NGF uravnava presnovo holesterola in spodbuja izločanje ApoE v celicah glije, kar zagotavlja nevroprotekcijo pred oksidativnim stresom 1. del

Povzetek:

Holesterol igra ključno vlogo v možganih, kjer aktivnost astrocitov še posebej uravnava metabolizem. Dejansko odrasli nevroni zavirajo svojo biosintezo holesterola in uvažajo ta sterol skozi delce, bogate z ApoE, izločene iz astrocitov. Nedavni dokazi kažejo, da lahko živčni rastni faktor (NGF) izvaja nevrotrofično aktivnost z vplivanjem na celično presnovo.

Nevroni so osnovne enote, ki sestavljajo človeške možgane. Preko povezav med nevroni tvorijo našo možgansko skorjo, ki nosi vse naše znanje in spomine. Zato so nevroni tesno povezani s spominsko sposobnostjo.

Glavna funkcija nevronov je prenos informacij. Vsak nevron ima sinapso, ki povezuje dendrite in aksone drugih nevronov. Ko nevron prejme signal, ga posreduje nevronom, s katerimi je povezan. To signaliziranje, imenovano nevronski prenos, je eden ključnih procesov pri oblikovanju, shranjevanju in priklicu spomina.

Za ohranjanje zdravja naših možganov lahko z vadbo spodbujamo pravilno delovanje naših nevronov. Telesna vadba izboljša prekrvavitev in oskrbo možganov s kisikom ter s tem poveča število in povezave nevronov. Hkrati lahko različne družbene in učne dejavnosti oblikujejo nove nevrone v novih možganskih predelih in povečajo plastičnost možganov.

Ko imamo več, bolj aktivnih nevronov, postane naš spomin močnejši. Sinhronija med nevroni v možganski skorji postane bolj enakomerna, zaradi česar lažje shranjujemo in pridobivamo informacije, izboljšajo se naše kognitivne sposobnosti. Poleg tega bo veliko število nevronov in povezav med nevroni izboljšalo tudi našo hitrost odzivanja in sposobnost odločanja.

Zato gresta vzdrževanje zdravih nevronov in izboljšanje spomina z roko v roki. Svoj spomin lahko izboljšamo s spodbujanjem zdravih nevronov, tako da se osredotočimo na telesno vadbo, različne družabne in učne dejavnosti ter prehranjevalne navade. Delajmo skupaj za podporo zdravju naših možganov! Vidi se, da moramo izboljšati spomin. Cistanche deserticola lahko občutno izboljša spomin, saj je Cistanche deserticola tradicionalno kitajsko zdravilno sredstvo s številnimi edinstvenimi učinki, med katerimi je tudi izboljšanje spomina. Učinkovitost mletega mesa izhaja iz različnih učinkovin, ki jih vsebuje, vključno s karboksilno kislino, polisaharidi, flavonoidi itd. Te sestavine lahko spodbujajo zdravje možganov prek različnih kanalov.

Kliknite Spoznajte načine za izboljšanje delovanja možganov

Kljub temu učinek NGF na homeostazo glialnega holesterola še vedno ni pojasnjen. Namen tega projekta je oceniti, ali bi lahko NGF vplival na presnovo holesterola v celicah glije. Kot eksperimentalni model za dosego tega cilja je bila uporabljena celična linija U373, pridobljena iz astrocitov. Imunoblot in analiza ELISA sta pokazali, da so se beljakovine in encimi, ki pripadajo mreži presnove holesterola, povečali po zdravljenju z NGF v glialnih celicah. Poleg tega je NGF znatno povečal izločanje ApoE in količino zunajceličnega holesterola v gojišču.

Poskusi s sokulturo in U373-kondicioniranim medijem so pokazali, da je zdravljenje z NGF učinkovito preprečilo citotoksičnost, ki jo povzroča rotenon, v nevronskih celicah N1E-115. Nasprotno pa je bila nevroprotekcija, posredovana z zdravljenjem z NGF, potlačena, ko so N1E-115 gojili skupaj s celicami U373, utišanimi z ApoE. Ti podatki kažejo, da NGF nadzoruje homeostazo holesterola v celicah glije. Še pomembneje je, da NGF izvaja nevroprotekcijo pred oksidativnim stresom, ki je verjetno povezan z indukcijo izločanja glialnega ApoE.

Ključne besede:

ApoE; astrocit; holesterol; diferenciacija; faktor rasti živcev; metabolizem; nevron; reaktivne kisikove spojine; rotenon.

