidacije, apoptotični proces (slika 2A), analiza obogatitve KEGG-poti je pokazala, da so nizi DEG tesno povezani s presnovnimi potmi in fosfatidilinozitol 3 kinazo/protein kinazo B (PI3K/AKT) pot (slika 2B). Odziv na zdravilo je bil vključen v bistvene razlike bioloških procesov med tumorskimi tkivi, odpornimi na cisplatin, in občutljivimi na cisplatin, presnovna pot pa je bila tudi osrednja povezava v analizi obogatitve poti KEGG (sl. 2C, D). Poleg tega je bila mreža 60 proteinov, ki so pomembno sodelovali z GRP75, zgrajena z uporabo podatkovne baze String, nato pa je analiza KEGG-Pathway izvedla, da so presnovne poti igrale pomembno vlogo med GRP75 in njegovimi interaktorji (slika 2E). Na podlagi teh rezultatov smo domnevali, da lahko antioksidacija/apoptoza in presnovno reprogramiranje spodbujata preživetje in rast GC, kar vodi do odpornosti proti cisplatinu. Vendar pa so mehanizmi sodelovanja GRP75 pri regulaciji potrebovali nadaljnjo študijo (slika 2F).

Učinki GRP75 na antioksidacijo in anti-apoptozo Tukaj je bila znotrajcelična raven ROS povišana v celicah SGC7901CR v primerjavi s starševskimi primerki (slika 3A), kar kaže, da so bile celice SGC7901Ck izpostavljene relativno višjim pogojem oksidativnega stresa. Prejšnja študija je pokazala, da je GRP75 sodeloval pri stabilizaciji MMP, pomembnega vira nastajanja ROS. Tu je knockdown GRP75 odpravilo vzdrževanje MMP v celicah SGC7901CK, ki ga je povzročil cisplatin, prekomerna ekspresija GRP75 pa je imela nasprotni učinek v celicah SGC7901 (slika 3B).čisti holesterolNato smo potrdili razmerje med GRP75 ter antioksidacijo in anti-apoptozo. Kot je prikazano na sliki 3C, je knockdown GRP75 znižal raven faktorja 2, povezanega z jedrskim faktorjem eritroid-2- (NRF2) in njegovih spodnjih ciljnih genov (HO-1 in NQO-1) v SGC7901 ~ celicah in prekomerna ekspresija GRP75 je pokazala nasprotni učinek v celicah SGC7901. Poleg tega je knockdown GRP75 ali NRF2 v celicah SGC7901CR dodatno okrepil znotrajcelične generacije ROS, apoptozo (slika 3D) in aktivnosti kaspaze-3 (dopolnilna slika S1), ki jih inducira cisplatin. Nasprotno pa je prekomerna ekspresija GRP75 v celicah SGC7901 znatno oslabila generacije ROS, ki jih povzroča cisplatin, celično apoptozo (slika 3E) in aktivnosti kaspaze-3 (dopolnilna slika S1). Ti rezultati so pokazali, da je GRP75 vzdrževana/inducirana odpornost na cisplatin lahko z indukcijo antioksidacije in anti-apoptoze v GC celicah.

Učinki GRP75 na presnovno reprogramiranje Nato smo nadalje raziskali, pri čemer je GRP75 povzročil spremembo presnovnega reprogramiranja. Vse več dokazov je pokazalo, da metabolizem tumorskih celic ni nenormalna sprememba v eni sami presnovni poti, ampak reprogramiranje celotne celične presnovne mreže17. Številni klasični onkogeni ali signalne poti so bili neposredno ali posredno vključeni v presnovno reprogramiranje, kot so PI3K/AKT, faktor la, inducibilen s hipoksijo (HIF-la), c-myc in tako naprej«'819. Zato smo preverili, ali je GRP75 sodeluje pri presnovnem reprogramiranju celic GC. Kot je prikazano na sliki 4A, smo opazili zvišane ravni p-AKT, HIF-la in c-myc v celicah SGC7901CR v primerjavi z njegovimi starševskimi celicami SGC7901. Poleg tega je v celicah SGC7901CR izpad GRP75 je zmanjšal s cisplatinom povzročene ravni proteinov p-AKT, HIF-la in c-Myc ter njihove nižje tarče, povezane z glikolizo (HK2: heksokinaza 2; PDK1: piruvat dehidrogenaza kinaza 1; in LDHA: veriga laktat dehidrogenaze A). Nasprotno, prekomerna ekspresija GRP75 v celicah SGC7901 je pokazala nasprotni učinek (sl. 4B, C). Poleg tega je knockdown GRP75 ali AKT v celicah SGC7901CR pokazalo znatno zmanjšanje privzema glukoze in celične sposobnosti preživetja/rast, ki jo povzroča cisplatin; vendar izrazito čezmerno izražanje GRP75 v celicah SGC7901 povečana sposobnost privzema glukoze in viabilnost/rast celic, ki jo povzroča cisplatin (sl. 4D-F). Skupaj so ti podatki pokazali, da je GRP75 vzdrževana/inducirana odpornost proti cisplatinu v celicah GC lahko posledica sodelovanja pri presnovnem reprogramiranju, posredovanem s p-AKT, HIF-la in c-myc.

