Nevroprotektivne koristi vadbe in MitoQ na spominsko funkcijo, mitohondrijsko dinamiko, oksidativni stres in nevrovnetje pri starajočih se podganah, povzročenih z D-galaktozo, 2. del

2.6. Priprava tkiva

Po zaključku 8 tednov TE in vedenjskih testov spomina so bile vse podgane evtanazirane z vdihavanjem CO2 in 7 živalim v vsaki zdravljeni skupini so bila odvzeta možganska tkiva.

Test obnašanja spomina je učinkovito orodje za ocenjevanje spomina. Z naraščajočim družbenim in delovnim pritiskom postaja spomin ljudi vse pomembnejši. Zato nam lahko opravljanje testa obnašanja spomina pomaga razumeti našo raven spomina in sprejeti učinkovite ukrepe za izboljšanje in vzdrževanje spomina glede na rezultate testa.

Natančneje, vedenjski testi spomina lahko ocenijo sposobnost ljudi za sprejemanje, obdelavo, shranjevanje in pridobivanje informacij. S testiranjem različnih vrst informacij, kot so jezik, številke, slike itd., je mogoče v celoti preizkusiti spomin ljudi. Rezultati testa bodo zagotovili različne rezultate, ki nam bodo pomagali razumeti naše slabosti in prednosti ter kako okrepiti svoj spomin.

V praksi številni testi obnašanja spomina nudijo tudi strokovne nasvete in predloge. Na primer, dober spanec, uravnotežena prehrana, ustrezna vadba in redne možganske vaje so koristni za izboljšanje spomina ljudi. S temi metodami lahko povečamo čas zadrževanja spomina, sposobnost reprodukcije spomina in druge vidike, da se bolje prilagodimo vsakodnevnim življenjskim ali delovnim potrebam.

Skratka, test obnašanja spomina je zelo uporaben za razumevanje, ocenjevanje in izboljšanje spomina. Prav tako bi morali sprejeti ustrezne metode za krepitev našega spomina glede na naše dejansko stanje, da bi postavili trdne temelje za bolj izpolnjeno in bogato življenje. Razvidno je, da moramo izboljšati spomin in Cistanche lahko bistveno izboljša spomin, saj je Cistanche tradicionalna kitajska medicina s številnimi edinstvenimi učinki, eden izmed njih je izboljšanje spomina. Učinek Cistanche izvira iz različnih aktivnih sestavin, ki jih vsebuje, vključno s taninsko kislino, polisaharidi, flavonoidnimi glikozidi itd. Te sestavine lahko na različne načine spodbujajo zdravje možganov.

Kliknite Spoznaj kratkoročni spomin, kako izboljšati

Po ločitvi možganske skorje in hipokampusa je bilo možgansko tkivo hitro zamrznjeno v tekočem dušiku in do analize shranjeno pri –80 ◦C. Preostalih 5 živali je bilo uporabljenih za imunohistokemijsko (IHC) analizo.

Po odprtju torakalne votline smo 50 mM fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS) 10 minut prevajali skozi levi prekat, nato pa smo žival perfundirali s 4% paraformaldehidom (PFA) v 100 mM PBS.

Po perfuzijski fiksaciji smo možgane pobrali, dali v 4 % PFA in fiksirali 4 ure pri 4 °C. Fiksirano možgansko tkivo smo za 2 dni potopili v 30 % raztopino saharoze in nato s kriostatom narezali na 40 µm debele rezine ( Leica Microsystems, Nussloch, Nemčija).

2.7. Izolacija mitohondrijev

Za izolacijo mitohondrijev smo uporabili komplet za ekstrakcijo mitohondrijev (IMGENEX Corporation, San Diego, CA, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Za vsakih 100 mg tkiva hipokampusa je bil dodan 1 mL homogenizacijskega pufra.

Po homogenizaciji smo tkivo centrifugirali pri 900× g 10 minut pri 4 ◦C, supernatant pa zbrali in ponovno centrifugirali pri 15,000× g 30 minut pri 4 ◦C.

