Mieloidna heterogenost pri ledvični bolezni, razkrita s sekvenciranjem enocelične RNA

Povzetek

Ledvična bolezen predstavlja globalno breme za zdravje, ki se povečuje in je neodvisen dejavnik tveganja za bolezni srca in ožilja. Mieloidne celice so glavni celični del imunskega sistema; najdemo jih v zdravih ledvicah in vse več jih je v poškodovanih in/ali obolelih ledvicah, kjer delujejo kot ključni akterji pri napredovanju poškodbe, vnetja in fifibroze. Imajo ogromno plastičnost in heterogenost ter sprejemajo različne fenotipske in funkcionalne značilnosti kot odziv na dražljaje v lokalnem okolju. Čeprav je treba to inherentno zapletenost v ledvicah še popolnoma razumeti, napredek v enocelični genomiki obljublja, da bo to spremenil. Natančneje, sekvenciranje enocelične RNA (scRNA-seq) je imelo transformativen učinek na raziskave ledvic, kar je omogočilo profiliranje in analizo transkriptomov posameznih celic z ločljivostjo in pretočnostjo brez primere ter kasnejšo generacijo celičnih atlasov. V nadaljevanju bo kombinacija scRNA- in enojedrne RNA-seq s prostorsko transkriptomiko z večjo ločljivostjo omogočila prostorsko kartiranje ledvične bolezni različnih etiologij za nadaljnje razkrivanje vzorčenja imunskih celic in neimunskih ledvičnih celic. Ta pregled povzema vloge mieloidnih celic pri zdravju in bolezni ledvic, eksperimentalni potek dela je trenutno na voljo za tehnologije scRNA-seq in objavljene ugotovitve z uporabo scRNA seq v kontekstu mieloidnih celic in ledvic.

Kliknite, da herba Cistanche koristi za ledvice

Rachel MB Bell in Laura Denby

Uvod

Ledvica je kompleksen organ, ki opravlja različne funkcije, ki so bistvenega pomena za fiziološko homeostazo, zato so bolniki z ledvično boleznijo pogosto prisotni s pomembnimi zapleti in sočasnimi boleznimi (1,2). Manifestacije ledvične bolezni so široke in vključujejo akutno ledvično poškodbo (AKI), avtoimunske motnje in zavrnitev ledvičnih presadkov, vse pa so neposredno ali posredno imunsko posredovane (3). Zaradi povečane stopnje razširjenosti ima ledvična bolezen velik vpliv na globalno zdravje, tako kot neposreden vzrok obolevnosti in umrljivosti kot tudi kot glavni dejavnik tveganja za bolezni srca in ožilja (1). Mieloidne celice so najpogostejše hematopoetske celice z jedri v telesu, ki zajemajo monocite, makrofage, dendritične celice (DC) in granulocite. Mieloidne celice tvorijo kritično vejo imunskega sistema in imajo različne funkcije (4). V ledvicah je bilo predvsem dokazano, da makrofagi in DC vplivajo na homeostazo organov, poškodbe in reparativne procese po različnih poškodbah. Njihovo delovanje, fenotipski spekter in medsebojno delovanje z drugimi imunskimi in neimunimi celicami so zapleteni in nepopolno razumljeni (3,5). Naše razumevanje imunskega sistema je napredovalo z uporabo tehnologij, ki omogočajo enocelično ločljivost, predvsem mikroskopije in pretočne citometrije. Število parametrov, ki jih je mogoče sočasno meriti s temi tehnologijami, je omejeno in odvisno od predhodnega znanja o tem, kateri antigeni so prisotni. V zadnjih letih je napredek pri sekvenciranju enocelične RNA (scRNA-seq), katerega cilj je celovito merjenje ravni izražanja genov v celicah, spremenil našo sposobnost profiliranja imunskih celic (2,6,7).

