Nlrc3 Knockout miši so pokazale ledvične patološke spremembe po okužbi s HTNV

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Virus Hantaan (HTNV) okuži ljudi in povzroči hemoragično vročinoledvičnasindrom(HFRS). Razvoj dobro opredeljenih živalskih modelov HFRS bi lahko pospešil testiranje kandidatov za cepivo in terapevtskih učinkovin ter zagotovil uporabno orodje za proučevanje patogeneze HFRS. Ker ima NLRC3 več imunoregulacijskih vlog, smo raziskali dovzetnost miši Nlrc3-/- za okužbo s HTNV, da bi vzpostavili nov model HFRS. Nlrc3-/- miši so izgubile težo,ledvična krvavitev,in dilatacijo tubulov po okužbi s HTNV, ki povzema številne klinične simptome HFRS pri ljudeh. Poleg tega so okužene miši Nlrc3-/- pokazale višje virusne obremenitve v serumu, vranici in ledvicah kot miši divjega tipa C57BL/6 (WT), nekatere od njih pa so pokazale več hematoloških motenj in pomembne patološke spremembe v več organih kot miši WT. Naši rezultati ugotavljajo, da lahko miši Nlrc3−/−, okužene s HTNV, razvijejo klinične simptome in patološke spremembe, ki spominjajo na bolnike s HFRS, kar kaže na nov model za preučevanje patogeneze in testiranje kandidatnih cepiv in terapevtikov.

Ključne besede:HFRS, HTNV, NLRC3, ledvična krvavitev, dilatacija ledvičnih tubulov

UVOD

Hemoragična vročina sledvičnasindrom (HFRS) predstavlja akutno intersticijsko nefropatijo po zoonotskem prenosu hantavirusov z glodalcev na ljudi. Bolezen se pojavlja predvsem v Aziji in Evropi (1, 2). Najpogostejši patogeni, ki povzročajo HFRS, so virus Dobrava (DOBV), virus Puumala (PUUV), virus Seoul (SEOV) in virus Hantaan (HTNV), od katerih vsak povzroča drugačno resnost HFRS. Značilnosti bolezni so drugačne v Severni in Južni Ameriki, kjer okužba s hantavirusom povzroča hantavirusni pljučni sindrom (HPS), predvsem z virusom Andes (ANDV) in virusom Sin Nombre (SNV) (3).

HFRS se pojavi z značilnostmi visoke vročine, hipotenzije,odpoved ledvic in krvavitev(4). Razdelimo ga lahko na pet kliničnih stopenj: febrilno, hipotenzivni šok, oligurično, diuretično in rekonvalescentno. Akutno epizodo okužbe s HTNV, ki vodi do HFRS, pogosto spremljajo trombocitopenija, levkocitoza, anemija, povišan serumski kreatinin in jetrni encimi (5). Te klinične simptome in znake je mogoče delno razložiti z dejstvom, da HTNV v glavnem napada ledvice in povzroči poškodbo ledvic, za katero je značilen akutni tubulointersticijski nefritis, ki vključuje infiltracijo vnetnih celic (6), kar posledično prizadene številne druge organe (7).

Glodalci so naravni rezervoarji za hantaviruse, ki vztrajno okužijo živali, ne da bi povzročili bolezen (8). Njihovi iztrebki, kot so slina, urin in blato, postanejo potencialni onesnaževalci, ki lahko okužijo ljudi, ki vdihavajo aerosole majhnih delcev onesnaženih iztrebkov. Hantavirusi na splošno povzročajo asimptomatsko okužbo pri odraslih miših BALB/c in C57BL/6 (9), vendar smrtonosno nevrološko bolezen ali dolgotrajno okužbo pri dojenih in novorojenih miših (10, 11). Čeprav so bile nefropatske nenormalnosti dokazane pri poskusno s PUUV okuženih cynomolgus macaques (Macaca fascicularis), so te živali pokazale le blago proteinurijo, infiltracijo imunskih celic in tubularne poškodbe ledvic, podobno kot pri blagem primeru HFRS (12). Poleg tega so hrčki, okuženi s HTNV po nazalni poti, povzročili vztrajno asimptomatsko okužbo, za katero je značilna občasna viremija, vendar visoka raven kopij virusnega genoma v pljučih, možganih in ledvicah. Dihurji, okuženi z visokim odmerkom HTNV z injekcijo v mišico, so pokazali postopno zmanjšanje telesne teže (5-12 odstotkov skozi čas), vendar nepoškodovaniledvične funkcije,odsotnost viremije in pomanjkanje prenosa virusa na organe. Pri marmozetkah je intramuskularna injekcija HTNV povzročila visoko stopnjo serokonverzije in proizvodnjo nevtralizirajočih protiteles; dosledno te živali niso imele poškodb ledvic, viremije ali prenosa virusa na organe (13).

