Platforme cepiv proti koronavirusni bolezni 19 (COVID‑19) na osnovi nukleinskih kislin

Povzetek

Pandemija koronavirusne bolezni 2019 (COVID-19) je do danes okužila 673.010.496 bolnikov in povzročila smrt 6.854.959 primerov po vsem svetu. Ogromno truda je bilo vloženega v razvoj bistveno drugačnih platform cepiva proti COVID-19. Cepiva na osnovi nukleinske kisline, sestavljena iz cepiv mRNA in DNA (cepiva tretje generacije), so bila obetavna v smislu hitre in priročne proizvodnje ter učinkovite provokacije imunskih odzivov proti COVID-19. Več na osnovi DNK (ZyCoV-D, INO-4800, AG0302-COVID19 in GX-19N) in mRNA (BNT162b2, mRNA-1273 in ARCoV) odobrene platforme cepiva so bile uporabljene za preprečevanje COVID-19. Cepiva mRNA so v ospredju vseh platform za preprečevanje COVID-19. Vendar imajo ta cepiva nižjo stabilnost, medtem ko so potrebna DNK cepiva z višjimi odmerki za spodbujanje imunskih odzivov. Znotrajcelično dostavo cepiv na osnovi nukleinske kisline in njihovih neželenih učinkov je treba dodatno raziskati. Glede na ponovni pojav skrb vzbujajočih različic COVID-19 sta ponovna ocena cepiva in razvoj polivalentnih cepiv ali pankoronavirusnih strategij bistvena za učinkovito preprečevanje okužb.

koristi dodatka cistanche - kako okrepiti imunski sistem

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity

【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com/Whats App: 0086 18599088692/Wechat: 18599088692

Ključne besede

Koronavirusna bolezen 19 · Cepiva na osnovi nukleinske kisline · Imunost · Zaščita

Ozadje

Konec leta 2019 se je v Wuhanu na Kitajskem pojavil nov koronavirus beta in se hitro razširil po vsem svetu. Koronavirusna bolezen 2019 (COVID-19) ima velik potencial pandemije zaradi visoke stopnje nalezljivosti z visoko smrtnostjo po vsem svetu (Sharma et al. 2020; Su et al. 2020; Wibawa 2021). Zato so potrebna znatna prizadevanja za razvoj učinkovitih cepiv ali terapij proti bolezni (Su et al. 2020). Simptomi bolezni COVID-19 so različni, vključno z blagimi simptomi, podobnimi fusu, pljučnico, sindromom akutne dihalne stiske (ARDS) in smrtnim izidom. Bolniki z rakom, sladkorno boleznijo, srčno-žilnimi boleznimi, starejši odrasli in celo genetsko nagnjeni posamezniki so izpostavljeni največjemu tveganju za resnost COVID-19 (Sharma et al. 2020; Su et al. 2020; Wibawa 2021; Vakil et al. 2022). V skladu s priporočili Svetovne zdravstvene organizacije (WHO) so nošenje mask, uporaba protivirusnih zdravil, socialna distanca in upoštevanje postopkov cepljenja ključnega pomena za nadzor pandemije COVID-19 po vsem svetu (Sharma et al. 2020). Znanstvena prizadevanja za razvoj učinkovitih cepiv proti invazivnim patogenom segajo že mnogo let nazaj (Deb et al. 2020; Zhang et al. 2020; Wibawa 2021). Te platforme cepiv so bile zasnovane tudi proti patogenim bakterijam (Farhani et al. 2019; Jafari in Mahmoodi 2021). V zvezi s tem se razvoj učinkovitega, zaščitnega in varnega cepiva šteje za osrednji preventivni pristop za preprečevanje širjenja hudega akutnega respiratornega sindroma, koronavirusa 2 (SARS-CoV-2) (Moore in Klasse 2020). Zato so različna farmacevtska podjetja in raziskovalne skupine po vsem svetu tekmovale v predstavitvi varnega in učinkovitega cepiva proti COVID-19 za uporabo v mednarodni skupnosti. Ta prizadevanja so razvila druge platforme cepiv za vstop v predklinična in klinična preskušanja in nekatera od njih so bila odobrena (Chen et al. 2021), vključno s tradicionalnimi cepivi, kot so živa ali inaktivirana, podenotna in cepiva na osnovi nukleinske kisline kot cepivi naslednje generacije. (Moore in Klasse 2020). Na podlagi znanstvenih dokazov živa oslabljena cepiva spodbujajo prirojene, celične in humoralne imunske odzive z induciranjem Toll-podobnih receptorjev (TLR) z dolgotrajno imunostjo in lahko razvijejo preobčutljivost. Glavna pomanjkljivost teh cepiv je njihova draga ocena varnosti in učinkovitosti. Inaktivirana virusna cepiva slabo izzovejo celične imunske odzive, kar zmanjša njihovo učinkovitost. Aprila 2020 sta Sinovac in Wuhan Institute of Biological Products (Sinopharm) izdelala inaktivirano cepivo proti COVID-19 (Moore in Klasse 2020; Su et al. 2020). Podenotna cepiva so varna, z nekaterimi pomanjkljivostmi, vključno z nizko imunogenostjo, potrebo po obnovitvenem ali adjuvansu in visokimi stroški (Koirala et al. 2020; Su et al. 2020). Cepiva na osnovi nukleinske kisline so bila razvita na podlagi informacij o zaporedju. Vključujejo zaporedja DNA ali mRNA antigenov, ki v različnih odmerkih močno stimulirajo celični in humoralni imunski odziv. Zaradi njihovih prednosti, kot sta hitra proizvodnja in najzgodnejša cepiva proti COVID-19 v kliničnih preskušanjih, je opazna prednost cepiv na osnovi DNK njihova stabilnost v različnih pogojih shranjevanja (Silveira et al. 2020; van Riel in de pamet 2020). Cepiva na osnovi RNK so prejela več pozornosti farmacevtskih podjetij, kot sta Pfizer/Biotech in Moderna. V nasprotju s cepivi DNA stimulirajo učinkovit humoralni imunski odziv kot ligandi TLR brez adjuvansa, njihovo zaporedje pa je spremenjeno tako, da preprečuje razgradnjo mRNA (Moore in Klasse 2020; van Riel in de Wit 2020; Soiza et al. 2021). Namen tega pregleda je bil oceniti nedavni razvoj cepiv na osnovi nukleinske kisline, vključno s cepivi mRNA in DNA proti COVID-19.