Vloge mieloidnih celic pri zdravju in bolezni ledvic

Mieloidne celice so prilagodljive narave, saj kažejo prehodne odzive, nadzorovano diferenciacijo, (pre)lokacijo v tkivih in plastičnost kot odziv na različne okoljske dražljaje, ne glede na to, ali so homeostatski ali vnetni (4). To predstavlja zaplet v zvezi z njihovo študijo v ledvicah, ker ta glavni hemofiltracijski organ ponuja zahtevno okolje, ki ni prostorsko enotno, in poročali so o razlikah v vrstah imunskih celic v ledvični skorji in meduli (8, 9). Makrofagi so najpogostejši tip mieloidnih celic v ledvicah in skupaj z DC usklajujejo vnetne odzive na prosto filtriran antigenski material ter ščitijo ledvico pred okužbo (8). Pomembno je, da sodelujejo tudi pri začetku in napredovanju ledvične bolezni ter kasnejši regeneraciji tkiva. Zaradi te raznolikosti se na splošno predlaga, da se makrofage deli na proinflamatorne (M1 ali "klasično aktivirane") in tkivno reparativne (M2 ali "alternativno aktivirane") fenotipe.

Vendar pa je ta karakterizacija preveč poenostavljena z ne samo makrofagi, ampak tudi z DC-ji, ki imajo inherentno plastičnost. Dejansko obstajajo trdni dokazi za mieloidne celice, povezane z boleznijo, ki si delijo signaturne markerske gene tako pro kot protivnetnih lastnosti (4,10). Imunske celice so običajno opredeljene z različnimi označevalci celične površine, čeprav imajo različne vrste mieloidnih celic veliko skupnih označevalcev; zato bo za identifikacijo vrste celice, ki nas zanima, pogosto potrebnih več markerjev. Poleg tega se lahko markerji med vrstami razlikujejo (tabela 1). Imunohistokemija in citometrija se pogosto uporabljata za identifikacijo intra- in zunajceličnih markerjev (6). Pri miših so makrofagi, ki prebivajo v ledvicah (CD11bloF4/80hi), dvojnega hematopoetskega izvora, izhajajo iz rumenjakove vrečke in dokončne hematopoeze, z Ly6Clo "patruljiranimi" monociti (CD14loCD16hi pri ljudeh) (11–13). V vnetnih stanjih se monociti Ly6Chi (CD14hiCD162 pri ljudeh) infiltrirajo v ledvico in se diferencirajo v (CD11bhiF4/80lo) makrofage (11–13). Kljub temu, da je omejena na približno 16 parametrov in težave, ki izhajajo iz spektralnega prekrivanja, je bila še posebej sorodna citometrija zelo uporabna in predstavlja najosnovnejšo enocelično tehnologijo, vendar je malo verjetno, da bo zagotovila celoten fenotipski spekter mieloidnih celic (6 ,7,10).

Pregled tehnologij enoceličnega sekvenciranja

Visokozmogljive tehnike izražanja genov, kot sta mikromrež in razsuti RNA-seq, so omogočile boljše razumevanje kompleksnih organskih transkriptomov; vendar pa imajo njihove zahteve po vnosu RNA omejene študije na združenih populacijah. Ker ledvica vsebuje .20 različnih vrst celic (vključno z epitelijsko, endotelijsko, mezenhimsko in imunsko populacijo), nastali profil genske ekspresije ledvičnega tkiva odraža le povprečje za te heterogene sestavine (14). V ledvicah celice proksimalnih tubulov prevladujejo po številu in lahko tako zakrijejo profil izražanja redkejših populacij. Tehnologije scRNA-seq so te omejitve odpravile tako, da so omogočile objektivno preiskavo transkriptomov posameznih celic v danem vzorcu z ustvarjanjem celičnih atlasov ledvičnih komponent sesalcev. Zlasti raziskovalna skupnost ledvic je vložila v odprt dostop in je omogočila, da so ti podatki prosto dostopni prek spletnih mest (tabela 2). To omogoča nepristransko oceno celične heterogenosti, identifikacijo novih celičnih stanj in podtipov ter dinamične celične prehode pri zelo visoki ločljivosti in natančnosti (6,14,15).

