Miricetin izboljša apoptozo in vnetje HUVEC, ki jih povzroči Ox LDL, prek LncRNA GAS5 Uravnavanje izražanja MiR 29a 3p

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

Ateroskleroza (AS) je pomemben vzrok obolevnosti in umrljivosti med srčno-žilnimi boleznimi, ki jo na začetku sproži endotelijska disfunkcija in je značilen dotok aterogenih lipoproteinskih komponent. Je glavni potencialni dejavnik večine smrtnih bolezni, kot so miokardni infarkt, nestabilna angina pektoris, nenadna srčna smrt in možganska kap. Čeprav je etiologija vpletena, je teorija odziva na poškodbo, da je poškodba vaskularnih endotelijskih celic (EC) začetni mehanizem AS, še vedno splošno sprejeta 3,4.OksidativnoLipoprotein nizke gostote (ox-LDL) je dokazano vpleten v nastanek ateroskleroze, njegova inducirana poškodba vaskularnega endotelija pa je ena od zgodnjih patogenez ateroskleroze. Zaenkrat nadzor nad razvojem AS ostaja velik izziv, ker molekularni mehanizmi AS niso popolnoma razumljeni. Zato je zmanjšanje poškodbe EC, ki jo povzroča oks-LDL, in nadaljnja razlaga njegovega mehanizma lahko potencialna strategija za preprečevanje in zdravljenje AS. Miricetin (Myr) je pogost naravni flavonoid, ki ga najdemo v številnih vrstah sadja, zelenjave in zelišč. Myr ima pomembno vlogo pri zdravljenju in preprečevanju nekaterih bolezni, vključno z diabetično osteoporozo, hepatocelularnim karcinomom8, alkoholiziranimi jetri³.,in kožni rak9,zaradi svoje močne sposobnosti keliranja železa,antioksidant in aktivnosti lovljenja prostih radikalov. Pred kratkim jekardioprotektivnovloga Myra je pritegnila pozornost raziskovalne skupnosti. Myr je pokazal zaščitni učinek na induciran lipopolisaharid (LPS).vnetni miokardnipoškodba, srcehipertrofija, in z ishemijo/reperfuzijo(I/R) povzročeno poškodbo miokarda3. Vendar pa učinek zdravila Myr na presnovo lipidov in aterosklerozo ni popolnoma razumljen.

Za več informacij kliknite tukaj

Materiali in metode

Celična kultura, model poškodbe, ki jo povzroča ox-LDL, in proliferacija.

Človeške endotelijske celice popkovnične vene (HUVEC) iz celične banke Kitajske akademije znanosti (Šanghaj, Kitajska) so gojili v DMEM, dopolnjenem z 10 odstotki FBS podnormoksičenpogoji pri 37 stopinjah. HUVEC so bili obdelani z različnimi koncentracijami（50,100,200 ug/ml）ox-LDL（Union-Bio tehnologija,Kitajska）in so bili zbrani po 24 urah za nadaljnje meritve. V skladu z navodili proizvajalca so bile stopnje proliferacije celic izmerjene s testom CCK8 (Solarbio, Kitajska).

Cistanche lahko izboljša imuniteto

Analiza apoptoze s pretočno citometrijo z dvojnim obarvanjem s PI in aneksinom V.

Apoptozo celic so ovrednotili s pretočno citometrijo z uporabo PI in kompleta za dvojno obarvanje apoptoze z aneksinom V (Solarbio, Kitajska) po navodilih proizvajalca.

Merjenje reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS). Znotrajcelični ROS je bil določen s kompletom ROS Assay Kit（Beyotime,Kitajska）. Na kratko,celice smo inkubirali z 10 μM DCHF-DA 20 minut, nato pa smo ocenili intenzivnost fluorescence pod bralnikom mikroplošč.

RNK imunoprecipitacijski (RIP) test.