Glavno besedilo

Koronavirusni molekularni mehanizem okužbe in imunski odziv

rastlina cistanche krepi imunski sistem

Genom COVID-19 je pozitivna enoverižna RNA, ki kodira štiri glavne strukturne proteine, sestavljene iz ovojnice (E), konice (S), membrane (M) in nukleokapsida (N) (Stadler in Rappuoli 2005), kot je prikazano na sliki 1a. Človeški SARS-CoV obsega glikoprotein konice (S) kot del ovojnice. Vgradnjo virusa v gostiteljske celice izvede spike protein, ki je sestavljen iz podenot S1 in S2. Imajo bistveno vlogo pri vezavi na receptorje gostiteljske celice, znane kot encim za pretvorbo angiotenzina II (ACE2), za začetek okužbe (slika 1b). Centralna regija domene S1, ki se z visoko afiniteto veže na ACE2, je receptorsko vezavna domena (RBD). V zvezi s tem je interakcija med RBD in ACE2 potrebna za začetek okužbe človeških celic (He et al. 2020). Poleg tega je skrajšanje proteina S bistveno za vstop virusa v gostiteljske celice; po pritrditvi regije RBD na ACE2 gostiteljska proteaza, znana kot TM proteaza serin 2 (TMPRSS2), cepi protein S na domeni S1 in S2, kar vodi do zlitja domene S2 na gostiteljsko celico (Huang et al. 2020). Čeprav so močni imunski odzivi učinkoviti proti COVID-19, preobčutljivosti in citokinski nevihti (večinoma interlevkin-6-, IL-1b, GM-CSF-, interferon- / IFN-, faktor nekroze / TNF -, IL-10-, IL-2- in IL- 7-pogonski odzivi) morajo biti prepovedani (Chowdhury et al. 2020). Po virusni pritrditvi (interakcija spike-ACE2) in vstopu v dihalne celice fagocitni alveolarni makrofagi in dendritične celice (DC) predstavijo virusne antigene celicam T in aktivirajo T CD4+(celica T pomočnica) in T CD{{37 }} (citotoksična celica T). Nato se sproščajo proinflamatorni citokini, kot so IL6, IL12, TNF in IFN itd., da se soočijo z virusom. Vendar visoke ravni proizvodnje citokinov, ki vodijo do citokinske nevihte, povzročijo poškodbe pljuč (Hosseini et al. 2020). V skladu z znanstvenimi dokazi so pomožne celice T potrebne za eliminacijo virusne okužbe, indukcijo celic B za proizvodnjo protiteles in stimulacijo citotoksičnih celic T (Sharma et al. 2020). Antigenske tarče COVID-19 Pri razvoju varnega in zaščitnega cepiva proti patogenemu organizmu je bistvenega pomena določitev najboljših imunogenih tarč (Lu et al. 2020b). Sprejemanje potencialnih antigenskih tarč je ključnega pomena za provokacijo epitopov celic T in B, da pravilno inducirajo celično in humoralno imunost (Rueckert in Guzmán 2012). Virusni protein S sodeluje z gostiteljskimi celicami preko domene RBD kot esencialni ligand. Domena RBD lahko sproži proizvodnjo nevtralizirajočih protiteles in T-celični imunski odziv proti COVID-19. Potrjena je tudi imunogenost proteina S (Pushparajah et al. 2021). Protein N ima majhno in zelo ohranjeno zaporedje v primerjavi z drugimi virusnimi proteini. Protein N je močno izražen med okužbo z virusom, s pomembnim povezanim humoralnim imunskim odzivom proti COVID-19 med bolniki. Poleg tega se s celičnim odzivom proti proteinu N lahko šteje za ustreznega kandidata za antigen pri oblikovanju cepiva (Dutta et al. 2020). Poleg tega beljakovina M in beljakovina E stimulirata epitope T CD4+ (Wang et al. 2005; Abdelmageed et al. 2020; Dong et al. 2020). Izzivanje močnih imunskih odzivov proti proteinu S je odločilno in potrebno (Buchholz et al. 2004). Protein S vključuje najbolj imunogene epitope celic T in B, ki so znani kot prednostne tarče pri razvoju cepiva proti COVID-19. Uporabljeno je bilo v vseh razvitih cepivih na platformi mRNA, kot so cepiva Pfizer/BioNtech in Moderna.

Slika 1 a Struktura viriona SARS-CoV-2; glavni površinski proteini virusa COVID-19 vključujejo glikoprotein Spike (S), membranske (M) in beljakovine ovojnice (E). Protein S je glavno cepivo in terapevtski cilj, ki sodeluje z receptorjem za angiotenzinsko konvertazo II (ACE2) za sprožitev okužbe. b Domene spike proteina; protein S vključuje S1 (NTD ali neprevedeno domeno in RBD ali receptorsko vezavno domeno) in podenote S2

Zgodovina zdravil na osnovi nukleinskih kislin

Oligonukleotidi so bili vključeni v klinična preskušanja pred več kot 30 leti. Zgodovina uporabe terapevtskih pristopov, ki temeljijo na nukleinskih kislinah, sega v leto 1977, ko so Paterson et al. uporabili nukleinske kisline za uravnavanje izražanja genov (Paterson et al. 1977). Trenutno so bili deležni več pozornosti. Zdravila na osnovi nukleinske kisline so razdeljena v različne kategorije, vključno s protismiselnimi oblikami, ribozimi, mRNA in cepivi na osnovi DNK (Sharma et al. 2014). Sintetični oligodeoksinukleotid je zaviral replikacijo virusa Rousovega sarkoma (RSV), ki je bil komplementaren mRNA RSV in je bil znan kot antisense (Zamecnik in Stephenson 1978). Prvi antisense je bil vnesen v kliniko proti citomegalovirusu (CMV) (Mulamba et al. 1998). Majhna interferenčna RNA (siRNA) ima potencial za zaviranje izražanja genov in je bila prvič opisana leta 1998. Druga skupina majhnih nekodirajočih RNA vključuje mikroRNA (miRNA), ki imajo nepogrešljivo vlogo pri uravnavanju izražanja genov, z funkcije, podobne siRNA in terapevtski potencial (Usman in Blatt 2000; Sharma et al. 2014). Kot že omenjeno, ribozimski razred molekul RNA deluje kot encimi, ki ciljajo na transkripcijo. Ribozimi so vstopili v klinična preskušanja proti raku in nekaterim virusnim okužbam, kot je virus humane imunske pomanjkljivosti (HIV) (Usman in Blatt 2000; Abera et al. 2012). Poleg cepiv na osnovi mRNA in DNK jih uvrščamo med zdravila na osnovi nukleinske kisline, ki so bila uvedena leta 1990 in so bila deležna več pozornosti pri razvoju cepiv za boj proti COVID-19 (Le et al. 2020; Zhang et al. 2020). Glavne prednosti teh skupin cepiv vključujejo njihovo hitro proizvodnjo in visoko specifičnost proti ustreznim ciljnim antigenom (Le et al. 2020).