Po centrifugirani citosolni frakciji smo ločili citosol in preostalo peleto temeljito premešali v 1 mL suspenzijskega pufra, preden smo centrifugirali pri 15, 000 × g 10 minut pri 4 ◦C.

Supernatant smo odstranili in dodali še 1 ml suspenzijskega pufra pred temeljitim mešanjem in ponovnim centrifugiranjem pri 15,{2}}× g 10 minut pri 4 ◦C.

Supernatant smo odstranili in preostalo peleto raztopili v 1 ml pufra za popolno mitohondrijsko lizo 30 minut pri 4 °C. Mitohondrijski ekstrakt smo nato centrifugirali pri 15,000× g 5 minut pri 4 °C in zbrali supernatant (mitohondrijsko frakcijo).

2.8. Western Blotting
Skupni protein, dobljen z izolacijo mitohondrijev, je bil kvantificiran z uporabo Bradfordove metode. Enako količino mitohondrijskih proteinov (30 µg na stezo) smo naložili v elektroforezo v natrijevem dodecil sulfatu in poliakrilamidnem gelu (SDS-PAGE) (8 % ali 12 %).

Po elektroforezi smo proteine ​​prenesli na membrano iz poliviniliden fluorida (PVDF) (Millipore, Boston, MA, ZDA).

Blokiranje je bilo izvedeno 1 uro pri sobni temperaturi z uporabo 1 × tris-pufrane fiziološke raztopine, ki je vsebovala raztopino Tween-20 (TBS-T) s 5 % BSA, nato pa je membrana reagirala s primarnimi protitelesi čez noč pri 4 °C.

Uporabljena so bila naslednja primarna protitelesa: Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p22 phox, p47 phox, gp91phox, SOD-2, katalaza in -aktin (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, ZDA, razredčitev:1 :1000); in TNF- (Abcam, Cambridge, UK, razredčitev: 1:1000).

Membrane smo nato sprali s pralnim pufrom (PBS z 0,1 % Tween 20), nato pa jih inkubirali s kozjimi protikunčjimi sekundarnimi protitelesi za p22 phox, gp91 phox in TNF, konjugiranimi s hrenovo peroksidazo (HRP). - (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA, razredčitev: 1:5000).

HRP konjugirana kozja protimišja sekundarna protitelesa so bila uporabljena za Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p47 phox, SOD-2, katalazo in -aktin (Santa Cruz Biotechnology, razredčitev: 1:5000).

Stopnje izražanja beljakovin so bile odkrite z uporabo ECL Western blotting detekcijskega sistema (Santa Cruz Biotechnology). Gostoto razvitih proteinskih pasov smo analizirali z uporabo gelskega slikovnega sistema ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, ZDA).

2.9. Imunohistokemija (IHC)
Za analizo IHC je bila za izbrano tkivo v vsaki zdravljeni skupini uporabljena metoda prostega lebdenja. Po izpiranju tkiva 3× 10 min vsakega v 0.01 M PBS, je bilo tkivo inkubirano pri 80 ◦C 60 minut v čaši, ki je vsebovala 0,01 M natrijevega citrata, čemur je sledila blokada v 10 % normalni oslovski serum (Millipore Sigma, Burlington, MA, ZDA).

Vzorec tkiva je nato reagiral s primarnimi protitelesi anti-p22 phox (Santa Cruz Biotechnology, razredčitev: 1:500) in anti-Glial fibrillary acidic protein (GFAP) (Abcam, razredčina:1:500) 12 h pri 4 ◦C. Naslednji dan je bilo tkivo sprano 3 × 5 minut vsakokrat v 0, 01 M PBS in nato reagiralo s HRP-konjugiranim kozjim protimišjim sekundarnim protitelesom (Santa Cruz Biotechnology, razredčitev: 1: 5000) pri sobni temperaturi 2 uri.

Končno je bilo tkivo inkubirano pri sobni temperaturi z uporabo raztopine Vectastain-Elite ABC kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, ZDA), rezultati pa so bili vizualizirani z uporabo DABPeroxidase Substrate Kit (Vector Laboratories).