Do danes je bilo predlaganih več tehnik scRNA-seq in razvoj novih protokolov je zelo aktivno področje raziskav (kot sta pregledala Li in Humphreys [16]). Na splošno imajo vsi poskusi scRNA-seq skupen potek dela: priprava vzorca, zajem ene celice, reverzna transkripcija in pomnoževanje transkriptoma, priprava knjižnice, sekvenciranje in analiza (slika 1). Enojedrna RNA-seq (snRNA-seq) je vedno bolj priljubljena alternativa scRNA-seq. Tukaj so jedra izolirana iz celic in uporabljena za sekvenciranje na osnovi kapljic (14). Poročali so, da ima snRNA-seq primerljivo zaznavanje genov kot scRNA-seq pri odraslih ledvicah in odpravlja z disociacijo povzročene transkripcijske stresne odzive v vneti fibrotični ledvici. Poleg tega je združljiv z zamrznjenimi vzorci, vendar zajame imunske celice z manjšo učinkovitostjo (19). Razlog za to ostaja nejasen. Zato bo morda treba izolirati celice CD451, ki predstavljajo le 2 do 17 odstotkov celotne populacije ledvičnih celic (20), da bi s to metodo pridobili največji možni vpogled v ledvične levkocite.

V razvoju so številne druge enocelične tehnike, ki omogočajo neposredno merjenje mikroRNA, proteomskih ali presnovnih podatkov, ki jih pristopa scRNA-seq in snRNA-seq ne zagotavljata. Predvsem sočasno profiliranje ekspresije transkriptov in proteinov celične površine, kot je ekspresija RNA in sekvenciranje beljakovin (REAP) (21) ter celično indeksiranje transkriptomov in epitopov (CITE) s sekvenciranjem (22), je zdaj možno, kar omogoča korelacijo izražanja beljakovin s transkriptomskimi podatki. Poleg tega test za transpozazno dostopen kromatin (ATAC) s sekvenciranjem omogoča profiliranje dostopnosti kromatina, kar omogoča preiskavo epigenetske heterogenosti (23). Nedavno so ga uporabili v kombinaciji s snRNA-seq za identifikacijo edinstvenih stanj celic v proksimalnem tubulu in debelem naraščajočem kraku v človeški ledvici (24) ter ključnih dogodkov preoblikovanja kromatina in dinamike izražanja genov, povezanih z razvojem ledvic pri miših (slika 2 ) (25).

Ker ima ledvica izrazite regionalne razlike, so pomembni anatomska lokalizacija in medcelične interakcije celic, vendar se ti dejavniki pri analizi disociiranih posameznih celic večinoma izgubijo. Interakcije je mogoče nekoliko razbrati iz analiz parov receptor-ligand za kemokine in citokine; vendar je za popoln odgovor na taka vprašanja potrebna neposredna vizualizacija prostorskih odnosov med celicami. To nadalje pomeni, da ni mogoče ločiti populacij levkocitov, ki se infiltrirajo ali se nahajajo v ledvicah, od tistih, ki morda krožijo skozi ledvično žilje (6,15). Združevanje scRNA-seq in snRNA-seq s prostorsko transkriptomiko lahko izboljša ta vidik. Ferriera in sod. (26) je nedavno uporabil te komplementarne tehnologije za prostorsko preslikavo transkriptomskega podpisa v mišjih modelih AKI in pokazal, kako se to lahko uporabi za človeške vzorce. Identificirali so vzorce kolokalizacije imunskih in epitelijskih celic in, čeprav so omejene z resolucijo, se bodo te metodologije verjetno izboljšale s prihodnjim delom.