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

cepiva na osnovi mRNA

Začetna dostava molekul mRNA v gostiteljske celice je vključevala transfekcijo mRNA v celice fibroblastov z uporabo kationskega lipida (Park et al. 2021). Cepiva mRNA vključujejo mRNA antigenov patogenov, ki človeške celice proizvajajo antigenske proteine. Številne prednosti cepiv mRNA vključujejo preprost proizvodni postopek, učinkovito in zaščitno imunost, priročno manipulacijo in industrializacijo ter prilagodljivost za odziv na različice COVID-19 (Kaufman et al. 2016; Fang et al. 2022). Nekateri pristopi, kot je dodajanje zaporedij 5'-cap in Kozak, se uporabljajo z uporabo zaporedij 3'-poli-A in modifikacije nukleozidov mRNA (Borah et al. 2021). Cepiva mRNA se prevedejo v gostiteljev citosol. Zato ni tveganja za vstavljanje gostiteljskih genomov, kar je znano kot njihova glavna prednost. V zvezi s tem so cepiva na osnovi mRNA nedavno prejela več pozornosti kot varen preventivni pristop proti raku in nalezljivim boleznim (Kaur in Gupta 2020). Primarni mehanizem delovanja mRNA cepiv je prikazan na sliki 2.

cepiva na osnovi DNK

DNA cepiva obsegajo več genov, ki kodirajo virusne antigene peptide, izražene s plazmidnimi vektorji in prenesene v celice z elektroporacijo (EP). V primerjavi z drugimi platformami cepiv ponujajo cepiva DNK prilagodljivo in hitro platformo za razvoj cepiv, zaradi česar so fascinantna tehnologija za boj proti razvijajočim se epidemijam, kot je COVID-19. Poleg tega pride do proizvodnje antigena cepiva DNA v tarčnih celicah, kar pomaga pri rekapitulaciji naravne konformacije in posttranslacijske modifikacije virusnega antigena. Glavna pomanjkljivost DNK cepiv je njihova omejena imunogenost. Zato je pomembno razmisliti o strategijah, kot je adjuvans ali uporaba režima glavnega pospeševanja, ki bi lahko povečal potencial cepiva DNK. Poleg tega je integracija nukleinske kisline v DNK gostitelja še en problem biološke varnosti, ki ima za posledico onkogenezo in mutagenezo (Rauch et al. 2018). Čeprav je glede na predhodne študije tveganje vstavitve cepiva DNA zanemarljivo, WHO in FDA priporočata uporabo varnosti cepiva DNA za integracijo (Wang et al. 2004; Schalk et al. 2006). Cepiva DNK prenašajo gene koronavirusa v človeške celice. Princip cepljenja je odvisen od dostave DNK v celično jedro, tako da se začne transkripcija antigena in sledi translacija. DNA cepiva običajno uporabljajo plazmide kot vektorje. Glede na način dajanja cepiva so obravnavani tako miociti kot keratinociti. Vendar pa se lahko celice, ki predstavljajo antigen v bližini mesta injiciranja, transfektirajo neposredno z uporabo cepiv DNK. V takšnih primerih postopek navzkrižnega pripravka predstavlja antigene z uporabo obeh glavnih molekul histokompatibilnega kompleksa (MHC-I/II) (Hobernik in Bros 2018). Ustvarjeni antigeni se sproščajo z uporabo apoptotičnih teles ali eksosomov, zaradi česar jih celice, ki predstavljajo antigen, prepoznajo, kar posledično izzove celični in humoralni imunski odziv. Za ustvarjanje močnega imunskega odziva se uporabljajo različne strategije dostave (Donnelly et al. 2005; Li in Petrovsky 2016; Strizova et al. 2021). Kar zadeva imunsko regulacijo med okužbo s COVID-19, je bilo ugotovljeno, da bolniki s tveganjem za perikardialni izliv z napačno prognozo kažejo povišane CD3+CD8+ celice T in zmanjšano CD{{ 18}}HLA-DR in T regulatorne (Treg) celice (Duerr et al. 2020). Ti rezultati kažejo, da se huda okužba pojavi zaradi neuravnoteženega imunskega odziva, ki poslabša bolezenska stanja (Tay et al. 2020). Napredek cepiva proti COVID-19 je bil namenjen razvoju učinkovitega in ustreznega imunskega odziva (vključno z obema rokama) brez napredovanja k takšnemu neravnovesju (Hobernik in Bros 2018). Medtem ko so klinična preskušanja cepiv DNK na ljudeh sprožila popolne odzive, so ti odzivi pogosto neustrezni, da bi spodbudili sprejemljive klinične prednosti. Poleg tega lahko osnovne komponente plazmidne DNA, na primer nemetilirane sekvence CpG, povzročijo aktivacijo prirojenih imunskih odzivov, kar poveča adaptivne imunske odzive proti izraženim antigenom. Tako so DNK cepiva bolj uporabna v veterinarski medicini (Coban in sod. 2013; Silveira in sod. 2017; Hobernik in Bros 2018). Zaradi te pomanjkljivosti se nekatere raziskovalne smeri osredotočajo na optimizacijo in dostavo cepiv DNK, vključno z optimizacijo kodona, oblikovanjem promotorja, molekularnimi adjuvansi, aplikacijo EP, cepljenjem s prvim pospeševanjem ali metodami "omics" za napredno oblikovanje cepiva (Li et al. 2012; Silveira et al. 2020). Slika 3 prikazuje glavne stopnje mehanizmov cepiva DNA pri učinkovitem imunskem odzivu.