1. Uvod

Za možgane je značilna največja količina holesterola v celem telesu [1]. Izjemna koncentracija tega sterola v centralnem živčnem sistemu (CNS) je upravičena z dejstvom, da je holesterol vključen v več temeljnih bioloških procesov. Opozoriti je treba, da je znatna količina holesterola integrirana v plazemske membrane astrocitov in nevronov, kjer določa pravilno celično morfologijo ter pravilno delovanje membranskih receptorjev in sinaptično nevrotransmisijo [2].
Holesterol je prav tako bistvenega pomena za tvorbo novih membran, potrebnih za rast nevritov, sinaptogenezo in sproščanje nevrotransmiterjev, kar je ključnega pomena pri diferenciaciji in zorenju nevronov [3–7].

V bistvu ves holesterol v možganih izhaja iz de novo biosinteze in situ. Natančneje, krvno-možganska pregrada (BBB) ​​preprečuje privzem holesterola, ki izhaja iz lipoproteinov, ki se prenašajo skozi sistemski obtok [8]. Iz tega razloga živčne celice razvijejo zgledno regulativno mrežo za neodvisno upravljanje lastnega povpraševanja po tem lipidu. Dobro sprejet model ugotavlja, da po embriogenezi, v postnatalnem obdobju, biosinteza holesterola dramatično pade v nevronih, s poskusom prihranka energije, uporabljene za ustvarjanje akcijskih potencialov.

V skladu s tem so astrociti zadovoljili dvomljive nevronske potrebe po holesterolu, katerega sinteza postane še posebej izrazita [1,9,10]. Dostava holesterola, ki ga proizvajajo astrociti, do nevronov pomeni eleganten mehanizem horizontalnega transporta, ki vključuje kritične beljakovine in delce. Natančneje, izvoz holesterola se začne v astrocitih, kjer se neosintetizirani holesterol naloži v nastajajoče lipoproteinske delce, ki vsebujejo apolipoprotein E (ApoE). Kopičenje dokazov kaže, da lipidacijo delcev, bogatih z ApoE, posreduje transporter ATP-vezavna kaseta A1 (ABCA1) [11]. Nato, ko se sprosti v zunajcelični prostor, lipoproteine, ki vsebujejo ApoE, prevzamejo nevroni prek endocitozno posredovanega receptorja lipoproteinov nizke gostote (LDLr) in z LDLr povezanih proteinov 1 (LRP1) [12].

Glede na ključno vlogo holesterola, pridobljenega iz astrocitov, pri homeostazi nevronov, so eksperimentalne ugotovitve pokazale, da holesterol, ki ga vsebujejo lipoproteini, bogati z ApoE, znatno poveča diferenciacijo dendritov in sinaptično funkcijo [13,14]. Gojišče, kondicionirano s akordinastrociti, iz astrocitov Huntingtonove bolezni (HD), ki izločajo le skromno količino holesterola, vezanega na ApoE, močno vpliva na izraščanje nevrita in sinaptično aktivnost v nevronih HD [15].

Nevrotrofno delovanje delcev, ki vsebujejo ApoE, pridobljenih iz astrocitov, je dodatno podprto z vplivom pomanjkanja ApoE, ki izrazito ovira nevrogenezo odraslih v hipokampusu [16]. Preslušavanje holesterola med astrociti in nevroni je prav tako kritično pri nevroprotekciji pred oksidativnim stresom. Nekatera poročila na primer kažejo, da ApoE ovira oksidativne poškodbe in apoptozo, ki ju povzroči izpostavljenost vodikovemu peroksidu [17,18].

Iz teh opazovanj je vzdrževanje homeostaze holesterola v možganih potrebno za zagotovitev delovanja živčnih celic, presnovne poti, na katerih temelji regulacija tega lipida, pa je treba natančno nadzorovati, da se ohrani pojav več nevrofizioloških procesov.

V zadnjih letih so se nevrotrofini izkazali kot bistveni akterji celičnega metabolizma [2,19–22]. Nevrotrofini spadajo v majhno družino rastnih faktorjev, ki imajo neizpodbitno vlogo pri razvoju nevronov, preživetju in plastičnosti [23]. Nedavno so bile te signalne molekule priznane tudi kot ključni modulatorji celičnega metabolizma, vključno s presnovo holesterola [2, 22].