Kljub njihovi nepopolnosti so bili živalski modeli, ki so uporabljali podgane in miši, v veliki meri uporabljeni za preučevanje patogeneze Hantavirusa (14). Yoshimatsu et al. je pokazalo, da je okužba miši SCID s HTNV povzročila smrtonosno bolezen s pljučnim edemom (15, 16), zmanjšanje števila nevtrofilcev pa je preprečilo razvoj pljučnega edema, vendar niso odkrili značilnih hemoragičnih lezij HFRS (15). Shimizu et al. ugotovili, da lahko HTNV, izoliran pri bolnikih s HFRS, intravensko okuži 6-teden stare samice miši BALB/c, kar povzroči viremijo za 6-9 dni, ki kaže znake bolezni, vključno z začasno izgubo teže, gubami v dlaki, izločanjem iz ledvic (17 ). V istem mišjem modelu je prišlo do makroskopske krvavitve na meji medledvična skorjain medule, vendar pa niso raziskali, ali so opažene histopatološke spremembe povezane z zmanjšanim delovanjem ledvic. Pri humaniziranih miših okužba s HTNV povzroči izgubo teže, zmanjšano aktivnost, nabrano dlako in poškodbo pljuč, kar kaže, da so pljuča glavni tarčni organ za virusno okužbo (18). Zato je še vedno potreben ustrezen živalski model okužbe s HTNV, ki zajame večino bolezni HFRS.

cistanche ocenezadilatacija ledvičnih tubulov

NLR so najpomembnejša družina intracelularnih prirojenih imunskih receptorjev in opravljajo različne funkcije pri uravnavanju prirojene imunosti. Čeprav imajo najbolj znani NLR (npr. NLRP3) pozitivno regulativno funkcijo pri vnetni in imunski aktivaciji, nenavadna podskupina NLR, opredeljena kot zaviralni NLR, kaže zaviralno funkcijo pri vnetnih odzivih. Da bi razumeli mehanizem prirojene imunske supresije, ki jo posreduje NLR, so preučili ligande za inhibitorne NLR, kot sta NLRC3 in NLRX1 (19). NLRC3 je negativni regulator, ki oslabi odziv interferona tipa I (IFN-I) s sekvestracijo in oslabitvijo aktivacije stimulatorja interferonskih genov (STING) (19). NLRX1, kot osrednji homeostatski vratar med mitohondrijsko biologijo in imunološkim odzivom, je bil vpleten v širok spekter bolezni, ki jih povzročajo patogeni in drugače (20). Ker bolezen HTNV kaže veliko motenj regulacije vnetja in imunske aktivacije, smo izbrali miši Nlrc3-/- za raziskovanje molekularnih mehanizmov bolezni.

Ta študija je pokazala, da model miši Nlrc3−/− spominja na sistematično poškodbo, opaženo pri bolnikih s HFRS, za katero je značilna trombocitopenija,dilatacija ledvičnih tubulov in krvavitev.Analiza virusne obremenitve je pokazala, da so miši Nlrc3-/- predstavljale višje virusne obremenitve v več tkivih, vključno s serumom, vranico in ledvicami. Naše študije vzpostavljajo mišji model za okužbo s HTNV, ki je uporaben za ocenjevanje možnih cepiv in terapevtikov.

METODE

Zaloge VVirus

Sev HTNV {{0}} je podaril Changshou Hang (Kitajski center za nadzor in preprečevanje bolezni) in nato ohranil in razširil v našem laboratoriju. Celice Vero E6 so bile uporabljene za razmnoževanje virusa, infektivni titri pa so bili kvantificirani z uporabo 50-odstotnega infektivnega odmerka tkivne kulture (TCID50) z imunofluorescenčnimi testi (IFA). Pretvorba med TCID50 in enotami za tvorbo plakov (PSU) je temeljila na naslednjem izračunu: 1 PFU ≈0,7×TCID50 (21).

generacija modela miške Nlrc3 Knockout

Miši divjega tipa C57BL/6J in Nlrc3 knockout (Nlrc3−/−) modele miši je zasnoval in razvil Shanghai Model Organisms Center, Inc (Šanghaj, Kitajska). Za pridobitev miške Nlrc3-/- smo mRNA Cas9 in sgRNA pripravili s transkripcijo in vitro. Dve sgRNA, namenjeni brisanju eksonov 2-3 gena Nlrc3: 5'- GTTGGTCTAATAAGCATCCTGGG {{10}}', 5'- TCCCATGAAACCATGTCAGAAGG -3'. Prejeli smo zigote miši C57BL/6J in jim injicirali in vitro prepisano Cas9 mRNA in sgRNA ter jih prenesli na psevdobreje prejemnike. Genotip pridobljenih miši F0 je bil identificiran in potrjen s PCR in sekvenciranjem z uporabo parov primerjev: F-5'- GTGATGTCTGCTTACC CCGTCTCC -3'; R-5'- GCCTGTGCCGCCCTCTCA -3'. S križanjem z mišmi C57BL/6J smo izbrali pozitivne F0 miši za pridobitev F1 heterozigotnih Nlrc3 izločenih miši. PCR in analiza sekvenciranja sta potrdili pridobljene miši F1. Za pridobitev heterozigotnih miši Nlrc3-/- so bile samice in samci heterozigotnih miši F1 naključno križane. Za vse študije so bile uporabljene miši, stare 6–8 tednov.