Slika 2 Formulacija mRNA cepiva, dajanje in mehanizmi imunske provokacije: formulacija mRNA z lipidnim nanodelcem (LNP) ohranja in povečuje stabilnost zaporedja. b Fiziološka raztopina cepiva mRNA-LNP se daje intramuskularno. c MRNA, ki vsebuje LNP, se preko endocitoze transfektira v celice, ki predstavljajo antigen (APC). MRNA se sprosti v citoplazmi in prevede v virusne proteine, nato jih proteasom lizira in se vežejo na glavni histokompatibilni kompleks I (MHC-I) na površini endoplazmatskega retikuluma in predstavijo T citotoksičnim (Tc) celicam

Potencial cepiv na osnovi mRNA- in DNA

Struktura cepiva na ravni mRNA vsebuje elemente za izboljšanje stabilnosti in izražanja beljakovin, vključno s 3'UTR, kodirnim zaporedjem, 5'UTR, 5' pokrovčkom in poli (A) repom (Liu 2019). 5' in 3' UTR elementa, ki obkrožata kodirno sekvenco, pridobljeno iz virusnih ali evkariontskih genov, povečata strukturno stabilnost in izboljšata prevajanje mRNA, ki sta bistvena dejavnika za cepiva (Ross in Sullivan 1985; Holtkamp et al. 2006). Za učinkovito prevajanje beljakovin iz mRNA je potrebna struktura 5' cap (Martin et al. 1975; Ross in Sullivan 1985). Rep poli (A) mRNA ima tudi regulatorno vlogo pri stabilnosti in prevodu mRNA (Holtkamp et al. 2006). Poleg tega ima uporaba kodona ključno vlogo pri prevajanju beljakovin. V zvezi s tem se za povečanje prevajanja beljakovin iz mRNA redke kodone nadomesti z uporabljenimi sinonimnimi kodoni, ki imajo veliko sorodne tRNA v citosolu (Stepinski et al. 2001). Drug pristop za optimizacijo zaporedja je obogatitev vsebine G:C. Več metod je v zadnjih letih razvilo učinkovita in varna kandidata za DNK cepiva. V platformi cepiv, ki temelji na DNK, se plazmidni vektorji, pridobljeni iz bakterij, uporabljajo za izražanje tistih želenih antigenov v gostiteljskih celicah. Bakterijske plazmide je treba vnesti v evkariontske celice in jih prenesti v jedro. DNK se nato prepiše in prevede iz tujih genov v jedru oziroma citoplazmi gostiteljske celice. Zato je načrtovanje ustreznega plazmida z visoko transfekcijsko učinkovitostjo in izražanjem beljakovin bistvenega pomena za dosego močnega cepiva DNA (Malone et al. 1989). Zaporedje evkariontske regije (v plazmidih cepiv DNA), pred vstavljenim genom, je sestavljeno iz promotorja in signala poli A (poliA) (AAU AAA), ki se nahaja na 3' koncih antigenskega zaporedja (Shan et al. 2011). Promotorji so kritični elementi, potrebni v plazmidih DNA cepiva, da izzovejo visoke ravni izražanja želenih antigenov v gostiteljskih celicah (Becker et al. 2008) in povzročijo transkripcijo mRNA iz vstavljenega gena. Najpogosteje uporabljen promotor v DNA cepivih vključuje promotor humanega citomegalovirusa (CMV). Signal zaporedja poliA povzroča stabilnost in prenos mRNA ter učinkovito izražanje evkariontskega gena. Drugi kritični element je Kozakova sekvenca (ACCATGG), ki ima ključno vlogo pri prevajanju z evkariontskim ribosomom. Poleg tega je dodajanje enega ali dveh zaporedij stop-kodona potrebno, da se izognemo nepravilnemu prevodu vstavljenega gena v gostiteljski celici (Becker et al. 2008; Williams 2013). Primerjava platform cepiva DNA in mRNA Čeprav se cepiva DNA in mRNA razvijajo od devetdesetih let prejšnjega stoletja ter nedavnega razvoja in licenciranja različnih veterinarskih cepiv DNA, se je veliko navdušenje obrnilo na mRNA. Oba potrebujeta prizadevanja za izboljšanje njihove antigenosti, stabilnosti in učinkovitosti z neposredno manipulacijo plazmidne DNA in mRNA ali dodajanjem imunomodulatorjev ali adjuvansov ter formulacij in sistemov za dostavo (Liu 2019). Trajanje stabilnosti mRNA je nižje kot pri plazmidni DNA. Ugotovljeno je bilo, da cepiva DNA hitro ustvarijo kodirane beljakovine, saj so večje količine kot cepiva mRNA zaradi večje intrinzične stabilnosti plazmidne DNA. Ugotovljeno je bilo, da plazmidna DNA vztraja v mišicah do 6 mesecev v neintegriranem načinu (Ledwith et al. 2000). Čeprav naj bi bila cepiva DNA in mRNA ekspresijski sistem za najljubši protein, nobeno ni imunološko inertno. Poleg tega plazmidi DNA in mRNA stimulirajo prirojeno imunost (Campbell 2017). Tehnologija cepiva na osnovi DNK in mRNA morda ni povsem splošna. mRNA je bolj zapletena kot plazmidna DNA zaradi spremenjenih nukleozidov in formulacij, potrebnih za dostavo, stabilnost in potrebe po nadzoru intrinzične imunostimulacijske aktivnosti mRNA. Kljub temu koristi proizvodnji, ki se izogiba povpraševanju po vsakem celičnem ali živalskem proizvodu. Obljuba je, da bodo klinični dosežki izvedljivi po tem, ko bodo izzivi plazmidne DNK in mRNA rešeni s cepivi, zlasti z uporabo naprednih tehnologij za preprečevanje in zdravljenje bolezni (Liu 2019).

Slika 3. Proces izražanja DNA cepiva proti COVID-19 v celicah, ki predstavljajo antigen (dendritične celice ali DC). Plazmidna DNA vstopi v jedro DC in izraža antigene in vivo (1) Nato se antigeni predstavijo celicam T (celični receptorji T ali TCR) prek molekul MHC-I in MHC-II. Predstavitev antigena poteka prek molekul DC CD80/86 in molekul CD28 celic CD8+T poleg MHC-I-TCR ter tudi preko celic DC CD40 in CD4+T celic CD40L poleg Interakcije MHC-II-TCR (2a, 3 in 4) Aktivacija in proliferacija celic CD8+T ter sproščanje citokinov vodi do učinkovitih imunskih odzivov, kot je aktivacija makrofagov (2b) Poleg tega aktivacija CD 4+Celice T po vezavi in ​​učinki citokinov iz DC so povezane z aktivacijo celic B, proliferacijo in izločanjem protiteles (5)