RIP je bil izveden z uporabo Magna RIP Kit (Millipore, ZDA) v skladu s protokolom proizvajalca18. Na kratko, celice HUVEC smo zbrali in lizirali v popolnem pufru za lizo RIP. Celocelični beljakovinski ekstrakt je bil nato inkubiran s pufrom RIP, ki je vseboval magnetne kroglice, konjugirane s človeškim protitelesom proti AGO2 ali negativnim kontrolnim normalnim mišjim IgG. Pridobljena RNA je bila nato odkrita s qRT-PCR.

Test fluorescenčne in situ hibridizacije RNA (FISH). Posebne sonde za zaporedje GAS5 in miR-29a-3p je oblikoval in sintetiziral RiboBio. Za zaznavanje signalov sonde v skladu z navodili proizvajalca je bil uporabljen komplet FISH Kit (RiboBio). Jedra so bila obarvana z DAPI.

Dvojni luciferazni reporterski test. Za odkrivanje interakcije med GAS5 in promotorsko regijo miR-29a-3p je bil uporabljen reporterski test dvojne luciferaze.

Zasnovane in sintetizirane so bile divje in mutacijske sekvence veznih mest (WT-GAS5 in MUT-GAS5). Celice HUVEC so bile transfektirane v kombinaciji z vektorjem WT(Mut)GAS5 in miR-NC ali miR-29a-3p z uporabo Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen). Po 48 urah transfekcije smo za izvedbo testa luciferaze uporabili dvojni luciferazni reporterski testni sistem (Promega).

Določitev VCAM-1, IL-6 in MCP-1.

Ravni supernatantne monocitne kemoatraktne beljakovine-1(MCP-1), interlevkina-6 (IL-6) in vaskularne celične adhezijske molekule 1 (VCAM{{6} }) so bili določeni s kompleti ELISA. IL-6 komplet ELISA (ab178013), MCP-1 komplet ELISA (ab179886) in VCAM-1 komplet ELISA (ab223591) so bili uporabljeni v skladu z navodili proizvajalca navodila.

Kvantificirana PCR v realnem času (gRT-PCR).

Celotno RNA smo izolirali z reagentom Trizol (Takara Bio Inc., Japonska）v skladu s protokolom proizvajalca. cDNA je nastala iz celotne RNA（2 ug）s kompletom za reverzno transkripcijo cDNA (Applied Biosystems, ZDA) in PCR v realnem času, ki temelji na SYBR, je bil izveden za odkrivanje celotnih transkriptov mRNA na hitrem sistemu PCR v realnem času Applied Biosystems(ABI)7300. Zaporedja primerjev so bila navedena spodaj.

Western blot test.

Ekspresija beljakovin Bax, Bcl-2, kaspaze3, CD31, SM22a, p-p65, p65, p-IkBa, IkBa in TLR4 je bila izmerjena z Western blottingom. Vzorce beljakovin, izolirane iz celic HUVEC (25 ug)), smo ločili s pomočjo SDS-PAGE in jih nato premaknili na membrano iz poliviniliden fluorida (PVDF) (Millipore, ZDA), pri čemer smo jih testirali z GAPDH (#2118, 1:5000, Cell Signaling), Bax (#2772S,1:1000, celično signaliziranje), Bcl-2 (#15071S,1:1000, celično signaliziranje),caspase3(#9662S,1:1000, celično signaliziranje), CD31 (ab9498,1:1000) , Abcam), SM22a (ab14106,1:1000,Abcam),p-p65 (10745-1-AP 1:1000, Proteintech), p65 (66535-1-Ig,1:1000,Protein-tech), protitelesa p-IkBa(10268-1-AP,1:1000, Proteintech),IkBa(66418-1-Ig,1:1000, Proteintech) in TLR4(66350-1-Ig, 1:1000, Proteintech) sledi ustrezno sekundarno protitelo. Vsi Western bloti so bili ponovljeni vsaj trikrat. Končno je bila ekspresija proteina vizualizirana z izboljšanim kemiluminescenčnim (ECL) sistemom.