Potrditev podatkov in vitro v modelu ksenotransplantata Nato smo raziskali potencialni klinični pomen GRP75 in vivo. Podatki o ksenotransplantatu so pokazali, da bi zdravljenje s samim cisplatinom ali samim knockdownom GRP75 lahko zaviralo rast tumorja; vendar je zdravljenje s cisplatinom v kombinaciji z knockdownom GRP75 bistveno olajšalo zaviranje rasti tumorja, ki ga povzroča cisplatin (slika 5A). Poleg tega sta testa IHC in qPCR pokazala, da sta cisplatin in siRNA GRP75 bistveno zmanjšala izražanje Ki67, GRP75, NRF2, p-AKT in spodnjih tarč v primerjavi s samim zdravljenjem s cisplatinom, vendar je povečala apoptozo (kot je bilo ugotovljeno z barvanjem TUNEL, slika 5B). , C). Skupaj so ti rezultati pokazali, da je GRP75 z uravnavanjem sposobnosti antioksidacije/anti-apoptoze in presnovnim reprogramiranjem spodbudil preživetje in rast in vivo, kar je posledično privedlo do odpornosti GC na cisplatin.

Identifikacija GRP75 kot značilnega dejavnika, ki spodbuja raka, in klinični pomen GRP75 pri GC

Nato smo ovrednotili izražanje GRP75 v zaporednih delih vzorcev GC. Kot je prikazano na sliki 6A, so v primerjavi s sosednjimi netumorskimi želodčnimi tkivi opazili znatno povečanje izražanja GRP75 v tkivih GC. Prekomerna ekspresija GRP75 je bila dokazana v GC tkivih z rezultatom IHC-intenzivnosti (sl. 6B). Močnejše obarvanje za GRP75 so opazili tudi z naraščajočo stopnjo malignih tumorjev po klasifikaciji TNM (sl. 6C, D). Nato smo teh 116 vzorcev GC razdelili v dve skupini ("GRP75 nizek" v primerjavi z "GRP75 visok", glede na intenzivnost IHC, slika 6E). Prečni premeri tumorjev v skupini "GRP75 high" so bili znatno večji od tistih v skupini "GRP75 low" (slika 6F). Nadalje smo potrdili klinično prognozo GRP75 v GC. Kaplan-Meierjeva analiza preživetja je tudi pokazala, da so imeli bolniki z GC v skupini "GRP75 high" slabše skupno preživetje kot tisti v skupini "GRP75 low" (slika 6G).

Multivariatna analiza je pokazala, da je bil GRP75 neodvisen napovedovalec celotnega preživetja (tabela 1).stranski učinki cistanche deserticola,Če povzamemo, ti rezultati kažejo, da je imel GRP75 značilno vlogo pri napredovanju GC, odpornosti na cisplatin in slabi prognozi. Metaanaliza visoke ravni GRP75 s prognozo Diagram poteka iskanja in izbire literature ter metaanaliza sta bili prikazani na dodatni sliki S2. Za izračun in analizo vrednosti srčnega utripa sta bila uporabljena model naključnega učinka in model fiksnega učinka, pri čemer sta oba pokazala, da so visoke ravni GRP75 pomembno povezane s slabimi izidi bolnikov. Skupni HR je bil 1,91 (95-odstotni IZ 1,62 do 2,25), s heterogenostjo (I'=0.0 odstotkov, p =0.559) (slika 7A). Nato smo naredili analizo podskupin, ki je pokazala, da je stopnja izražanja GRP75 pri raku prebavil (skupni HR je bil 1,99,95 odstotka IZ 1,64 do 2,43) pomembno povezan s slabo prognozo preživetja. Vsekakor so bili podobni rezultati ugotovljeni tudi pri drugih tumorjih (skupni HR je bil 1,74, 95-odstotni IZ 1,29 do 2,33) (slika 7B). Oboje