Napredek pri dostavi cepiv DNK in mRNA

Vnos tuje DNA in RNA v evkariontske celice ni učinkovit v primerjavi z virusnimi vektorji. Vzpostavljenih je bilo veliko pristopov fizične dostave za povečanje zmogljivosti celičnega privzema (Mellott et al. 2013). Fizične metode genske transfekcije vključujejo dostavne sisteme, ki prenašajo genski material z mehanskimi postopki, vključno z EP in projektorskimi napravami (Gulce-Iz in Saglam-Metiner 2019). Naprave Biojector izkoriščajo pritisk CO2 za transport terapevtikov skozi IM (intramuskularno), ID (intradermalno) in tudi SC (subkutano) dajanje brez igle (Jorritsma et al. 2016), kar daje precejšnje prednosti pred običajnim injiciranjem z iglo, vključno z zmanjšanjem neželeni učinki, navzkrižna kontaminacija z iglo in poškodbe zaradi vboda z iglo (Zhang et al. 2015). Pomembno je, da sta bili dve DNA cepivi ocenjeni proti virusu zika v preskušanju faze I, kar je pokazalo povečane celične odzive po dajanju brez igle v primerjavi z uporabo igle (Gaudinski et al. 2018). Poleg tega je platforma za dostavo mRNA cepiva proti steklini, ki uporablja projektor, razkrila okrepljene odzive protiteles (Alberer et al. 2017). Povečano učinkovitost cepiva zaradi vbrizgavanja s curkom je mogoče pripisati širši porazdelitvi cepiv, kar ima za posledico večji vnos z uporabo APC (Williams et al. 2000; Alberer et al. 2017). Trenutno se v kliničnih študijah za dajanje cepiva DNK običajno uporabljajo injekcije ID ali IM, ki jim sledi EP (Sardesai in Weiner 2011). EP vključuje tvorbo por v kožnih celicah za povečanje celičnega vnosa genskega materiala z uporabo električnih impulzov (Pushparajah et al. 2021). Metoda IM EP je bila primarno uporabljena leta 1998 (Aihara 1998) za izboljšanje prodornosti mišičnih celic za dostavo cepiv DNK (Rizzuto et al. 1999; Dupuis et al. 2000; Sokołowska in Błachnio-Zabielska 2019). Številna poročila so razkrila boljšo ekspresijo antigena in povečane antigen-specifične imunske odzive in vivo z uporabo EP (Yan et al. 2008; Yan et al. 2009). Poročalo se je, da je cepivo HIV DNA, ADVAX, povečalo imunogenost po prenosu skozi EP (Vasan et al. 2011) v primerjavi z IM aplikacijo (Vasan et al. 2010). Kljub temu pristop EP trpi zaradi tveganja celične smrti zaradi uporabe visokih napetosti (Gulce-Iz in Saglam-Metiner 2019). Novi pristopi dostave, kot je EP, se še preiskujejo za dostavo cepiva RNA.

koristi cistanche za moške - krepitev imunskega sistema

Učinkovitost EP za dostavo cepiva s samopomnoževanjem je bila podobna kot za cepiva s plazmidno DNA v smislu izražanja genov in imunskih odzivov pri miših (Cu et al. 2013). Vendar pa EP ni povečal učinkovitosti dajanja tradicionalnih cepiv RNA brez razmnoževanja (Johansson et al. 2012), kar bi lahko zmanjšalo njegovo učinkovitost pri podvajanju vektorjev RNA. Skladno s tem sta EP in bioinjektorja ugodna za parenteralno injiciranje cepiv DNA/RNA COVID-19. Ti pristopi prispevajo k večji proizvodnji in dostavi kandidatov za cepivo DNK ter izjemno izboljšajo rezultate (Pushparajah et al. 2021).

Prednosti in omejitve cepiv na osnovi nukleinske kisline

Kot nove in obetavne metode imunizacije cepiva na osnovi nukleinske kisline zagotavljajo vpogled v razvoj varnega in zaščitnega cepljenja (Choi in Chang 2013), kot so pokazali milijoni ljudi med pandemijo COVID-19. Cepiva na osnovi nukleinske kisline imajo kratke razvojne cikle, kar omogoča hitro distribucijo med pandemijo. Uporaba cepiv z rekombinantno DNA zahteva učinkovit prenos vektorja DNA v jedro, transkripcijo in nato translacijo v želeni antigen (Leitner et al. 1999). Zaradi priročne manipulacije in nizkocenovne proizvodnje je gola plazmidna DNA fascinanten vektor za predstavitev antigenov (Williams 2013). Običajno plazmidna DNK obsega osnovne genetske elemente, vključno z genom, ki kodira antigen, promotorjem, ojačevalci in sekvencami za terminacijo transkripcije/poliadenilacijo (Vogel in Sarver 1995). Platforma plazmidne DNA je obetaven biofarmacevtski konstrukt, ki se v visokih ravneh replicira v poceni prokariontskih celicah, čeprav zahteva čiščenje (Prazeres et al. 1999; Ferreira et al. 2000; Suschak et al. 2017). Cepiva RNA so sestavljena iz molekul mRNA, ki vsebujejo antigensko RNA, obdano s 3', poli-A repom in 5' konci in nimajo zahteve po transkripciji. (Zhang et al. 2019). Več cepiv RNK se samopomnoži, kar je znano kot nova tehnologija v razvoju. V skladu s tem se lahko molekula RNA replicira in prevede v gostitelju po porodu, kljub možnosti gole nestabilnosti RNA, s čimer se poveča izražanje imunogenih peptidov (Pardi et al. 2018; Zhang et al. 2019; Wadhwa et al. 2020) . MRNA razgradijo vseprisotni encimi ribonukleaze (Wadhwa et al. 2020; Xu et al. 2020). Dodatek 3' poli-A repa in 5'–7-metilgvanozinski pokrovček je ključnega pomena za povečanje stabilnosti in prevoda mRNA v citosolu (Gallie 1991; Schlake et al. 2012). Strategije za povečanje vnosa in izražanja cepiva so bile ocenjene predvsem za cepiva DNK kot za cepiva RNK, saj DNK zahteva prečkanje dveh celičnih membran, da doseže jedro. Nasprotno pa RNA prodre v citoplazmo skozi eno samo membrano (Rauch et al. 2018). Struktura DNK ima primerljivo večjo stabilnost. Več kot 7 let je bilo ugotovljeno, da je plazmidna DNK ostala nedotaknjena brez razlike, pri čemer je bila na novo dana DNK shranjena pri –20 stopinjah (Walther et al. 2013; Pushparajah et al. 2021). Nizek pH in temperatura sta kritična za dolgotrajno ohranjanje celovitosti DNK. Nasprotno pa je RNA izjemno občutljiva na temperaturo in jo je treba vzdrževati pri –70 stopinjah v mediju brez encimov, da se podaljša njena razpolovna doba (Jones et al. 2007).