Okužba živali in priprava vzorcev

Po intraperitonealni poti je bilo inokuliranih skupno 5 × 105 PFU-jev HTNV v 50 ul medija. Miši v kontrolnih skupinah so prejele enake količine PBS. Uporabljenih je bilo dvajset do petindvajset miši Nlrc3-/- ali WT. Vsak tip miši je bil razdeljen v pet skupin za vzorčenje 0, 3, 6, 9 in 12 dni po okužbi. Dnevno so beležili telesno težo in analno temperaturo. Ob vsaki časovni točki je bilo štiri do pet živali iz obeh skupin evtanaziranih za testiranje. Za virološko analizo so bili zbrani vzorci svežega tkiva iz srca, jeter, vranice, pljuč, ledvic in možganov ter nato takoj zamrznjeni na -80 stopinj. Miši smo perfundirali s hladnim PBS in organe 4 ure fiksirali v 4-odstotnem paraformaldehidu za histološko in imunohistokemijsko analizo. Vzorec krvi je bil zbran za testiranje virusne obremenitve in rutinski pregled krvi, serum pa je bil izoliran za biokemijsko analizo.

Test citokinov

Skupno 25 ml seruma iz vsake miši je bilo testiranih na 13 različnih citokinov z LEGENDplex™ Mouse Anti-Virus Response Panel (13-plex) (BioLegend) v skladu z navodili proizvajalca. Za detekcijo je bil uporabljen citometer FACS Calibur (Becton Dickinson Biosciences, CA). Podatke je analiziral LEGENDplex v8.0. Programska oprema.

Test RT-PCR v realnem času

Vzorce tkiv vsake miši smo stehtali in potopili v PBS ter homogenizirali z avtomatiziranim homogenizatorjem-TissueLyser II (QIAGEN, Nemčija) s frekvenco 30/s in časom 5 min. Za ekstrakcijo celotne RNK smo 200 ml tkivnih homogenatov prenesli v 500 ml reagenta TRIzol, čemur je sledila ekstrakcija s kloroformom in obarjanje z izopropanolom. 140 ml vzorcev seruma smo prenesli v 560 ml pufra AVL, ki je vseboval nosilno RNA (Qiagen, UK) za ekstrakcijo RNA z uporabo kompleta QIAamp Viral RNA Mini (Qiagen, UK). Končno smo RNA ponovno raztopili v vodi brez RNaze. Za odkrivanje virusne RNA iz vsakega vzorca je bil izveden specifičen HTNV test RT-PCR v realnem času. Sekvence primerjev, ki so posebej usmerjene na segment HTNV, so bile sprejete, kot sledi: F-5'- GATCAGTCACAGTCTAGTCA- 3' in R-5'- TGATTCTTCCACCATTTTGT-3'. Za test qRT-PCR je bil uporabljen One-Step TB Green PrimeScript™ RT-PCR Kit II (Perfect Real Time) (Takara, Japonska). Končna glavna mešanica (20 mL) je vsebovala 2 mL RNA, 5,6 mL dH2O brez RNaze, 0,8 mL posredovalnega in povratnega primerja (10 mM), 0,8 mL PrimScript 1 Step Enzyme Mix 2 in 10 mL 2×One Step TB Green RT-PCR pufer 4. Uporabljeni ciklični pogoji so bili 42 stopinj za 5 minut, 95 stopinj za 10 sekund, nato pa je sledilo 40 ciklov 95 stopinj za 0 sekund, 65 stopinj za 15 sekund in 95 stopinj za 0 sekund. Reakcije so izvajali in analizirali na platformi LightCycler (Roche Diagnostics, ZDA).

Absolutna kvantifikacija virusne obremenitve

Virusni RNA oligonukleotidi kot standard RNA so bili pridobljeni z in-vitro-transkripcijo iz DNA z uporabo MAXIscript Kit (Thermo Scientific, Združeno kraljestvo), ki je vseboval 562 baz HTNV RNA, ki je bil ciljni test (22), in nato kvantificiran s spektrofotometrom z ultramikro mikroploščami ( BioTek Epoch, ZDA), je bila koncentracija standardne zaloge RNA 800 ng/mL. Za oceno virusne obremenitve v vsakem vzorcu je bila standardna RNA pripravljena s 10-kratno serijsko razredčino, v razponu od 1010 kopij do 103 kopij na reakcijo. Naša standardna RNA ima mejo zaznavanja od 1010 kopij do 101 kopije na reakcijo, zato smo prag zaznave za ta test postavili na 100 kopij genoma na reakcijo. Med analizo so bile standardne krivulje vzpostavljene z naklonom -3.6624, Y-presekom 41.68 ciklov in vrednostjo R2 0.9996.