Študije scRNA-Seq o zdravju ledvic

Celovita celična anatomija normalne ledvice je ključnega pomena za popolno razumevanje razvoja in razrešitve bolezni ledvic; vendar so do danes poskusi popolnega preslikave imunskih populacij v zdravih ledvicah omejeni. Leta 2018 so Park et al. (2) je zagotovil prvo in največjo scRNA-seq mišje ledvične celice doslej iz zdrave mišje ledvice. Identificirali so glavne podtipe celic, ki obsegajo nefron in predhodno znane tipe ledvičnih imunskih celic, vključno z rezidenčnimi makrofagi in nevtrofilci. Vendar pa je možno, da nekateri mieloidni podtipi niso bili odkriti, morda zaradi vrst imunskih celic, ki so prispevale majhen delež v nepoškodovani ledvici, in/ali zaradi priprave vzorca, ker približno 25 odstotkov celic ni prestalo kontrole kakovosti v tej študiji.

Nedavna ključna študija je uporabila scRNA-seq s pretočno in masno citometrijo za opredelitev globalne imunske pokrajine pri zdravih ledvicah odraslega človeka in plodu ter profiliranje celic skozi celotno življenjsko dobo (9). Mononuklearni fagociti (MNP), naravne celice ubijalke (NK) in celice T so bili najbolj razširjeni, štiri podskupine MNP, nevtrofilcev, mastocitov in plazmacitoidnih DC (pDC) pa so bile identificirane znotraj mieloidnega predela zrele ledvice. V skupini MNP sta prevladovali dve populaciji makrofagov, pridobljeni iz monocitov: ena je bila transkripcijsko podobna klasičnim monocitom CD141, druga pa neklasičnim monocitom CD161. Vseboval je tudi običajno populacijo DC (CDC) in populacijo tkivnih makrofagov, ki je bila nagnjena k protivnetnemu transkriptomu M2, ki izraža CD206. Poleg tega so raziskovalci dokazali anatomsko lokalizacijo imunskih celic s sklicevanjem na svoje delo na javno dostopne množične podatke RNA-seq, ustvarjene iz znanih regij ledvic, kar je razkrilo diferencialno porazdelitev imunskih podskupin v meduli in medenici v primerjavi s korteksom. Analiza interakcij ligand-receptor, ki kaže na navzkrižni pogovor epitelijskih in imunskih celic, naj bi lokalizirala antibakterijske makrofage in nevtrofilce na predele ledvic, ki so najbolj dovzetne za ascendentno okužbo iz sečil. To je v skladu s prejšnjim delom, ki je pokazalo, da visoka intersticijska koncentracija natrija v meduli spodbuja proizvodnjo kemokinov v tubularnih epitelijskih celicah, kar pomaga postaviti makrofage v boj proti imunološki grožnji, ki jo predstavlja naraščajoča bakterijska okužba (8). Zmožnost orkestriranja lokalizacije imunskih celic na specifične regije ni bila pri fetalnih ledvicah, s postnatalnim pridobivanjem transkripcijskih podpisov, ki kaže na vlogo pri vnetju in imunski obrambi (9). Druga nedavna študija Menon et al. (27) so identificirali rezidenčne imunske celice v neobolelih človeških vzorcih iz tumorske nefrektomije, nadzora in reperfuzijske biopsije; ti so vključevali dve mieloidni skupini, čeprav nista bili opredeljeni v podtipe.

Dinamične spremembe v imunskem sistemu so znak staranja (28). Nedavno je bila scRNA-seq izvedena na celicah .350,000 iz več organov in tkiv, vzetih iz miši C57BL/6J, ki pripadajo starostnim skupinam od 1 do 30 mesecev (29). Po izračunu skupne ocene raznolikosti sta bili identificirani dve skupini ledvičnih makrofagov, katerih sestava se je s starostjo znatno spremenila. En grozd je bil večinoma sestavljen iz celic 1- in 3-mesečnih miši, obogatenih s protivnetnim podpisom (npr. Cq1a, Cd74, Cd81). Nasprotno pa je bil drugi grozd sestavljen predvsem iz celic 18-, 21-, 24- in 30-mesečnih miši, ki so bile podobne proinflamatornemu stanju makrofagov (npr. Intgal, Msrb1). Trenutno manjkajo takšne obsežne študije staranja pri ljudeh, vendar jih bo v prihodnosti pomembno izvesti, ker se razširjenost bolezni ledvic s starostjo povečuje (1).