Vsaka rezina tkiva je bila nameščena na stekelcu z uporabo pritrdilnega medija (Vector Laboratories) in pregledana s svetlobnim mikroskopom (Leica Microsystems).

2.10. Statistične analize

Podatki so bili analizirani s programom SPSS za Windows različice 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, ZDA). Vse vrednosti so izražene kot povprečje ± SEM. Statistična pomembnost je bila določena z uporabo enosmerne ANOVA. Za večkratne primerjave so bili uporabljeni Bonferronijevi post hoc testi. Razlike so veljale za statistično značilne pri p < 0,05.

3. Rezultati

3.1. Učinki vadbe na tekalni stezi in MitoQ na izražanje proteinov, povezanih z mitohondrijsko dinamiko, v hipokampusu starajočih se podgan, ki jih povzroča D-Gal

Preverili smo, da sta TE in MitoQ vplivala na faktorje, povezane z mitohondrijsko fuzijo (Mfn1, Mfn2, Opa1) in faktorje, povezane s fisijo (Drp1, Fis1) v hipokampusu starajočih se podgan (slika 1).

Stopnje izražanja faktorjev, povezanih z mitohondrijsko fuzijo, so se znatno razlikovale med zdravljenimi skupinami (Mfn1, F4,34=134.750, p < 0.001; Mfn2, F4,34=80). 816, p < 0,001; Opa1, F4, 34=51.456, p=0.001).

Ravni izražanja dejavnikov, povezanih z mitohondrijsko fisijo, so se prav tako pomembno razlikovale med zdravljenimi skupinami (Drp1, F4,34=53.448, p < 0.001; Fis1,F4,34=116 0,313, p < 0,001). Rezultati post hoc testa so prikazani na sliki 1.

V primerjavi s skupino Y-CON se je izražanje dejavnikov, povezanih z mitohondrijsko fuzijo, zmanjšalo v skupini D-CON in pokazalo naraščajoče trende v skupinah D-TE, D-MI in D-COMBI.

Po drugi strani se je izražanje faktorja Drp1, povezanega z mitohondrijsko fisijo, povečalo v skupini D-CON v primerjavi s skupino Y-CON. Medtem ko so bili signali mitohondrijske cepitve zmanjšani s kombiniranim zdravljenjem s TE, samo zdravljenje z MitoQ ni povzročilo pomembne spremembe.

Drugi faktor, povezan z mitohondrijsko fisijo, Fis1, je pokazal enake trende upadanja kot Drp1, vendar se je tudi zmanjšal samo z zdravljenjem z MitoQ.

Slika 1. Učinek vadbe na tekalni stezi in mitokinona (MitoQ) na izražanje proteinov, povezanih z mitohondrijsko dinamiko, v hipokampusu starajočih se podgan, ki jih povzroča D-galaktoza (D-gal). (A) Reprezentativni Western bloti mitohondrijske fuzije in proteinov, povezanih s fisijo. (B–F) Denzitometrična analiza Western blot trakov, normaliziranih na -aktin. Podatki, prikazani v Western blotu, so povprečja iz sedmih podganjih možganov.

-Aktin je bil testiran kot notranja kontrola. Bonferronijev post hoc test je bil uporabljen po ANOVA. Vrednosti so srednje vrednosti ± SEM.

a Označuje statistično razliko od skupine mlade kontrolne skupine (Y-CON). b Označuje statistično razliko od skupine D-galaktoze (D-CON). c Označuje statistično razliko od skupine D-galaktoza in vadba na tekalni stezi (D-TE).

d Označuje statistično razliko od skupine D-galaktoze in MitoQ (D-MI) (p < 0,05). D-KOMBI; D-galaktoza plus TE in skupina MitoQ.

3.2. Učinki vadbe na tekalni stezi in MitoQ na izražanje podenot NADPH oksidaze v možganski skorji in hipokampusu starajočih se podgan, ki jih povzroča D-Gal

Med zdravljenimi skupinami smo opazili pomembne razlike v imunoreaktivnosti p22 foksa v možganski skorji in hipokampusu starajočih se podgan (slika 2) (CA3,F4,24=18).786, p < 0.{{11 }}01; korteks, F4, 24=12.662, p < 0,001).