Analiza ravni beljakovin z Western blottingom

Tkivni lizati so bili pripravljeni iz vzorcev mišjega tkiva. Za odkrivanje koncentracije beljakovin je bil uporabljen komplet za analizo beljakovin bicinhoninske kisline (BCA) (Thermo Scientific, Združeno kraljestvo). Za analizo beljakovin smo 30 mg skupnih beljakovin iz vsakega vzorca naložili na SDS-poliakrilamidni gel in prenesli na NC membrane. Nato smo za blokiranje pri sobni temperaturi 2 uri uporabili 5-odstotno raztopino posnetega mleka. Nato smo dodali 1:1000 razredčeno monoklonsko protitelo 1A8 proti HTNV-NP (pripravljeno in prečiščeno v našem laboratoriju) (23, 24) in inkubirali pri 4 stopinjah čez noč. Končno so bile membrane inkubirane s sekundarnimi protitelesi, HRP-konjugiranim kunčjim protimišjim IgG ali HRP-konjugiranim mišjim anti-kunčjim IgG pri sobni temperaturi 2 uri. Nato je bil dodan kemiluminiscentni substrat HRP za odkrivanje proteinov. Denzitometrična analiza intenzivnosti proteinskega pasu je bila izvedena z uporabo programske opreme Image J (NIH, ZDA). b-aktin je bil uporabljen kot kontrola obremenitve za normalizacijo.

Imunohistokemijski test

Vzorci tkiva so bili vstavljeni v parafin in narezani na 4 mm za imunohistokemijsko barvanje. Odseki so podvrženi deparafinizaciji in rehidraciji ter inaktivaciji endogenih peroksidaz. Odseki so bili izpostavljeni pridobivanju antigena v citratnem pufru (PH =6) pri 95 stopinjah 10 minut. Nato je bil za blokiranje pri sobni temperaturi 40 minut uporabljen 5-odstotni normalni kozji serum. mAb 1A8 je bilo uporabljeno kot primarno protitelo za antigen HTNV NP in inkubirano z odseki tkiva pri 4 stopinjah čez noč. Temu je sledilo barvanje s FITC protimišjim IgG (Invitrogen) pri 37 stopinjah 1 uro in nato DAPI 10 minut pri sobni temperaturi. Za pridobivanje slik je bil uporabljen 3DHISTECH (Madžarska), za analizo podatkov pa CaseViewer2.4.

Histološki pregled

Da bi ohranili morfologijo celic in tkiv, smo za fiksacijo vzorcev tkiva za histopatološko analizo uporabili 4-odstotni nevtralni puferski formalin. Ta tkiva so bila predelana v 5 mm debele odseke in nato obarvana s hematoksilinom in eozinom (H&E). Nazadnje so bili odseki pregledani s svetlobno mikroskopijo, slike pa je posnel 3DHISTECH (Madžarska), analiziral pa jih je CaseViewer2.4. Stopnja lezij je bila ocenjena vizualno z vnaprej nastavljenim 4-sistemom ocen: znotraj normalnih meja kot 0, najmanjša kot 1, blaga kot 2, zmerna kot 3, huda kot 4.

Študije o živalihVse poskuse na živalih je odobril odbor za laboratorijske poskuse Četrtega vojaškomedicinskega univerzitetnega centra za živali. (št. 20210403).

StatistikaPodatki so bili analizirani s programsko opremo GraphPad Prism 9. Če ni drugače določeno, so bili vsi podatki predstavljeni kot povprečje ± standardni odklon (SD). Uporabljeni so bili t-testi ali enosmerna ANOVA, kot je navedeno v legendah na slikah. P-vrednost, manjša od 0,05, je veljala za pomembno.

REZULTATI

Odkrivanje virusne obremenitve v različnih organih miši Nlrc3−/− po intraperitonealni okužbi s HTNV

Za karakterizacijo dovzetnosti miši Nlrc3−/− za okužbo s HTNV je bila skupina miši Nlrc3−/− intraperitonealno okužena s 5×105 PFU-jev HTNV na miš, pri čemer so bile miši WT uporabljene kot kontrole. Vse živali so dnevno spremljali glede kliničnih simptomov, temperature in sprememb telesne teže. Miši so žrtvovali 3, 6, 9 in 12 dni po okužbi (dpi), da bi analizirali različne laboratorijske parametre, virusno obremenitev in patologijo. Miši Nlrc3−/− so začele izgubljati težo pri 4 dpi, pri 6 dpi pa je bila zabeležena izguba teže > 5 odstotkov njihove začetne telesne teže. Za primerjavo, miši WT niso pokazale izgube teže (slika 1A). V obeh skupinah niso zabeležili povišane telesne temperature (slika 1B). Da bi ocenili diseminacijo in replikacijo HTNV pri miših, okuženih z virusom, so zbrali serum in glavne organe (vključno s srcem, jetri, vranico, pljuči, ledvicami in možgani) za absolutno kvantifikacijo števila kopij virusne RNA. Rezultati so pokazali, da se je viremija pojavila pri 3 dpi v obeh skupinah (miši Nlrc3−/−: 943 ± 140 ekvivalentov kopij na ml; miši WT: 803 ± 277 kopij na ml). Predvsem je serumska virusna obremenitev miši WT dosegla vrh pri 3 dpi in se po tem hitro zmanjšala, medtem ko je pri miših Nlrc3-/- virusna obremenitev ohranila vmesno raven do 6 dpi in se nato postopoma zmanjšala na nizko raven 9 dpi (slika 1C). Poleg tega smo zbrali polno kri miši, okuženih s HTNV, dneve 0, 3, 6 in 9 po okužbi, da bi določili replikacijo virusa v krvi. Rezultati so pokazali, da se je virusna obremenitev povečala za 3 dpi in nato zmanjšala, kar kaže na replikacijo virusa v krvnih celicah. Kot je prikazano na dodatni sliki 1, je bilo število virusnih kopij pri miših Nlrc3-/- večje kot pri miših WT (miši Nlrc3-/-: 5752 ± 502 kopij na ml; miši WT: 3589 ± 869 kopij na ml) pri 3 dpi. Poleg tega so 2-krat večjo virusno obremenitev odkrili v vranici miši Nlrc3−/− (3033 ± 175 ekvivalentov kopij na mg) kot miši WT (1520 ± 425 kopij na mg) pri 6 dpi; enak vzorec so opazili v ledvicah pri 9 dpi (miši Nlrc3-/-: 500 ± 87 ekvivalentov kopij na mg; miši WT: 270 ± 40 kopij na mg) (slika 1C). Na splošno so bile pri miših Nlrc3-/- odkrite skromne višje virusne obremenitve kot pri miših WT.