Za oceno morebitne pristranskosti objave vključenih študij sta bila uporabljena Beggov lijak in Eggerjev test. Pri analizi povezave med GRP75 in OS sta bili p-vrednosti Beggovega testa in Eggerjevega testa 0.076 oziroma 0,024 (sl. 7C in D). Vendar ima Eggerjev test večjo občutljivost pri ocenjevanju pristranskosti objave. Tako je bila uporabljena metoda trim and fill, da bi bili naši rezultati bolj verodostojni. Kot je prikazano na sliki 7E, je bil prilagojeni srčni utrip v modelu s fiksnim učinkom 1,785 (95-odstotni IZ 1,530 do 2,081, p<0.001), and="" in="" the="" random="" effect="" model="" was="" 1.792="" (95%="" ci="" 1.515="" to=""><0.001), which="" was="" not="" significantly="" different="" from="" overall="" hr.="" in="" our="" analysis,="" a="" high="" level="" of="" grp75="" showed="" a="" poor="" prognosis="" including="" but="" not="" limited="" to="" gastrointestinal="" cancer,="" which="" was="" highly="" consistent="" with="" our="">

Diskusija

V tej študiji smo uporabili eno od kemoterapevtikov prve izbire za bolnike z GC, zdravila platine. Klasično se lahko zdravila iz platine kovalentno vežejo na gvanin v verigi DNA in tako blokirajo replikacijo in prepisovanje DNA2. Vendar pa je zaradi odpornosti na zdravila in nezaželenih stranskih učinkov nujno potrebno določiti nove terapevtske strategije za odpravo odpornosti pri bolnikih z GC. Poleg tega so bolniki z GC razvili odpornost na zdravila po prejemu več ciklov cisplatina in naši rezultati so pokazali, da so celice SGC7901 ~ pokazale znatno odpornost na cisplatin v primerjavi s celicami SGC7901.

GRP75 (mortalin/mot-2/HSPA9) je imel ključno vlogo pri uravnavanju nastanka in napredovanja raka pri ljudeh-7. Pred kratkim je postalo jasno, da ima GRP75 ključno vlogo tudi pri odpornosti na kemoterapijo. "Poleg GRP75 so drugi proteini toplotnega šoka igrali ključno vlogo pri odpornosti na cisplatin prek PI3K/AKT/NF-KB in drugih poti21-24 . Vendar pa so redko poročali o molekularnem mehanizmu GRP75 in odpornosti na cisplatin. Tukaj je naša študija pokazala, da GRP75 spodbuja antioksidacijske/apoptozne sposobnosti in spremeni presnovno reprogramiranje, kar vodi do odpornosti na cisplatin v GC celicah. Ugotovili smo tudi, da je bil GRP75 povečan v celic SGC7901~ in v vzorcih tkiv bolnikov, in je bil povezan z odpornostjo na zdravila, pro-preživetjem, rastjo in slabimi rezultati. Medtem je multivariatna analiza pokazala, da je bil GRP75 neodvisen napovedovalec celotnega preživetja. Poleg tega je meta-analiza pokazala, da visoka raven GRP75 je pokazala slabo prognozo, vključno z, vendar ne omejeno na GC, kar je bilo zelo skladno z našo raziskavo. Vsi zgornji rezultati so potrdili, da lahko ciljanje na GRP75 Pričakovati je, da bo postal nov pristop za odpravo odpornosti na cisplatin in izboljšanje prognoze bolnikov z GC.