Izzivi pri razvoju cepiv na osnovi nukleinskih kislin

Dobro je znano, da morajo biti cepiva proti COVID-19 učinkovita in dovolj zaščitna (Graham 2020) ter izzvati dolgotrajno imunost. Vendar pa je letno cepljenje mogoče na podlagi letnih izkušenj s cepivom proti gripi (Randolph in Barreiro 2020; van Riel in de Wit 2020). Razvoj cepiva proti COVID-19 predstavlja izzive tudi z novimi platformami. Kljub visoki imunogenosti in zaščiti proteinskega cepiva proti koronavirusu povzroča zaskrbljenost pojav mutacij in ponovni pojav virusa. Zato je napoved časa in lokacije pojava bolezni skupaj z natančnim sprejetjem zaporedja ciljnih proteinov glavna stopnja razvojnega procesa, ki zahteva ustrezno izvedbo kliničnih preskušanj (Lurie et al. 2020). Glavni izziv cepiv DNK je izzvati relativno nižje imunske odzive pri ljudeh in velikih živalih kot pri sistemih malih živali (Grunwald in Ulbert 2015; Suschak et al. 2017). V zvezi s cepivi proti COVID-19 je treba obravnavati še dodatne izzive, kot so trajnost zaščite, učinkovitost v določenih podskupinah, preprečevanje prenosa virusov in sprejemanje javnosti (Pushparajah et al. 2021). Zakasnjena ekspresija antigena v samopomnoževalnih cepivih mRNA lahko omeji učinkovitost teh cepiv. Vendar ta platforma daje višje donose in tako zagotavlja enakovredno zaščito pri znatno nižjih odmerkih (Vogel et al. 2018; Strizova et al. 2021).