Nato smo pregledali ravni nukleoproteina (NP) HTNV. Kot je prikazano na slikah 2A, C, so miši Nlrc3-/- predstavljale višje ravni virusnega antigena kot miši WT v vranici in ledvicah. Statistična analiza virusnih antigenov v ledvicah in vranici je bila prikazana na slikah 2B oziroma D. V srcu, jetrih, pljučih in možganih miši Nlrc3-/- so odkrili nizke ravni virusnih antigenov (dodatna slika 2). Raven beljakovin virusnega NP v srcu, pljučih in možganih miši Nlrc3-/- je bila nižja kot pri miših WT na ravni beljakovin (dodatne slike 2B, F, H), vendar so bili statistični pomeni prikazani med srcem in možgani tako na mRNA in ravni beljakovin (dodatne slike 2A, E, I). Ta ugotovitev je pokazala, da aktivni virusni

replikacija se je pojavila v krvi, vranici in ledvicah miši Nlrc3-/- po okužbi s HTNV. Končno smo uporabili imunofluorescenco za odkrivanje ravni izražanja HTNV NP v vranici in ledvicah. Intenzivnost fluorescence HTNV NP FL je bila večja v ledvicahledvičnatubule (slika 2E) in vranično rdečo pulpo (slika 2F) miši Nlrc3-/- kot miši WT pri 6 dpi in 9 dpi. Ti rezultati skupaj kažejo, da so miši Nlrc3-/- bolj dovzetne za intraperitonealno okužbo s HTNV.

Rutinski krvni testi miši Nlrc3−/− po okužbi s HTNV

Splošno sprejeto je bilo, da je patologija HFRS v veliki meri posredovana imunsko, vključno z imunskimi kompleksi, aktivacijo komplementa, T-celičnim odzivom (24–26) in s HTNV inducirano proizvodnjo citokinov (26, 27), kar povzroča poškodbe več organov. Poleg tega je trombocitopenija pogosta klinična značilnost pri bolnikih, okuženih z virusi virusne hemoragične mrzlice (VHF). Tako smo najprej izvedli hematološki test z uporabo polne krvi, zbrane pri miših Nlrc3-/- in WT na 3, 6, 9 in 12 dpi. Rezultati so pokazali, da se je število PLT pri miših WT zmanjšalo pri 3 dpi in nato postopoma okrevalo, vendar se je še naprej zmanjševalo pri miših Nlrc3−/−, dokler ni doseglo najnižje vrednosti pri 9 dpi, kar je znatno nižje kot pri WT pri 9 dpi (P<0.05) (figure="" 3a).="" the="" decrease="" of="" wbc="" counts="" was="" observed="" on="" 3="" dpi="" and="" then="" gradually="" recovered="" to="" normal="" levels="" in="" both="" mouse="" strains="" (figure="" 3b).="" to="" further="" dissect="" the="" subset="" changes="" in="" wbcs,="" we="" analyzed="" on="" 0,="" 3,="" 6="" dpi="" the="" number="" of="" monocytes,="" neutrophils,="" lymphocytes,="" and="" t="" cells="" by="" routine="" blood="" tests="" combined="" with="" fellow="" cytometry="" assay.="" the="" number="" of="">

se je znatno povečalo pri miših Nlrc3-/- pri 6 dpi, ne pa pri miših WT (slika 3C). Nevtrofilci pri obeh vrstah miši so se nekoliko zmanjšali, vendar so se povrnili na povprečno raven pri 6 dpi (slika 3D). Število limfocitov se je znatno zmanjšalo pri 3 dpi, medtem ko so pri miših WT začeli naraščati pri 6 dpi, število limfocitov je ostalo na nizki ravni pri 6 dpi pri miših Nlrc3-/- (slika 3E). Razmerje med CD3 in CD4 in T celicami v primerjavi s CD3 in CD8 in T celicami v periferni krvi je bilo določeno s sorazmerno citometrijo in ugotovljeno je bilo, da se poveča pri 3 dpi in nato hitro obrne pri 6 dpi, kar je skladno s spremembami, ki jih pogosto opazimo pri bolnikih s HFRS (slika 3F), pri katerih so se celice CD4 plus T dramatično zmanjšale, celice CD8 plus T pa ostanejo nespremenjene ali kompenzacijsko razširjene, kar povzroči obrnjeno razmerje CD4/CD8. Te ugotovitve kažejo, da je intraperitonealna inokulacija HTNV v miši Nlrc3-/- do neke mere povzročila glavne klinične značilnosti bolnikov, okuženih s HTNV, kot sta trombocitopenija in obrnjeno razmerje celic T CD4/CD8.