Imunofluorescenčni test.

Celice, gojene na preparatih, so bile fiksirane, permeabilizirane, blokirane in čez noč imunsko obarvane s protitelesi CD31(ab9498, 1:200, Abcam) in SM22a (ab14106,1:200, Abcam). Po izpiranju so bila specifična druga protitelesa IgG, označena s FITC, neprekinjeno inkubirana s celicami. Nazadnje so bile slike pridobljene pod mikroskopom (Olympus, Japonska) z ustrezno povečavo.

Statistična analiza. Vsi rezultati so prikazani kot povprečje ± standardna napaka povprečja (SEM). Statistično pomembne rezultate smo določili z enosmerno ANOVA, ki ji je sledil Student-Newman-Keuls(SNK)q test. P-vrednost<0.05 was="" considered="" to="" be="">

Rezultati

Miricetin oslabi apoptozo, ki jo povzroča oks-LDL, in ROS v HUVEC.

Prvič, 24-urna inkubacija s 100 ug/ml ox-LDL je povzročila znatno, od odmerka odvisno zmanjšanje viabilnosti celic. Predhodna obdelava z l uM Myr za 2 uri ni imela pomembnega vpliva na sposobnost preživetja celic. Vendar,2,5 in 5 μM Myr je povzročilo znatno zmanjšanje viabilnosti celic (sl. 1A in B). Poleg tega smo opazili, da je Myr zmanjšal povečanje ROS, ki ga povzroča ox-LDL v HUVEC (slika 1C). Preučili smo tudi učinek zdravila Myr na apoptozo. Poleg tega sta pretočna citometrija in rezultat proteina, povezanega z apoptozo, razkrila tudi, da je apoptoza HUVEC, ki jo povzroči 100 ug/ml ox-LDL, močno spremenila celice, predhodno obdelane z MYR (sl. 1D in E), odvisno od odmerka.

Miricetin zavira vnetni odziv in EndMT v celicah HUVEC, ki jih povzroči ox-LDL. Imunofluorescenčno barvanje je pokazalo, da je inkubacija HUVEC z ox-LDL zmanjšala izražanje endotelijskega markerja CD31 in povečala izražanje mezenhimskega markerja SM22a, kar kaže, da stanje ox-LDL sproži EndMT. Vendar te učinke ublaži MYR. Western blot je dosledno pokazal, da je Myr oslabil povečano raven proteina SM22a v HUVEC, inducirano z ox-LDL (slika, 2A in B). V prisotnosti ox-LDL so ravni mRNA IL-6, MCP{{ 11}}, VCAM-1 so bile očitno regulirane navzgor v HUVEC, medtem ko je zdravljenje z Myr obrnilo te nenormalne spremembe (slika 2C). Prav tako so bili podobni rezultati nadalje potrjeni z ELISA (slika 2D).

Prekomerna ekspresija GAS5 oslabi zaščitne učinke miricetina proti HUVEC iniur, ki ga posreduje ox-LDL.

Nadalje smo odkrili izražanje GAS5 v HUVEC z gRT-PCR. Kot je prikazano na sliki 3A, so opazili znatno višjo raven GAS5 v skupini ox-LDL kot v kontrolni skupini. V nasprotju s tem se je raven mRNA GAS5 zmanjšala v skupini, zdravljeni z Myr, na način, odvisen od odmerka. Ti podatki so pokazali, da bi lahko GAS5 sodeloval pri učinku Myr na endotelne celice. Da bi razumeli mehanizme, s katerimi bi lahko GAS5 sodeloval pri zaščitnem učinku Myr, smo uporabili pcDNA-GAS5 za prekomerno izražanje izražanja GAS5 v HUVEC. Ekspresija GAS5 je bila okrepljena s pcDNA-GAS5, ki je bila sprva zmanjšana z Myr v HUVEC, ki jih povzroča vol-LDL (slika 3B). Nadaljnji poskusi so pokazali, da se je sposobnost preživetja celic HUVEC s prekomerno ekspresijo GAS5 znatno zmanjšala in da je bila apoptoza izrazito povečana pri zdravljenju z Myr (sl. 3C in D). Poleg tega je prekomerna ekspresija GAS5 v HUVEC, zdravljenih z ox-LDL, pokazala višjo vsebnost ROS v primerjavi z ujemajočo se kontrolo (slika 3E). Ti podatki kažejo, da uravnavanje izražanja GAS5 oslabi zaščitne učinke Myr pred poškodbo HUVEC, ki jo povzroča oks-LDL.