Čeprav so bile študije izvedene na človeškem in mišjem tkivu, obstajajo pomanjkljivosti pri pridobivanju dovolj svežih človeških vzorcev, kar poudarja pomen premagovanja težav pri prevajanju. Študije so odkrile dobro definirane označevalce tipov mieloidnih celic v mišjih tkivih, vendar jih med vrstami ni mogoče ohraniti. Dobro znan primer je F4/80 (kodiran z adgre1), ki se uporablja za identifikacijo tkivno rezidentnih makrofagov pri miših, vendar se ne izraža v populacijah makrofagov pri ljudeh. Poleg tega je zdaj znano, da se markerji, ki so se v preteklosti uporabljali za razlikovanje DC od makrofagov, kot sta CD11c in MHCII, običajno izražajo tkivni makrofagi (28, 30). Zimmerman et al. (31) so uporabili scRNA-seq za identifikacijo medvrstnega markerja, specifičnega za makrofage ledvic. Celice CD451 z izključeno populacijo limfocitov so bile izolirane iz ene mišje, podgane, prašičje in človeške ledvice, kar je razkrilo skupek celic, ki izražajo C1q. Druge analize scRNA-seq celotnega ledvičnega tkiva miši (2, 10) in ljudi (32) so prav tako identificirale to skupino, ki izraža C1q. V skupini, ki izraža C1q, sta bila nova površinska označevalca Cd74 in Cd81 identificirana kot potencialna označevalca kandidata za makrofage, ki prebivajo v ledvicah različnih vrst (31). Te so bile potrjene z analizami pretočne citometrije, ki so pokazale, da so bile celice CD741CD811 bolj razširjene v rezidenčnih (CD11bloF4/80hi) v primerjavi z infiltrirajočimi (CD11bhiF4/80lo) makrofagi, in potrdile so minimalno izmenjavo s celicami, pridobljenimi iz kostnega mozga, z uporabo modela parabiotične miši. Ni znano, ali se ti kandidati spreminjajo skozi čas vnetja. V naši študiji reverzibilne enostranske ureteralne obstrukcije (R-UUO) se je ekspresija C1qa dejansko spreminjala v 12 mieloidnih podskupinah (10). V prihodnosti bo pomembno nadalje raziskati učinek seva miši za kontekstualizacijo ugotovitev. Inbred laboratorijske miši se dejansko lahko zelo razlikujejo v vzorcih imunskega odziva; na primer, pokazalo se je, da imajo miši 129/Sv po enostranski ishemični reperfuzijski poškodbi (IRI) manj infiltriranih levkocitov kot miši C57BL6/J (33).