Nedavni napredek pri cepivih proti DNK in mRNA proti COVID-19

Pri razvoju cepiva proti COVID{{0}} so se številne študije osredotočale na platforme cepiva mRNA (Verbeke et al. 2021), kar je vodilo do odobritve več cepiv (Vitiello in Ferrara 2{{ 94}}21), kot so podjetja Moderna in Pfizer/BioNtech. Cepivo Moderna vključuje celotno kodiranje mRNA glikoproteina konice COVID-19, medtem ko Pfizer/BioNtech vsebuje zaporedje mRNA RBD (Brüssow 2020). Stopnji učinkovitosti cepiv Pfizer/BioNTech in Moderna sta 95 % oziroma 94,5 % (Rauch et al. 2021; Widge et al. 2021). Temperatura shranjevanja cepiva Moderna je med −25 stopinj in −15 stopinj, medtem ko je temperatura shranjevanja cepiva Pfzer med −80 stopinj in −60 stopinj (Meo et al. 2021; Rauch et al. 2021). V primerjavi s cepivom Moderna ima cepivo Pfizer/BioNTech nižje stroške in stranske učinke (Rauch et al. 2021). Kitajski raziskovalci so razvili še eno mRNA cepivo proti COVID-19, ki je uporabilo termostabilno (vsaj en teden pri 25 stopinjah) mRNA, ki kodira RBD (Brüssow 2020). V drugi raziskavi je bil CureVac uporabljen kot zasnovana platforma mRNA proteina S polne dolžine za razvoj cepiva proti COVID-19 z nadomestki v dveh ostankih prolina za izboljšanje stabilnosti proteina (Rauch et al. 2021). Ruklanthi de Alwis et al. (2021) so razvili samoprepisujoče in podvajajoče se mRNA cepivo za COVID-19 z uporabo proteina S polne dolžine in replikona (de Alwis et al. 2021) s potencialom uporabe kot učinkovito in varno cepivo z enim odmerkom za boj proti COVID- 19 (de Alwis et al. 2021). Podobno je bila uporabljena samopomnoževalna RNA, ki kodira protein COVID-19 S inkapsulirana v lipidnem nanodelcu (LNP), ki je orisala visoke titre protiteles in celičnih imunskih odzivov (McKay et al. 2020). Za SARS-CoV so bili razviti nekateri kandidati za cepiva DNK, kot so cepiva na osnovi beljakovin S, N in M. Med temi je cepivo DNA na osnovi proteina S učinkovito povzročilo zaščitni učinek proti okužbi s COVID-19, verjetno zaradi ključne vloge proteina S pri vezavi na receptor (Zhao et al. 2020). INO-4800 je kandidat za DNK cepivo proti COVID-19, ki kodira protein COVID-19 S (Sarwar et al. 2020; Smith et al. 2020). Predklinični rezultati pri miših in morskih prašičkih so pokazali humoralni in celični imunski odziv. V kliničnih študijah faze I sta bila dva odmerka INO-4800 injicirana preko ID poti, dopolnjena z EP prek CELLECTRA®2000 Inovio Pharmaceutical (Diehl et al. 2013; Amante et al. 2015). Popoln imunski odziv je bil razložen na podlagi protitelesnih in celičnih odzivov pri 34 od 36 udeležencev njihove prve faze kliničnega preskušanja. Opazili so deset neželenih učinkov (AE), o katerih so poročali, brez resnih neželenih učinkov (SAE) (faza). Začelo se je klinično preskušanje faze I/II za oceno imunogenosti, varnosti in prenašanja INO- 4800 (Tebas et al. 2019). INO-4800 ima podobne pogoje shranjevanja (Smith et al. 2020), v upanju na enostavnejšo distribucijo cepiva. Poleg tega so nekatere druge skupine cepiv proti DNK virusa COVID-19 začele preskušanja. Junija 2020 je klinično preskušanje faze I in IIa za GX-19 začelo zaposlovanje. DNK cepivo, AG0301-COVID-19, proizvedeno s skupnimi poskusi Univerze v Osaki (Japonska), Takaro Bio in AnGes, je julija 2020 sprožilo zaposlovanje za klinična preskušanja faze I in II za oceno njegovo imunogenost in varnost (Speiser in Bachmann 2020). Izvedena sta bila klinična preskušanja faze I in II za oceno imunogenosti in varnosti treh odmerkov ZyCoV-D (Kumar et al. 2021). To peroralno cepivo je kodiralo spike protein v plazmidni DNA, dinamično pomnožen v živi Bifidobacterium longum, dobro prepoznavni črevesni probiotični bakteriji. Začelo se je še eno klinično preskušanje faze I za oceno CORVax12, cepiva z DNK, ki kodira beljakovino spike. Raziskovali so učinkovitost elektroporiranega CORVax12 samega ali v kombinaciji z drugim plazmidom, ki kodira interlevkin 12 (IL-12). Različna cepiva mRNA proti COVID-19 so v razvoju in so razkrila obetavne rezultate (Leitner et al. 1999; Croyle et al. 2001). Raznolik pristop k razvoju RQ3013-VLP (ki kodira proteine ​​S, E in M) je bil učinkovit in vivo z uporabo koktajla mRNA. To mRNA cepivo je bilo integrirano s spremenjenimi nukleozidi in nato zapakirano v LNP ter razkrilo sposobnost izzvati močne celične in humoralne imunske odzive pri miših (Le et al. 2020; Lu et al. 2020a). Ustvarjeno cepivo z DNA domeno arginil-glicil-asparaginske kisline (RGD) v dveh odmerkih po 60 µg z uporabo elektroporacije je izboljšalo učinke pri miših BALB/cJ (Guo et al. 2021). Injekcija IM + jet cepiva DNA v enem odmerku (0,2 mg) bi lahko imunizirala sirske hrčke (Brocato et al. 2021). Drugo cepivo z DNK, ki je uporabljalo protein S v treh odmerkih, je zaščitilo Rhesus macaques (Yadav et al. 2021). Fuzija RBD z amino-terminalom preS1 virusa hepatitisa B in IM injekcija za tri odmerke (teden 0, 2 in 4) pri miših C57BL/6 je sprožila humoralni in celični imunski odziv (Jeong et al. 2021). Poleg tega je IM injekcija plazmidne DNA proteina S in podenote S1 (rekombinantnega proteina) v treh odmerkih v tednih 0, 2 in 8 pri Rhesus makakih stimulirala nevtralizirajoča protitelesa (Prompetchara et al. 2021). Injekcija IM+EP proteina S v treh odmerkih (tedni 0, 2 in 4) pri miših ICR je spodbudila humoralne in celične odzive (Li et al. 2021). Druga cepiva DNA v kliničnih preskušanjih so vključevala protein S v fazah I/II junija 2022 (NCT04445389, IM pot pri odraslih, starih 18–50 let), julija 2021 (NCT04463472, IM pot pri odraslih, starih 20–60 let), September 2021 (NCT04527081, IM pot pri odraslih, starih 20–65 let) in faza I (NCT04336410, ID pot pri 18 letih in več), februar 2022 (NCT04334980, peroralno pri odraslih, starih 18 let in več) in junij 2021 ( NCT04591184, IM pot pri odraslih 18–84 let). Poleg tega so cepiva mRNA v kliničnih preskušanjih vključevala tista v fazi II novembra 2021 (NCT04515147, IM, 18–60 let), fazi II–III decembra 2022 (NCT04368728, IM pri odraslih, starih 18–85 let) in fazi I junija 2021 (NCT04566276, IM pri odraslih, starih 18–75 let). COVID-eVax je bilo cepivo na osnovi RBD, ki je po 38 dneh izzvalo zadosten imunski odziv pri miših, belih dihurjih in podganah (Conforti et al. 2022). Dve (X-19 in GX-19N) DNA cepivi, ki kodirata proteine ​​spike in nukleokapside, sta bili ovrednoteni v preskušanjih faze I med odraslimi, starimi od 19 do 49 let, in vezavna protitelesa so bila zaznavna pri drugem odmerku cepljenja. Varnost in prenašanje teh cepiv sta bili potrjeni, pri čemer je GX-19N povzročil višje ravni celic T in odzive protiteles (Ahn et al. 2022). Xcl1-SARS-CoV-2 cepivo s koničasto fuzijo DNA je izzvalo višjo stopnjo odzivov, ki jih posredujejo protitelesa in T-celice, v primerjavi s plazmidno vsebujočim koničastim genom posamično in vitro in in vivo (Qi et al. 2022). Nedavno bakulovirusno cepivo COVID-19 Delta DNA bi lahko zaščitilo 100 % miši pred COVID-19 (Jang et al. 2023). Linearna DNA (linDNA), ki kodira SARS-CoV-2 RBD (Lin-COVIDeVax), je lahko izzvala odzive protiteles in celic T ter zagotovila varnost in brez škodljivih učinkov (Conforti et al. 2023). Tabela 1 predstavlja klinična preskušanja in odobrena cepiva proti COVID-u na osnovi nukleinske kisline-19. Po posodobljenih podatkih je po vsem svetu 229.820.324 posameznikov prejelo cepiva proti COVID-19, med katerimi so imeli tisti iz afriških držav nižjo stopnjo cepljenja (https://www.usnews.com/news/coronavirus-and -novice-cepiva, https://www.bloomberg.com/graph ics/covid-vaccine-tracker-global-distribution/). V skladu s tem je stopnja cepljenja povezana z gospodarskimi razmerami v različnih regijah/območjih.