Patološke spremembe v ledvicah okuženih miši Nlrc3-/- kažejo izrazito ledvično intersticijsko krvavitev in dilatacijo ledvičnih tubulovNato so bile patološke spremembe miši, okuženih s HTNV, ocenjene z barvanjem s H&E in ugotovljeno je bilo, da obstajajo v ledvicah vseh okuženih miši Nlrc3-/-, kar se kaže kot edemledvičnatubularne epitelijske celice. Pri 6 dpi so opazili hemoragične lezije vledvičnamedulla (slika 4A).Ledvični tubuldilatacijo so opazili že pri 3 dpi, njena resnost je dosegla vrh pri 9 dpi in je vztrajala do 12 dpi in je bolj izrazita pri miših Nlrc3-/- kot pri miših WT (sliki 4B, C). Te ugotovitve so pokazale

za katero je značilna akutna nefropatijaledvičnih tubulihdilatacijo inledvična intersticijska krvavitevje bil induciran pri miših Nlrc3−/−, okuženih s HTNV. Kar zadeva druge patološke spremembe v jetrih, vranici, pljučih, sta ti dve skupini miši pokazali podobne rezultate. Ti so v glavnem vključevali ekstramedularno hematopoezo v vranici, zadebelitev alveolarne stene v pljučih in degeneracijo jeter (dodatne slike 3A–F). Na podlagi zgoraj navedenega so bile patološke značilnosti, opažene v ledvicah miši Nlrc3-/- med akutno fazo okužbe s HTNV, zelo podobne klinično-patološkim spremembam v primerih HFRS pri ljudeh.

Na podlagi tega smo nadalje pregledali povezane indekse krvi in ​​urina pri miših za funkcionalne motnje ledvic. Mišji serumi so bili zbrani za oceno alanin aminotransferaze (ALT), kreatin kinaze MB frakcije (CK-MB), sečnine in sečne kisline (UA). Kot je prikazano na sliki 4D, je bila v primerjavi s kontrolnimi mišmi WT raven serumskega UA pomembno povišana pri 3 dpi pri miših Nlrc3-/-, serumski CK-MB je bil pri miših Nlrc3-/- pomembno povišan pri 9 dpi, vendar so serumske ravni vrednosti ALT, UREA in CREA niso pokazale zvišanja (dodatna tabela 1).

ledvičnavključenost v HFRS, okuženo s PUUV, vključuje prehodno proteinurijo, mikroskopsko, a redko vidno hematurijo in oligurično AKI, ki ji sledita poliurija in okrevanje. Značilna značilnost proteinurije pri tej bolezni je bilo hitro zmanjševanje po akutni fazi bolezni (6). V veliki kohorti bolnikov z akutnim tubulointersticijskim nefritisom različnih etiologij so proteinurijo ugotovili le pri eni četrtini bolnikov, le pri 2 odstotkih vseh bolnikov pa proteinurijo nefrotskega območja (28). Zbrali smo urin na 0, 3, 6 dpi in ugotovili, da so se ravni beljakovin v urinu povečale na 3 dpi, kar je akutna faza okužbe. Koncentracija beljakovin v urinu je bila znatno povečana in povprečna vrednost je bila blizu 0.3 g/L pri 3 dpi pri okuženih miših Nlrc3−/− in miših WT (slika 4E).

Za pregled infiltriranih vnetnih celicledvičnaintersticija po okužbi s HTNV smo opravili imunohistokemijsko (IHC) barvanje s CD3, F4/80 in CD11b. Rezultati so pokazali, da se je skupina imunskih celic, pozitivnih na CD3, infiltrirala vledvičnaintersticija po okužbi s HTNV (slika 5A) in mieloidne celice, pozitivne na CD11b, so se pojavile v kortikalnem tubulointersticiju (slika 5B). Delež infiltriranih celic CD3 plus T in CD11b plus mieloidnih celic je znatno višji pri okuženih miših Nlrc3-/- kot pri miših WT, vendar so bili makrofagi, pozitivni na F4/80, porazdeljeni po vsej ledvični skorji in meduli in niso pokazali pomembnega razlika med tema dvema vrstama miši (slika 5C).