miR-29a-3p je tarča GAS5 v HUVEC.

Ciljni GAS5 je bil identificiran prek RegRNA 2.0 in star-Base, rezultati iskanja so bili prikazani na sliki 4A. Med temi miRNA je bil miR-29a-3p najpomembnejše zmanjšanje poškodbe HUVEC, ki jo povzroča oks-LDL (slika 4B). Opravljene so bile bioinformatične analize za napovedovanje veznih regij med GAS5 in miR-29a-3p (slika 4C). Za potrditev te bioinformatske napovedi so testi reporterskega gena dvojne luciferaze pokazali, da GAS5-WI predstavlja nižjo aktivnost luciferaze kot ustrezna skupina MUT, kar potrjuje vezno razmerje med GAS5 in miR-29a-3p (slika 4D). Medtem je bila raven GAS5, obogatena z Ago2 RIP, višja v celicah, transficiranih z miR-29a-3p, kot tista v skupini miR-NC (slika 4E). Medtem je analiza FISH v celicah HUVEC pokazala, da je bil GAS5 lokaliziran skupaj z miR-29a-3p predvsem v jedru (slika 4F). Te ugotovitve kažejo, da GAS5, ki cilja na miR-29a-3p.

miR-29a-3p posnemalci so rešili učinke GAS5 pri HUVEC, povzročenem z volovim LDL, zdravljenim z miricetinom.

Kot je prikazano na sliki 5A, je bila ekspresija miR-29a-3p znatno povečana v ox-LDL plus Myr plus pcDNA-GAS5 plus miR-29a-3 p posnemajo skupino v primerjavi z ox-LDL plus Myr plus pcDNA-GAS5 plus mimic kontrolno skupino (slika 5A). Poleg tega je reguliran GAS5 znatno povečal sposobnost preživetja HUVEC, ki jih povzroča ox-LDL, zdravljenih z Myr, medtem ko kotransfekcija pcDNA-GAS5 in miR-29a-3p posnema v HUVEC, te učinke odpravi (slika 5B). Poleg tega sta proizvodnja ROS in apoptoza v ox-LDL povzročili HUVEC, zdravljene z Myr po čezmerni ekspresiji GAS5, medtem ko miR-29a-3p posnema te učinke nevtralizira (sl. 5C in D).

Posnemalci sh-GAS5 ali miR-29a-3p lahko pospešijo zaščitno vlogo miricetina v celicah HUVEC, ki jih povzroči oks-LDL.

Da bi raziskali, ali sta GAS5 in miR-29a-3p vključena v regulativni mehanizem, ki ga posreduje Myr, so HUVEC transfektirali z NC, sh-GAS5 mimics control, miR-29a{{7} }p posnema. Ekspresija GAS5 se je znatno zmanjšala v skupini sh-GAS5 v primerjavi s skupino NC (slika 6A). Po transfekciji sta ox-LDL in Myr povečala sposobnost preživetja v primerjavi s skupino ox-LDL, inhibicija GAS5 ali navzgor reguliranega miR-29a-3p pa je povečala sposobnost preživetja HUVEC, ki jih povzročajo ox-LDL, zdravljenih z Myr (slika 6B). Poleg tega je Myr zadržal celično apoptozo, ki jo je povzročil ox-LDL, ki je bil nato spremenjen s posnemalci sh-GAS5 in miR-29a-3p (slika 6C). Poleg tega se je povečala raven beljakovin CD31 in SM22a