V fizioloških pogojih so bile celice neizogibno izpostavljene ROS zaradi zunanjih dejavnikov in znotrajceličnega aerobnega metabolizma. Kot dvorezen meč so bile ustrezne ROS pomembne signalne molekule, ki uravnavajo normalno delovanje celic, prekomerne ROS pa so vodile v apoptozo. Zato je v telesu obstajal natančen sistem regulacije antioksidantov za vzdrževanje redoks ravnovesja in apoptotičnih postopkov 20. Vendar pa so bile za razliko od fizioloških stanj ravni ROS tumorjev na splošno znatno višje od običajnih kontrol istega tkiva, kar je določilo obstoj posebnega antioksidativni sistem v tumorskih celicah, zlasti za tumorske celice, odporne na zdravila27-29. Naši rezultati so potrdili, da so celice SGC7901CR pokazale relativno višjo raven ROS v primerjavi s celicami SGC7901 in da je GRP75 povečal zmogljivosti antioksidacije/apoptoze. Tumorske celice so imele dolgo zgodovino presnovnih nepravilnosti. Že v tridesetih letih prejšnjega stoletja je Otto Warburg odkril, da imajo tumorske celice raje glikolizo. Tudi v pogojih z zadostno vsebnostjo kisika so tumorske celice še vedno ohranjale visoke stopnje glikolize za nastajanje ATP. Ta nenormalni presnovni vzorec so poimenovali "Warburgov učinek"3031. Presnovne spremembe, ki jih povzroča Warburgov učinek, so nedavno imenovali presnovno reprogramiranje, študije teh sprememb pa so omogočile globlje razumevanje metabolizma GC celic. Dokazano je bilo, da celice GC in normalne celice kažejo presnovne razlike ne le v presnovi glukoze, temveč tudi v presnovi lipidov in aminokislin³2-35. V tej raziskavi smo ugotovili, da so bile spremembe v presnovi glukoze ena od ključnih povezave, ki ohranjajo celično rast, kar sčasoma vodi do odpornosti GC na cisplatin.

Kot smo omenili, so bili klasični onkogeni in signalne poti, kot so PI3K/AKT, HIF-la in c-myc, neposredno ali posredno vključeni v presnovno reprogramiranje. Aktivacija poti PI3K/AKT v tumorskih celicah je povečala veliko presnovnih aktivnosti. Prvič, celicam je omogočil privzem glukoze, aminokislin in drugih hranil. Drugič, AKT je povečal glikolizo in proizvodnjo laktata s svojimi učinki na ekspresijo genov in aktivnost encimov in je zadostoval za induciranje učinka War-burga v rakavih celicah. Tretjič, aktivacija te poti je povečala biosintezo makromolekul in spodbudila izražanje lipogenih genov in sintezo lipidov'7. Poleg tega sta GRP75-aktivirana AKT in zunajcelične signalno regulirane proteinske kinaze 1 in 2 zavirale Baxove konformacijske spremembe in apoptozo 8. Tumorske celice so se prilagodile na hipoksijo, ki je vključevala presnovno reprogramiranje prek uravnavanja ciljnih genov HIF-la za spodbujanje privzema glukoze, glikolize, proizvodnja in izločanje mlečne kisline, shranjevanje glikogena, glutaminski cat-abolizem³ in spodbujanje kopičenja trigliceridov v lipidnih kapljicah³. Pred kratkim je postalo jasno, da se lahko GRP75 specifično veže na HIF-la in cilja na zunanjo mitohondrijsko membrano, povezano z VDAC1 in HK2, ki sta preprečila apoptozo. C-myc bi lahko posredoval presnovno reprogramiranje na več načinov, presnovno reprogramiranje, posredovano s c-myc, pa je bilo v veliki meri doseženo z vplivanjem na mitohondrije. Po eni strani je c-myc spodbujal tudi glikolizo z neposrednim uravnavanjem ekspresije encimov, povezanih z glikolitikom, vključno z LDHA, HK2 in PDK11938. Po drugi strani pa so c-myc aktivirani encimi, vključeni v presnovo glutamina prek transkripcije, spodbujali uporabo glutamina preko mitohondrijev v tumorskih celicah. Ta učinek se imenuje "glutaminoliza". Poleg tega je prekomerna ekspresija GRP75-zmanjšala ciklin-B1 in poveča ciklin-D1 in c-myc za spodbujanje rasti rakavih celic jajčnikov*. Na podlagi naših sedanjih rezultatov smo zagotovili novo razumevanje odpornosti GC na cisplatin prek GRP75 kot potencialno pomembne povezave pri regulaciji mrež za presnovno reprogramiranje tumorja.