V korteksu so skupine D-CON pokazale povečano imunoreaktivnost p22 foxa v primerjavi s skupino Y-CON, ki se je znatno zmanjšala v skupinah D-TE, D-MI in D-COMBI.

Pri CA3 se je povečana imunoreaktivnost p22 phox zmanjšala v skupinah D-TE in D-COMBI v primerjavi z D-CON. Stopnje izražanja beljakovin podenot NOX p22 phox, gp91 phox in p47phox so se med skupinami pomembno razlikovale (p22 phox, F4, {{10}}.513, p < 0.{{24} }01; gp91 phox, 34=57.282, p < 0,001; p47 phox, 34=69.249, p < 0,001).

Rezultati posthoctest testa so pokazali znatno povečanje ravni podenote NOX v D-CON v primerjavi z Y-CON. Vendar so bile ravni podenot NOX nižje v vseh intervencijskih skupinah v primerjavi s skupino D-CON.

Zlasti se je izražanje p22 phox in gq91 phox znatno zmanjšalo v D-TE v primerjavi s skupino D-MI. Te ugotovitve kažejo, da vadba in MitoQ posamično preprečujeta oksidativni stres v možganih, ki ga povzroča staranje, vendar njuna kombinacija ne povzroči dodatnih učinkov.

Slika 2. Učinki vadbe na tekalni stezi in MitoQ na izražanje podenot NADPH oksidaze v možganski skorji in hipokampusu starajočih se podgan, ki jih povzroča D-gal. (A1) Fotomikrografije, ki prikazujejo NAPDH p22 fox imunoreaktivnost v možganski skorji in hipokampusu starajočih se podgan, ki jih povzroča D-gal, v vsaki skupini. Črni pravokotniki v A1 označujejo del slik, kot je prikazano v f–i in p–t. (A2, A3) Kvantifikacija optične gostote NADPH p22 fox obarvanja v možganski skorji in hipokampusu.

Bonferronijev post hoc test po ANOVA. Vrednosti so predstavljene kot srednje vrednosti ± SEM (n=5 živali). (a–e in k–o) Merilo=100 µm, (f–j in p–t) Merilo=50 µm. (B) Reprezentativne slike Western blot za podenote NADPH oksidaze v hipokampusu.

(C–E) Kvantifikacija podenot NADPH oksidaze v hipokampusu. Podatki, prikazani v Western blotu, so bili povprečja iz sedmih podganjih možganov. -Aktin je bil testiran kot notranja kontrola. Bonferronijev post hoc test je bil uporabljen po ANOVA. Vrednosti so srednje vrednosti ± SEM.

a Označuje statistično razliko od skupine Y-CON. b Označuje statistično razliko od skupine D-CON. c Označuje statistično razliko od skupine D-TE. (p < 0.05).

3.3. Vpliv vadbe na tekalni stezi in MitoQ na izražanje GFAP v možganski skorji in hipokampalnem zobatem girusu starajočih se podgan, ki jih povzroča D-Gal

Opazili smo pomembne razlike med zdravljenimi skupinami v imunoreaktivnosti GFAP v možganski skorji in hipokampalnem zobatem girusu (DG) starajočih se podgan (slika 3) (Skorja, F4, 24=13).524, p < 0.001 ; DG, F4, 24=30.364).

Rezultati post hoc testa so pokazali, da je zdravljenje z D-gal znatno povečalo imunoreaktivnost GFAP v korteksu in DG.

V primerjavi s skupino D-CON so bile ravni GFAP v skorji znižane v vseh intervencijskih skupinah, ravni GFAP v DG pa so bile znižane v skupinah D-TE in D-COMBI, medtem ko je skupina D-MI pokazala razlike samo v imunoreaktivnosti GFAP v predelu korteksa.

Čeprav je torej zdravljenje s TE ali MitoQ zmanjšalo z D-gal povzročeno nevroinflamacijo v korteksu, je le intervencija TE povzročila pozitivne učinke pri DG.

For more information:1950477648nn@gmail.com