Študije scRNA-Seq pri poškodbah in boleznih ledvic

Med časovnim potekom bolezni ledvic se pojavi fazno odvisen priliv mieloidnih celic in spremembe v njihovem fenotipu (34). Da bi opredelili celično pokrajino pri napredovanju AKI v kronično ledvično bolezen (CKD), so Valle Duraes et al. (35) so uporabili scRNA-seq v enostranskem modelu IRI z ali brez takojšnje kontralateralne nefrektomije za preučevanje regeneracije ledvic oziroma fifibroze. Identificiranih je bilo sedem glavnih skupin, vključno z rezidenčnimi in vnetnimi makrofagi, nevtrofilci/monociti, DC/monociti, NK celicami, celicami T in celicami B. V zdravi ledvici so prevladovali rezidenčni makrofagi, medtem ko so se po poškodbi vnetni makrofagi znatno razširili in rezidenčni makrofagi so izginili, ne glede na uporabljeni model ali časovno točko po poškodbi. Po poškodbi so se razširile tudi mešane populacije nevtrofilcev/monocitov in DC/monocitov. V drugi študiji je bil snRNA-seq uporabljen z bilateralnim IRI modelom AKI (36). Čeprav so bili tu v središču proksimalni tubuli, je bilo identificiranih šest levkocitnih grozdov: trije podtipi makrofagov, DC, celice T in celice B. Analiza ligand-receptorja, opravljena na kombiniranem grozdu levkocitov, je pokazala spremembe v signalizaciji Ccl2 (tubulointersticij) v Ccr2 (levkociti) skozi čas; fibroblasti in endotelijske celice so bili prvi tipi celic, ki so signalizirale levkocite, sledila sta jim signalizacija levkocit-levkocit in naraščajoča signalizacija Ccl2-Ccr2 iz proksimalnih tubulov, ki se niso uspeli popraviti 2 dni in 6 tednov po poškodbi. Prvi in ​​drugi grozd makrofagov sta verjetno rezidenčna in vnetna makrofaga na podlagi markerjev, kot sta F13a1 in Vcan. Tretji grozd je izražal visoke ravni Mmp12, za makrofage specifične metaloproteinaze, in Gpnmb, negativnega regulatorja vnetja, ki naj bi spodbujal polarizacijo M2. To in grozd DC sta bila največja 2 in 6 tednov po poškodbi, ko je ledvica v reparativni fazi. Naša skupina je nedavno uporabila scRNA-seq v mišjem modelu R-UUO, pri katerem pride do regresije uveljavljene tubulointersticijske fifibroze, značilnega znaka kronične ledvične bolezni, po odpravi obstrukcije (10). Zanimivo je, da smo poročali tudi o grozdu makrofagov, ki je bil samo v ledvicah, ki so bile podvržene preobratu UUO; zanj je značilno tudi izražanje Mmp12 in čistilnih receptorjev, vključno z Gpnmb in Mrc1. Prej smo poročali o podobnem profagu Mmp121 mac v jetrih med razreševanjem bolezni jeter (37). Čeprav so bile te celice Mmp121 preslikane v makrofage v zbirki podatkov Immunological Genome Project, so bile morfološko podobne monocitom in so z imunofluorescenco izražale visoke ravni Ccr2, vendar nizke ravni F4/80. Poleg tega je njihov transkriptom najbolj povezan z monociti, ki se infiltrirajo v ledvico med okrevanjem po IRI. Ugotovili smo, da so monociti, pridobljeni iz kostnega mozga, ki so bili hranjeni s kolagenom, označenim s FITC, povečali izražanje Mmp12 in Gpnmb, kar kaže, da lahko fagocitoza kolagena povzroči izražanje teh markerjev.

Pri naši karakterizaciji mieloidnih celic pri poškodbi in popravljanju ledvic smo v modelu R-UUO identificirali nadaljnjih enajst podskupin mieloidnih celic, vključno z nekaterimi z novim fenotipom. To je bilo edinstveno doseženo z integracijo scRNA-seq na podlagi kapljic in plošč z indeksno povezavo za preslikavo podmnožic na vrata monocitov in makrofagov pri pretočni citometriji (10). Ugotovljeni so bili trije grozdi monocitov: patruljni in vnetni podtip ter edinstven "profibrotični" podtip, ki izraža Arg1 in je bil prisoten izključno na 2. dan UUO (faza akutne poškodbe). Te celice Arg11 so izražale markerje vnetnih monocitov Ly6C1, vključno s Ccr2 in F13a1, čeprav ne Ly6c2. Poleg tega se je pokazalo, da izražajo hipoksične, profibrotične in proinflamatorne gene, skupaj z geni, ki kodirajo komponente zunajceličnega matriksa in navzkrižne povezovalce zunajceličnega matriksa. Skupaj s številnimi pari ligand-receptor, razkritimi med monociti Arg11 in mezenhimskimi celicami, ti podatki kažejo, da bi celice Arg11 lahko izhajale iz rekrutiranih monocitov Ly6C1, ki se akutno aktivirajo proti profibrotičnemu fenotipu v hipoksičnem in vnetnem okolju poškodovane ledvice. Dejansko obstajajo valovi vdora monocitov med kronično napredujočo poškodbo ledvic (35).