Okužba s HTNV je povzročila močan citokinski odziv pri miših Nlrc3−/−

O prekomerni proizvodnji vnetnih citokinov pogosto poročajo pri osebah s HFRS, kar je povzročilo hipotezo, da ima disregulacija citokinov lahko ključno vlogo pri patogenezi bolezni. Vaheri idr. (8) so ugotovili, da so različne celice, kot so makrofagi, monociti in limfociti, proizvedle več citokinov kot odgovor na pro-vnetne signale, kot je virusna okužba. Wang et al. poročali, da so bile serumske koncentracije TNF-a, IL-6, IFN-g, IL-8, IP-10 in RANTES (vendar ne IL-4) močno povišane pri bolnikih s HFRS (29) v primerjavi s kontrolnimi skupinami; in da so bile najvišje koncentracije običajno ugotovljene med febrilno, hipotenzivno in oligurično fazo, zlasti v primerih hudega in kritičnega tipa HFRS. Visoke ravni IL-6 v plazmi so bile povezane s hudoledvičnaodpovedi in trombocitopenije pri HFRS, povzročenem s PUUV, in bi se lahko uporabil kot označevalec resnosti bolezni.

Naši rezultati so pokazali, da je okužba s HTNV povzročila povečano proizvodnjo citokinov, vključno s CXCL-1, CCL-5, IL-6, IL-12, TNF-a in IFN-g v Nlrc3-/- miši in ravni teh citokinov so dosegle vrh pri 6 ali 9 dpi; za primerjavo so imele miši WT šibkejše odzive citokinov v celotnem procesu okužbe (slika 6).

Na koncu smo v tej študiji ugotovili, da po intraperitonealni inokulaciji HTNV miši Nlrc3−/− izgubijo težo,ledvična krvavitevin dilatacijo tubulov. Te značilnosti so bolj podobne kliničnim simptomom HFRS kot kateri koli drugi predhodno objavljeni živalski modeli. Poleg tega so miši Nlrc3−/− pokazale tudi večjo virusno obremenitev v serumu, vranici in ledvicah kot miši WT, miši Nlrc3−/− pa so razvile hematološko motnjo in pomembne patološke spremembe v več organih, kar je povzročilo okužbo s HTNV z Nlrc3−/ − miši kot nov model za preučevanje HFRS.

DISKUSIJA

Tukaj opisani model miši HFRS dokazuje, da miši Nlrc3−/−, okužene s HTNV, predstavljajo ustrezen model majhnih živali, ki se lahko uporabi za oceno cepiv in terapevtikov HFRS. Mišji model Nlrc3−/− je podoben sistematični poškodbi, opaženi pri ljudeh, za katero so značilne trombocitopenija, limfocitopenija, povišane serumske ravni AST (jetrna disfunkcija), LDH, frakcija MB kreatin kinaze in UA(ledvična disfunkcija). Poleg tega so miši Nlrc3-/- razvile izgubo teže in očitnoledvična krvavitev. Replikacijo virusa in histopatološke spremembe v ciljnih organih so odkrili v pljučih, vranici, jetrih in ledvicah. Poleg tega so v krvi, vranici in ledvicah miši Nlrc3-/- našli zmerno višjo raven obremenitve virusne RNA. Za primerjavo so miši WT razvile blage histološke spremembe kljub odkrivanju virusne RNA v krvi, vranici in ledvicah.

Our findings are generally in agreement with what would be expected for HTNV infection-induced HFRS and signify an improvement over previously published animal models. It has been reported that hemorrhagic fever (HF) virus infection in animal models can lead to a spectrum of diseases from asymptomatic to mild and severe and often transient viremia. A transient weight loss usually manifests mild illness, but severe disease showed more significant weight loss (>20 odstotkov ) (30). Na primer, hrčki, okuženi s HTNV po nazalni poti, so povzročili vztrajno asimptomatsko okužbo, za katero je značilna občasna viremija, vendar visoka raven kopij virusnega genoma v pljučih, možganih in ledvicah. Dihurji, okuženi z visokim odmerkom HTNV z injekcijo v mišico, so pokazali postopno zmanjšanje telesne teže (5-12 odstotkov skozi čas), vendar nepoškodovaniledvične funkcije, odsotnost viremije in pomanjkanje prenosa virusa na organe. Pri marmozetkah je intramuskularna injekcija HTNV povzročila visoko stopnjo serokonverzije in proizvodnjo nevtralizirajočih protiteles; dosledno te živali niso imele poškodb ledvic, viremije ali prenosa virusa na organe (13).

Kar zadeva ugotovitev, da hematološke spremembe, opažene le ob eni sami časovni točki, in spremembe citokinov niso pomembne, menimo, da jih je mogoče razložiti z naravo okužbe s HTNV, ki je podobna mnogim drugim virusnim okužbam, ki prizadenejo več organov in zato pogosto težko najti trajne spremembe posameznega parametra. Na splošno so naše ugotovitve v skladu z obstoječim znanjem na tem področju. Poleg tega je odkritje miši Nlrc3−/−, ki so bolj dovzetne za okužbo s HTNV in kažejo številne spremembe, podobne patološkim spremembam HFRS, nov prispevek na tem področju. Splošno sprejeto je, da so človeške vaskularne endotelijske celice glavne tarče za hantavirus , kar vodi do različnih stopenj generalizirane kapilarne dilatacije in edema (31).