Miricetin je inaktiviral signalno pot TLR4/NF-KB v HUVEC, zdravljenem z ox-LDL, tako da je znižal GAS5 ali povečal miR-29a-3p. Signalna pot TLR4/NF-KB je tesno vključena v proces AS. Da bi raziskali, ali je Myr zaviral signalno pot TLR4/NF-B, so TLR4 in več osrednjih proteinov na nižji stopnji, npr. p-p65, p65, p-IkBa, IkBa in TLR4, identificirali v celicah HUVEC z Western blotom. analizo. Slika 6 kaže, da je Myr zmanjšal izražanje p-p65, p-IkBa in TLR4 v primerjavi s skupino ox-LDL, medtem ko je raven beljakovin p-p65, p-IkBa. in TLR4 sta bila zmanjšana v skupinah, ki posnemajo ox-LDL plus Myr plus sh-GAS5 in ox-LDL plus Myr plus miR-29a-3p v primerjavi s skupino ox-LDL plus Myr (slika 7) . Ti rezultati skupaj kažejo, da je lahko pot GAS5/miR-29a-3p/TLR4/NF-KB eden od osnovnih mehanizmov, prek katerih je Myr zmanjšal vnetje celic HUVEC in EndMT. Diskusija

AS je trdovratno vnetno stanje, ki se začne z odlaganjem in kopičenjem lipoproteinov nizke gostote v steni arterije19. Kljub izjemnemu napredku v osnovnih in znanstvenih študijah je še vedno med vodilnimi vzroki smrti na svetu2. V tej študiji smo raziskali molekularni mehanizem Myr na poškodbe HUVEC, ki jih povzroči oks-LDL, in razkrili ključno vlogo lncRNA GAS5 v tem dogodku. Naši rezultati so pokazali, da Myr uravnava viabilnost celic HUVEC, ROS, apoptozo, vnetje in EndMT prek poti GAS5/miR-29a-3p/TLR4/NF-KB, kar pojasnjuje nov mehanizem Myr na ščiti pred AS.

Pokazalo se je, da Ox-LDL inducira okrepljeno generiranje ROS, ki ima ključno vlogo pri napredovanju AS. Precejšnji dokazi kažejo, da ima povečan oksidativni stres pomembno vlogo v patogenezi vaskularne endotelne disfunkcije skupaj z EndMT endotelijskih celic, vnetjem in apoptozo. Uporabili smo HUVEC, stimulirane z ox-LDL, za simulacijo pojava zgodnje ateroskleroze, vnetni odziv in EndMT HUVEC pa sta se povečala, Myr pa je znatno zaviral vnetni odziv in EndMT na HUVEC, stimulirane z ox-LDL. Znano je, da ima Myr antioksidativne citoprotektivne učinke v različnih celicah, vključno s celično linijo HUVEC21. Prejšnja študija je pokazala, da je Myr pokazal proliferativne in anti-apoptotične učinke pri poškodbi celic kardiomiocitov H9c2, ki jo povzroči LPS2. V tej raziskovalni študiji smo preverili rezultate zdravila Myr na različici aterosklerotičnih celic, ki jih povzroča oks-LDL. Naši rezultati so pokazali, da lahko predhodna obdelava s 5 μM Myr znatno obrne znižano regulacijo celične viabilnosti v HUVEC, ki jo povzroča ox-LDL. Naši rezultati so pokazali, da bi lahko terapija z ox-LDL reklamirala vnetje in EndMT HUVEC z uravnavanjem CD31, SM22a in vnetnih citokinov (IL-6, MCP-1, VCAM-1), ki se lahko obrne s predhodnim zdravljenjem z zdravilom Myr. Več elementov je pokazalo, da vnetje in EndMT spremljata aterosklerozo23. Prejšnja študija je pokazala, da je zaviranje izražanja VCAM-1 in ICAM-1 priznano kot bistvena strategija proti aterosklerozi24. Poleg tega je cepivo zaviralo endotelijski EndMT, ki ga povzroča oks-LDL, z znižanjem endotelijskega markerja CD31 in zvišanjem mezenhimskega markerja SM22a25. Naše ugotovitve se precej ujemajo s temi raziskavami.