Zanimivo je, da je v modelu ledvične poškodbe zaradi sepse podskupina makrofagov pokazala povečano izražanje Arg1 v kasnejših časovnih točkah po poškodbi, čeprav z markerji alternativne aktivacije makrofagov, kot je Mrc1 (38). Nadalje smo sledili usodi krožečih imunskih celic, rekrutiranih v ledvicah z uporabo parne izmenjave krvi. Ima prednosti pred parabiozo, ker donorske celice vztrajajo v velikem številu v krvnem obtoku relativno kratek čas, kar omogoča sledenje celic v več časovnih točkah po poškodbi ali med razreševanjem bolezni. S kombiniranjem parne izmenjave krvi, pretočne citometrije in psevdočasovnih analiz smo pokazali zgodnjo rekrutacijo donorskih monocitov v obstrukirano ledvico na 2. dan UUO; na 7. dan UUO so prešli na makrofage CCR2hi s transkriptomom, skoraj enakim rezidenčnim makrofagom. Drugo delo kaže, da so celice CCR21 škodljive: v modelu IRI z inaktivacijo CCR2 je prišlo do zmanjšanja širjenja ledvičnih makrofagov F4/80 in resnosti ledvične fifibroze (5). Treba je še ugotoviti, ali so te nove populacije prisotne na vseh stopnjah kronične ledvične bolezni; ali so na primer makrofagi Mmp121 prisotni na zgodnjih točkah poškodbe, kjer so endogeni mehanizmi za popravilo ledvic aktivni in se poskušajo popraviti, ali le, ko je prisoten brazgotin matriks brez stalnega dražljaja za poškodbe? Dhillon et al. (39) izvedli analizo scRNA-seq na zdravih in fibrotičnih mišjih ledvicah iz modela nefropatije folne kisline. Ugotovljenih je bilo štirinajst imunskih grozdov v primerjavi s samo petimi v njihovi prejšnji študiji (2), vključno z makrofagi, podskupinami DC (CD11b1/2, PDC), granulociti in limfociti. Druga študija je primerjala scRNA-seq in snRNA-seq na obstrukiranih (fibrotičnih) mišjih ledvicah na 14. dan UUO. Obe metodi sta imeli primerljivo odkrivanje genov; vendar je imela snRNA-seq v primerjavi s scRNA-seq zmanjšano disociacijsko pristranskost in z disociacijo povzročene transkripcijske stresne odzive (19).

Tu je bil identificiran en grozd makrofagov, čeprav so raziskovalci identificirali nov "dediferenciran" grozd proksimalnih tubulov, ki je izražal številne izločene proinflamatorne citokine, vključno s Ccl2, makrofagnim proliferativnim citokinom IL-34 in kemoatraktantoma nevtrofilcev Cxcl1 in Cxcl2. Ta študija spet kaže, da snRNA-seq ni tako sposoben kot scRNA-seq pri odkrivanju imunskih populacij v poškodovanih in vnetih ledvicah. Dejansko je ista skupina izvedla snRNA-seq na kriokonzerviranih vzorcih človeških diabetičnih ledvic (40). Ugotovljeno je bilo, da imajo diabetične ledvice povečano število levkocitov v primerjavi s kontrolnimi ledvicami, kot je bilo pričakovano. Odkriti so bili monociti, plazemske celice, celice T in celice B; vendar populacije makrofagov ni bilo, čeprav je vloga makrofagov pri sladkorni bolezni tipa 2 dobro dokumentirana (41). Raziskovalci so nadalje primerjali svoje diabetične vzorce z javno dostopnimi nizi podatkov PBMC, ker je bilo število levkocitov v kontrolnih vzorcih majhno. Povečane vnetne markerje so opazili pri infiltriranih diabetičnih CD141 monocitih in CD161 monocitih. Pred kratkim sta Kuppe et al. (42) so izdelali enocelični zemljevid človeške ledvice s poudarkom na razvoju tubulointersticija in fifibroze pri KLB. Vendar pa so bile v celicah CD102 (neproksimalne tubularne) razvrščene tri podvrste makrofagov, monociti, DC in mastociti, kot tudi celice NK, T in B. Raziskovalci so predlagali delovni model poti, vključenih v ledvično fifibrozo, vendar imunske celice, ki igrajo pomembno vlogo pri profibrotičnem signaliziranju, niso bile v tem modelu, čeprav so bile ujete. Študija, ki je dodatno razširila naše razumevanje imunskih celic v različnih patoloških stanjih, je opisala imunsko pokrajino človeških ledvic pri bolnikih z lupusnim nefritisom, pogostim zapletom sistemskega eritematoznega lupusa (43).