Virusne antigene je mogoče najti v kapilarnem endoteliju različnih tkiv (Hantavirusi usmerjajo prepustnost endotelijskih celic tako, da senzibilizirajo celice na faktor vaskularne prepustnosti VEGF, medtem ko angiopoetin 1 in sfingozin 1-fosfat zavirata prepustnost, usmerjeno v hantavirus). Histološka analiza je pokazala, da so opazili ledvico miši Nlrc3-/-ledvičnih tubulihdilatacijo pri 9 dpi, miši Nlrc3-/- z resnejšimi patološkimi spremembami kot miši WT in so vztrajale pri 12 dpi. Pri miših Nlrc3-/- so v ledvicah opazili edem ledvičnih tubulnih epitelijskih celic in izjemno ledvično intersticijsko krvavitev. Nadalje so opazili izrazito ekstramedularno hematopoezo v rdeči pulpi vranice pri 6, 9 in 12 dpi ter dilatacije zarodnega središča in povečano število večjedrnih velikanskih celic pri 12 dpi. Jetra so prav tako pokazala hudo hepatocitno degeneracijo in razpršeno nekrozo na dan 3, 6, 9 in 12 dpi. Pri 6 dpi so opazili vnetje pljuč in zadebelitev alveolarne stene. Ta ugotovitev kaže, da je imela okužba s HTNV pomemben in dolgoročen vpliv na jetra in ledvice pri miših Nlrc3-/-, okuženih s HTNV. Poleg tega so bile miši Nlrc3-/- vidnedilatacija ledvičnih tubulov, intersticijska krvavitev in ledvična disfunkcija po okužbi s HTNV. Raven serumske UA je bila znatno povišana pri 3 dpi, kar je jasen znak ledvične disfunkcije. Koncentracija beljakovin v urinu je bila znatno povečana in povprečna vrednost je bila blizu 0,3 g/L pri 3 dpi pri okuženih miših Nlrc3-/-. Isti trend povečanja UA ni bil opažen pri miših WT. Ti rezultati kažejo, da naš model povzema več patoloških značilnosti človeške okužbe s HTNV.

Protein N (NP) se v celicah, okuženih s hantavirusom, proizvaja v izobilju in ga je mogoče zaznati že 4 ure po okužbi (32). Te značilnosti so glavni razlog, zakaj je končna točka testa ELISA odkrivanje proteina N hantavirusa in imunofluorescenčni testi za oceno števila virusnih delcev in napredovanja virusne okužbe. Različne metode lahko vplivajo na dobljene rezultate in dosežene zaključke. Virusni protein in viremija sta dva različna parametra virusne okužbe in se morda ne spreminjata vedno sinhrono. Rezultati kvantitativne PCR v realnem času so pokazali, da je prišlo do prehodnega zvišanja ravni NP pri 6 dpi v vranici, kjer je virus morda prestal prehodno replikacijo, ki ji je sledil njegov očistek. Kot je bilo pričakovano, so opazili kopičenje virusnih beljakovin po najvišji viremiji, ki se je pojavila pri 3 dpi. Dejansko se je virusna replikacija v vranici in ledvicah vzdrževala na zmerni ravni pri 9 in 12 dpi, spremljala pa jo je sinteza beljakovin N (vranica pri 9 dpi: miši WT: 192 ± 128 kopij na mg; miši Nlrc3−/−: 431 ± ± 229 kopij na mg; vranica pri 12 dpi: miši WT: 160 ± 85 kopij na mg; miši Nlrc3-/-: 226 ± 118 kopij na mg). Vendar pa je količina HTNV NP na ravni beljakovin dosegla najvišjo vrednost na dan 6 pi in je ostala povišana pri 9 in 12 dpi. Razlika v kinetiki kopij virusne RNK in količini beljakovin lahko odraža njihov različni razpad v različnih organih.

Vloga citokinov je običajno bolj zapletena v modelih bolezni. Pri HFRS, ki ga povzroči PUUV, hudoodpoved ledvicin trombocitopenija sta povezana z visokimi ravnmi IL-6 v plazmi (33). Naša analiza je pokazala, da je okužba s HTNV povzročila povečano proizvodnjo citokinov, vključno s CXCL-1, CCL-5, IL-6, IL-12, TNF-a in IFN-g v Nlrc3-/- miši, vendar ne toliko pri miših WT. Omeniti velja, da so pri 9 dpi miši Nlrc3-/- pokazale izjemne patološke spremembe v vranici in ledvicah, ki jih je v tem času spremljal močan citokinski odziv. Te ugotovitve kažejo, da bi lahko bila visoka raven citokinov povezana s patogenezo bolezni.

Če povzamemo, rezultati, o katerih poročamo tukaj, kažejo, da po inokulaciji s HTNV po intraperitonealni poti miši Nlrc3-/- razvijejo izgubo teže, trombocitopenijo, renalna disfunkcija in krvavitev.Ti so bolj podobni kliničnim simptomom HFRS kot kateri koli drugi predhodno objavljeni živalski modeli. Ta model je mogoče uporabiti za oceno možnih cepiv in terapevtikov ter poglobljeno študijo patogeneze HFRS in vivo.