Izražanje GAS5 je bilo močno izraženo v človeških in živalskih modelih 26, 27. V tej študiji smo ugotovili, da je bil GAS5 reguliran navzgor, miR-29a-3p pa znižan pri poškodbi HUVEC, ki jo povzroča ox-LDL . Moje zdravljenje lahko obrne te učinke. Prejšnja študija je pokazala, da je Mvr zaviral izražanje HMGB1, TLR4 in MyD88 v nevronih ter obnovil nevronske poškodbe in vnetja, ki jih je povzročila aktivacija signalnih poti NF-KB in MAPK*8. V tej študiji je povečana regulacija lncRNA GAS5 in znižana regulacija miR-29a-3p je povzročila zmanjšanje celične apoptoze, vnetja in EndMT ter zmanjšanje aktivnosti signalne poti TLR4/NF-KB. Po naših ugotovitvah Myr zmanjša p-p65, p-IkBa in TLR4 v HUVEC z uravnavanjem GAS5/miR-29a-3p, ki zmanjšuje vnetni odziv in EndMT pri poškodbah HUVEC, ki jih povzroča oks-LDL. Nazadnje je naša raziskovalna študija razkrila, da je Myr sposoben izboljšati celično apoptozo, celično vnetje in EndMT prek poti GAS5/miR-29a-3p/TLR4/NF-KB (slika 8), kar nakazuje Myr kot potencialno terapevtsko sredstvo za AS. Poleg tega je bilo predlagano, da je GAS5 obetavna ciljna molekula, ki vključuje patofiziološke procese AS.

Reference

1. Kondapalli, L., Bottinor, W. & Lenneman, C. Ali s sproščanjem zavor z imunoterapijo pospešujemo aterosklerozo?.

Naklada 142(24), 2312-2315(2020).

2. Libby, P.Ridker, PM& Hansson, GKProgress in izzivi pri prevajanju biologije ateroskleroze. Narava 473 (7347),

317-325 (2011).

3. Couto, NF et al. Spremembe OxLDL v dinamiki membrane endotelijskih celic povzročijo spremembe v prometu veziklov in povečajo

dovzetnost celic za poškodbe.Biochim.Biophys.Acta Biomembranes 1862,183139 (2019).

4. Yamagata, K. Zaščitni učinek epigalokatehin galata na endotelne motnje pri aterosklerozi. J. Cardiovasc. Pharmacol.75,

292-298(2019).

5. Gao, S. & Liu, J. Povezava med krožečim oksidiranim lipoproteinom nizke gostote in aterosklerotično srčno-žilno boleznijo.

Kronična dis. prevod Med. 3(2), 89-94 (2017).

6. Torisu,K. et al. Za vzdrževanje homeostaze vaskularnih lipidov je potrebna nepoškodovana endotelna avtofagija. Staranje celice 15 (1), 187-191 (2016).

7. Pan, X. et al. Aktivacija signala Nrf2/HO-1 z miricetinom za zmanjšanje razgradnje ECM v človeških hondrocitih in izboljšanje mišičnega osteoartritisa. Int. Imunofarmakol. 75,105742 (2019).

8. Li, M. et al. Miricetin zavira širjenje hepatocelularnega karcinoma z znižanjem izražanja YAP. Celice 8(4),

358(2019).

9. Guo, C. et al. Miricetin izboljša z etanolom povzročeno kopičenje lipidov v jetrnih celicah z zmanjšanjem biosinteze maščobnih kislin. Mol

Nutr. Food Res. 63 (14), e1801393 (2019).