Eksperimentalni dokazi poudarjajo, da živčni rastni faktor (NGF), prototipni član družine nevrotrofinov, stimulira biosintezo holesterola v nevronskih celicah in hepatocitih [24, 25]. Zanimivo je, da ti dogodki vsaj delno vključujejo nevrotrofinski receptor z nizko afiniteto p75NTR, ki izzove aktivacijo proteina 2, ki veže regulatorni element sterola (SREBP-2) in posledično inducira transkripcijo s holesterolom povezanih geni [25]. Dejavnost NGF na presnovo holesterola ni omejena na biosintezo, saj spodbuja tudi privzem holesterola s povečanjem izražanja LDLr v nevronih [26].

Kljub tem informacijam se zdi znanje o možnem prispevku NGF pri uravnavanju homeostaze holesterola še posebej omejeno. Predvsem primanjkuje sistematičnih študij, ki bi ocenjevale vlogo NGF pri uravnavanju presnove holesterola v astrocitnih celicah. Glede na to, da je holesterol, ki ga proizvajajo astrociti, bistvenega pomena za zagotavljanje nevronske fiziologije, je pomembno razumeti, ali lahko vplivamo na presnovo holesterola v glialnih celicah kot tudi na medcelični transport holesterola, katerega posebna regulacija je nujna za zagotavljanje zdravja možganov.

Na podlagi tega dela je cilj raziskati morebitno vpletenost NGF v modulacijo presnove holesterola v celicah glije, pa tudi njegov vpliv na nevronsko diferenciacijo in preživetje nevronov v pogojih oksidativnega stresa.

2. Rezultati

2.1. U373 izraža tako NGF receptorje TrkA kot p75NTR

NGF je bil sprva identificiran kot rastni faktor s specifičnim tropizmom za nevronske celice. Vendar kopičenje dokazov dokazuje, da ta nevrotrofin povzroča tudi biološke učinke v več ne-nevronskih celicah in tkivih [22]. Delovanje NGF je zagotovljeno z njegovo vezavo na visokoafinitetni receptor TrkAd na nizkoafinitetni receptor p75NTR [2].

Tako smo na začetku ugotovili, ali celice U373 izražajo receptorje NGF. Predvsem je U373 celična linija astrocitoma, ki se pogosto uporablja kot model celične kulture astrocitov, saj je več poročil pokazalo, da ponavljajo morfološke, presnovne in funkcionalne lastnosti astrocitov [27–29]. Po objavljenih podatkih [30] je imunofluorescenčna analiza pokazala, da celice U373 izražajo tako TrkA kot p75NTR na znatnih ravneh (slika S1A). Ti rezultati so bili potrjeni tudi z analizo Western blot, kar kaže, da imajo celice U373 potencial, da se v celoti odzovejo na NGF.

Ker lahko dajanje NGF vpliva na ravni izražanja njegovih receptorjev, kar lahko spremeni ravnovesje med signalnimi potmi, ki jih izzoveta TrkA in/ali p75NTR [31–33], je bilo izražanje obeh receptorjev preverjeno tudi po 48 urah zdravljenja z NGF. Vendar pa po stimulaciji z nevrotrofinom niso opazili nobenih sprememb v količini beljakovin TrkA in p75NTR (slika S1B).

2.3. NGF poveča izločanje holesterola z U373 v gojišče

Dobljeni rezultati so nas spodbudili k raziskavi, ali bi lahko učinki, ki jih posreduje NGF, odražali modulacijo vsebnosti holesterola. Za vizualizacijo nevtralnih lipidov, vključno s holesterilnimi estri, smo izvedli barvanje z oljem Red O. Velikost in število lipidnih kapljic, najdenih v celicah U373, sta bili podobni tistim, o katerih so poročali za primarne astrocite [34,35].

Vendar pa pri zdravljenju z NGF niso opazili nobenih sprememb (sliki 2A in S2A, B). Podobno niso odkrili nobenih sprememb v količini prostega holesterola, ovrednotenega z obarvanjem s filipinom (sliki 2B in S2C). Pomanjkanje pomembnih učinkov na ravni znotrajceličnega holesterola je nadalje potrdil encimski test holesterola, ki je poudaril, da NGF ni spremenil vsebnosti celotnega holesterola, prostega holesterola in holesteril estrov (slika 2C).

Nasprotno pa se je količina holesterola (prostega, estrov in skupnega) izrazito povečala v gojišču NGF, obdelanega z U373- (slika 2D). Če jih ovrednotimo kot celoto, ti podatki kažejo, da NGF spodbuja ekstruzijo holesterola s povečanjem ABCA1-posredovanega iztoka delcev, ki vsebujejo ApoE.