Sklepi

Za zaključek smo pokazali, da lahko prekomerna ekspresija GRP75 spodbuja preživetje/rast GC celic z uravnavanjem antioksidacije/apoptoze in presnovnih mrež za reprogramiranje, s čimer povzroči odpornost na cisplatin

Materiali in metode

Celice, reagenti in pogoji gojenja

GC cell lines, SGC7901 cells (mutant-type of p53), and cisplatin-resistance cells (SGC7901CB) were obtained from and STR identified by KeyGENE Bio Co. Ltd (Nanjing, China). Cisplatin(Pt(NH3)2Clz, >99.0 odstotkov čistosti), je bilo kupljeno pri Sigma-Aldrich (Šanghaj, Kitajska). Celice smo gojili v mediju RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, ZDA), dopolnili z 10 odstotki fetalnega govejega seruma （FBS）, 100 U/ml penicilina, 100 ug/ml streptomicina (Gibco) in inkubirali v 5 odstotkih CO2 pri 37 stopinjah. Za vzdrževanje fenotipa odpornosti na cisplatin smo celice SGC7901CR inkubirali v mediju, ki je vseboval cisplatin (5 μM).

Ksenografti in zdravljenje

To študijo je odobril Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo živali Medicinske univerze v Nanjingu, z živalmi pa so ravnali humano in z namenom lajšanja trpljenja. Gole miši BALB/c so bile pridobljene iz SLRC Laboratory Animal Center (Šanghaj, Kitajska) in so jih običajno hranili, kot smo opisali prej*l. Za študijo ksenografta so celice SGC7901CK 2 × 10 stopinj v 100 ul matrigela subkutano injicirali v boke miši za 5 tednov. Za določitev učinkov GRP75 na odpornost GC na cisplatin smo izvedli test intratumoralne in intraperitonealne injekcije. Na kratko, miši so bile naključno razdeljene v 4 skupine (5 miši na skupino): (1) MOCK, (2) GRP75KD, (3) MOCK＋cisplatin in （4） GRP75 KD＋cisplatin. 100 ul siRNA （si-Con ali si-GRP75, 100 nM) so bile intratumorske injekcije vsake 3 dni. Skupine, ki so bile zdravljene s cisplatinom (5 mg/kg), so prejele intraperitonealne injekcije 3-krat na teden, druge skupine pa so bile perfundirane z enakim volumnom fiziološke raztopine. Tumorje smo merili vsak teden in njihove prostornine izračunali po formuli: V=Y (širina2 dolžina). Po 5 tednih so miši žrtvovali in tumorska tkiva odstranili za nadaljnje preiskave.

Bolniki in vzorci tkiv

To študijo je odobril Odbor za medicinsko etiko Druge pridružene bolnišnice Medicinske univerze v Nanjingu in pridružene bolnišnice Changzhou št. 2 Medicinske univerze v Nanjingu, od vsakega bolnika pa je bilo pridobljeno pisno informirano soglasje udeleženca. Klinično-patološki podatki so bili navedeni v dodatni tabeli S1. Tkivno mikromrežo je izdelalo podjetje Zhuoli Biotechnology Co.Ltd (Šanghaj, Kitajska), kot smo opisali prej*

Transfekcija celic

Za transfekcijo je kodirano in pcDNA-3.1-GRP75-Flag sintetiziral General Biotech (Šanghaj, Kitajska); medtem ko so bile siRNA navedene v dodatni tabeli S2. Celice so bile prehodno transfektirane z reagentom lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, ZDA) v skladu s protokolom proizvajalca. Na kratko, celice smo nasadili na 6-plošče z vdolbinicami z gostoto celic 1×10 stopinj v mediju RPMI 1640, ki je vseboval 10 odstotkov FBS brez antibiotikov. Po 24-urni inkubaciji so bile celice začasno transfektirane s 5 ng/ml umešane ali GRP75-Flag ali 20 nM si-Con ali si-GRP75 12 ur. Po transfekciji smo celice gojili v svežem mediju, dopolnjenem z 10 odstotki FBS še 24 ur, preden smo jih uporabili za druge poskuse.

Kvantitativna verižna reakcija s polimerazo v realnem času (qPCR) Uporabljeni primerji so bili navedeni v dodatni tabeli S3. Izolacija celotne RNK, transkripcija RNK v cDNA in delovanje qRT-PCR s strojem Applied Biosystems 7300HT so bili vsi v skladu z našo prejšnjo študijo 2. -aktin je bil pomnožen, da se zagotovi celovitost cDNA in normalizira izražanje. Kratne spremembe izražanja vsakega gena so bile izračunane z metodo primerjalnega praga cikla (Ct) z uporabo formule 2-(4ACt)

Ta članek je izvleček iz Dai et al. Odkritje celične smrti (2021) 7:140 https://doi.org/10.1038/s41420-021-00517-w