Vzorce ledvic bolnikov z lupusnim nefritisom in zdravih kontrolnih oseb smo analizirali z uporabo scRNA-seq. To je razkrilo enaindvajset imunskih grozdov, vključno s številnimi podskupinami mieloidnih celic v provnetnih odzivih in odzivih, ki odpravljajo vnetje: vnetni makrofagi CD161, fagocitni makrofagi CD161, tkivno rezidenčni makrofagi, M2-podobni CD161 makrofagi, cDC in pDC-ji. Makrofagi, ki živijo v tkivu, so bili prevladujoči grozd v zdravih ledvicah. Tudi mieloidne celice so vedno bolj priznane kot glavni akterji pri zavrnitvi presadka. Dangi et al. (18) so uporabili scRNA seq za seciranje prispevka podskupin mieloidnih celic k zavrnitvi ledvičnega presadka v mišjem modelu. Trinajst skupin je bilo identificiranih kot vrste imunskih celic, vključno z dvema podskupinama makrofagov, monociti, pDC, cDC in prehodno populacijo monocitov/makrofagov. Kot je bilo pričakovano, je bilo število celic v vseh skupkih imunskih celic največje pri zavrnitvenih ledvicah, sledile so tolerirane ledvice, pri naivnih ledvicah pa je bilo izrazito nižje in pogosto zanemarljivo. Grozd makrofagov je bil drugi najpogostejši za celicami T. Zanimivo je, da je bil med glavnimi geni, ki določajo skupine, Axl izključno izražen le z grozdi mieloidnih celic, ki infiltrirajo presadek, grozdi makrofagov 1 in 2, in grozdi makrofagov/monocitov, ne pa tudi nobeni drugi tipi celic. Ugotovljeno je bilo, da so makrofagi Axl11 znatno višji v zavrnjenih v primerjavi s toleriranimi ledvicami, Axl pa je spodbujal diferenciacijo vnetnih makrofagov znotraj presadka. V drugi študiji scRNA-seq, Wu et al. (32) so analizirali biopsijo alogenskega presadka ledvice prejemnika, ki je bil podvržen akutni zavrnitvi. Identificirali so dve različni populaciji monocitov, verjetno proinflamatorno in klasično ali vmesno, kar dodatno podpira vlogo mieloidnih celic pri zavrnitvi ledvic pri ljudeh.

Sklepi

V zadnjih nekaj letih je enocelična genomika (s scRNA-seq na čelu) raziskovalcem zagotovila novo eksperimentalno orodje za seciranje vlog in interakcij posameznih vrst celic pri zdravju in boleznih. Omogoča ponovno oceno našega razumevanja biologije mieloidnih celic v kompleksnih organih, vključno z vidiki celične ontogeneze, diferenciacije, homeostaze in obsega aktivacijskih stanj. To je še posebej pomembno pri ledvicah, kjer se heterogenost in plastičnost celic v mieloidnem predelu odražata v homeostatskih in bolezenskih pogojih. Integracija naborov podatkov iz ločenih poskusov z uporabo človeških vzorcev bo pomembna; ljudje smo genetsko heterogeni in imamo različno izpostavljenost okolju, zato je pridobivanje dovolj vzorcev lahko izziv. To tudi poudarja potrebo po nadaljnjem določanju prevedljivosti naših ugotovitev. Pričakuje se, da bo uporaba scRNA-seq v osnovnih in translacijskih raziskavah eksponentno rasla z nadaljnjim napredkom in standardizacijo eksperimentalnih in analitičnih metod.

za več informacij:ali.ma@wecistanche.com