Slika 1. NGF modulira izražanje glavnih proteinov, vključenih v homeostazo holesterola v celicah U373, in poveča izločanje ApoE n v gojišču U373. (A–G) Reprezentativna Western blot in denzitometrična analiza SREBP-1, SREBP-2, HMGCR, LDLr, NPC1, ABCA1 in ApoE v celicah U373, obdelanih z vehiklom (Ctrl) in NGF (100 ng) /ml) 48 ur. n=6 različnih poskusov.

Aktin in vinculin sta bila uporabljena kot kontrola obremenitve. (H) Kvantifikacija ravni ApoE (µg/mL) s testom ELISA v gojišču U373, obdelanem z nosilcem in NGF. n=3 različnih poskusov. Podatki predstavljajo povprečje ± SD. Statistična analiza je bila ocenjena z enim neparnim testom Studet. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

2.4. p75NTR je delno vključen v učinke, ki jih posreduje NGF, na holesterolsko proteinsko mrežo

Eksperimentalne ugotovitve kažejo, da NGF vpliva na presnovo holesterola v jetrnih celicah z aktivacijo njegovega receptorja z nizko afiniteto p75NTR [25]. Da bi preizkusili, ali se lahko ta signalna pot ohrani tudi v astrocitnih celicah, smo U373 obdelali z LM11A-31, majhnim ligandom, ki deluje kot specifičen modulator p75NTR. Ta spojina ne aktivira TrkA, ampak, podobno kot NGF, izzove indukcijo signalnih poti p75NTR navzdol [36]. LM11A-31 je posnemal z NGF posredovano povečanje HMGCR (slika 3A).

Vendar niso opazili nobenih sprememb v drugih beljakovinah, ki sodelujejo pri presnovi holesterola (slika 3B–D), niti v količini zunajceličnega ApoE (slika 3E) in holesterola (celokupnega, prostega in estrov), sproščenega v gojišče (slika 3F). ). Skupaj ti rezultati kažejo, da izražanje HMGCR, ki ga povzroči NGF, posreduje aktivnost p75NTR, medtem ko so učinki na NPC1, ABCA1, izločanje ApoE in ekstruzijo holesterola verjetno odvisni od drugih transdukcijskih poti, ki morda vključujejo TrkA.

Slika 2. Učinki NGF na nevtralne lipide in vsebnost holesterola. (A) Celice U373 smo 48 ur obdelali z vehiklom (Ctrl) ali NGF (100 ng/mL) in jih nato obarvali z Oil Red O, da bi vizualizirali znotrajcelično vsebnost nevtralnih lipidov. n=3 različnih poskusov. (B) Reprezentativna slika obarvanja s filipinom, izvedenega na celicah U373, obdelanih z vehiklom (Ctrl) in NGF (100 ng/mL) 48 ur. n=3 različnih poskusov. (C) Kvantifikacija ravni znotrajceličnega holesterola (celotni holesterol, prosti holesterol in holesteril estri) v celicah U373, obdelanih z nosilcem in NGF. n=3 različnih poskusov. (D) Kvantifikacija holesterola (skupni holesterol, prosti holesterol in holesteril estri) v gojišču celic U373, obdelanih z vehiklom (Ctrl) in NGF (100 ng/mL) 48 ur. n=3 različnih poskusov. Podatki predstavljajo povprečje ± SD. Statistična analiza je bila izvedena s petjem neparnega Studentovega t-testa. ** str<0.01.

Slika 3. Učinki modulacije p75NTR z LM11A-31 na presnovo in izločanje holesterola. (A–D) Reprezentativna Western blot in denzitometrična analiza HMGCR, ABCA1, NPC1 in ApoE v celicah U373, obdelanih z vehiklom (Ctrl) in LM11A-31 (0.1 µM) 48 ur. n=4 različnih poskusov.

Vinkulin je služil kot gospodinjski protein za normalizacijo nalaganja beljakovin. (E) Kvantifikacija količine ApoE (µg/mL) s testom ELISA v gojišču iz celic U373, obdelanih z nosilcem in LM11A-31-. n=3 različnih poskusov. (F) Kvantifikacija holesterola (skupni holesterol, prosti holesterol in holesteril estri) v gojišču celic U373, obdelanih z vehiklom (Ctrl) in LM11A-31 (0.1 µM) 48 ur. n=3 različnih poskusov. Podatki predstavljajo povprečje ± SD. Statistična analiza je bila izvedena z uporabo enega samega neparnega Studetovega testa. *** p < 0.001.

For more information:1950477648nn@gmail.com