Morebitni pomisleki glede varnosti cepiv proti COVID-19

Spremljanje varnosti pri vsakem razvitem preventivnem ali profilaktičnem cepivu je eden bistvenih vidikov. Uporaba strupenih kemikalij ali celične kulture ni potrebna v postopkih proizvodnje cepiva mRNA, zato je znana kot varna platforma. Kratek čas izdelave tudi zmanjša tveganje kontaminacije z mikroorganizmi (Wang et al. 2020). Najpogosteje poročani učinki vključujejo glavobol, utrujenost in druge resne sistemske dogodke, kot so zvišana telesna temperatura, mrzlica, mialgija, bruhanje, bolečine v trebuhu in redka poročila o driski. Vendar pri prejemnikih mRNA cepiva niso opazili smrti (Chapin-Bardales et al. 2021; Skowronski in De Serres 2021). O nekaterih sistemskih neželenih učinkih, kot je anafilaksija, običajno poročajo pri posameznikih z anamnezo alergij in so ocenjeni na 2,5–11,1 primerov na milijon odmerkov (Shimabukuro et al. 2021). Močan imunski odziv pri ljudeh, ki so mlajši od drugih, lahko vodi do velikih sistemskih dogodkov in poročajo o več stranskih učinkih po injiciranju drugega odmerka cepiva v primerjavi s prvim odmerkom (Male 2021; Skowronski in De Serres 2021). Poleg tega so poročali o bolečini na mestu injiciranja, rdečini in oteklini kot najbolj lokalnih stranskih učinkih (Anand in Stahel 2021). Na podlagi zadostnih dokazov odobrenih cepiv mRNA, vključno s Pfizer/BioNTech in Moderno, ni bilo dokazano tveganje za spontane splave v nosečnosti (stopnja=0 %) (Moški 2021). Opazno je, da so cepiva DNK dovolj varna, vendar niso vedno imunogena; zato so za zadosten imunski odziv potrebni dodatni odmerki. Humoralni imunski odziv v preskušanjih na ljudeh ni bil dosleden, medtem ko se celična imunost zdi pogostejša. V skladu s tem je varnost cepiv DNK med starejšimi in mlajšimi prebivalci bolj ugodna (Ledgerwood et al. 2011; Houser et al. 2018; Carter et al. 2019). Pomisleki glede varnosti namigujejo na možno integracijo transfektirane DNK v zarodno linijo in somatske celice gostitelja. V teh primerih lahko pride do disregulacije izražanja genov skupaj z več znatnimi mutacijami. Kljub temu se pri razvoju cepiva DNA običajno uporabljajo samo ekstrakromosomski plazmidi in plazmidi s pomanjkljivo kromosomsko integracijo. Poleg tega večina plazmidov ostane na mestu aplikacije (Schalk et al. 2006). Nedavni sistematični pregled in metaanaliza sta pokazala, da so cepiva mRNA povezana z večjimi neželenimi učinki v primerjavi z drugimi platformami (Kouhpayeh in Ansari 2022). Nedavno so opazili redek primer miozitisa, povezanega s cepivom BNT162b2 mRNA, pri 34-letni ženski (Magen et al. 2022). Metilacija DNA in ustrezne epigenetske spremembe prav tako motijo ​​učinkovitost cepiv DNA in mRNA (Pang et al. 2022). Opazno je več odobrenih cepiv z nukleinsko kislino (ZyCoV-D, DNA plazmidno cepivo, uporabljeno intradermalno, Indija), BNT162b2 (mRNA, 2 odmerka, Nemčija), mRNA- 1273 (Moderna, ZDA, 2 odmerka), ARCoV (WALVAX, Kitajska) in klinična preskušanja, vključno s 302-COVID19 (DNA plazmidno cepivo, faza II/III intramuskularno, Japonska), INO-4800 (DNA plazmid, faza II/III, intradermalno, Kitajska), GX{{36 }}N (DNK cepivo, Genexine, faza II/III), Covigenix VAX-001 (DNK cepivo, Entos Pharmaceuticals, faza I/II, intramuskularno), COVID-eVax (DNK cepivo, faza I/II, intramuskularno , Rim) in bacTRL-Spike (DNA cepivo, faza I, oralno, Symvivo) sta bila razvita (Sheridan 2021; Liu in Ye 2022a). Ta cepiva so spodbudila tako humoralno kot celično imunost, razen proti GX-19N in AG0302- COVID-19. Nekateri neželeni učinki cepiv na osnovi nukleinske kisline COVID-19 vključujejo bolečino, limfadenopatijo, eritem, rdečico, oteklino, slabost, utrujenost, artralgijo, mialgijo, zvišano telesno temperaturo, kardiorespiratorni zastoj, možgansko kap, preobčutljivostno reakcijo, alkoholno bolezen jeter, Bellovo paralizo , paroksizmalna ventrikularna aritmija in smrt (Norquist et al. 2012; McNeil in DeStefano 2018; Baden et al. 2021; Momin et al. 2021; Liu in Ye 2022b, 2022a).

Feniletanol glikozid je glavna aktivna sestavina Cistanche deserticola

Zaključek

Hitra pandemija COVID{0}} je povzročila neizpolnjeno potrebo po razvoju učinkovitih cepiv za preprečevanje bolezni. Čeprav je imunogenost DNA cepiv pri živalih sprejemljiva, je klinična validacija pri ljudeh upravičena. Cepiva RNA lahko zagotovijo ustrezne imunološke lastnosti in znatne prednosti pred cepivi DNA. Težave z nestabilno naravo RNA so bile obravnavane z uporabo ustreznih pristopov shranjevanja in formulacij za zaustavitev njene razgradnje. Varnost cepiva je prav tako pomembna in je ne bi smeli ogrožati zaradi večje učinkovitosti. Za nadzor širjenja COVID-19 obstajajo odobrena cepiva na osnovi nukleinske kisline. Nadaljevati je treba spremljanje udeležencev. Obstaja potreba po učenju o stranskih učinkih cepiva proti COVID-19 na osnovi nukleinske kisline. Poleg tega je ponovna ocena cepiv in razvoj polivalentnih cepiv ali pan-koronavirusnih strategij obetavna glede na ponovni pojav skrb zbujajočih novih različic.

Tabela 1 Klinična preskušanja in odobrena cepiva proti COVID-19 ter njihove značilnosti

Reference

Abdelmageed MI et al (2020) Oblikovanje večepitopskega peptidnega cepiva proti proteinu E človeškega COVID-a-19: imunoinformatični pristop. Int J Biomed Clin Anal. https://doi.org/ 10.1155/2020/2683286

Abera G, Berhanu G, Tekewe A (2012) Ribozimi: encimi nukleinske kisline s potencialno farmacevtsko uporabo: pregled. Pharmacophore 3: 164–178

Ahn JY et al (2022) Varnost in imunogenost dveh cepiv proti COVID-19 z rekombinantno DNA, ki vsebujeta kodirne regije konice ali konice in nukleokapsidnih proteinov: vmesna analiza dveh odprtih, nerandomiziranih preskušanj 1. faze pri zdravih odraslih. Lancetni mikrob 3: e173–e183. https://doi.org/10.1016/ S2666-5247(21)00358-X

Aihara H (1998) Miyazaki J. prenos gena v mišico z elektroporacijo in vivo. Nat Biotechnol 16:867–870. https://doi.org/10. 1038/nbt0998-867

Alberer M et al (2017) Varnost in imunogenost mRNA cepiva proti steklini pri zdravih odraslih: odprto, nerandomizirano, prospektivno, prvo klinično preskušanje prve faze pri ljudeh. Lancet 390:1511–1520.https://doi.org/10.1016/s0140-6736(17)31665-3

Amante DH et al (2015) Vzorci transfekcije kože in kinetika izražanja dostave plazmidov, izboljšane z elektroporacijo, z uporabo CELLECTRA-3P, prenosne naprave za dermalno elektroporacijo naslednje generacije. Metode človeške genske terapije 26:134–146. https:// doi.org/10.1089/hgtb.2015.020

Anand P, Stahel VP (2021) Pregled varnosti cepiv mRNA proti covid-19: pregled. Patient Saf Surg 15:20. https://doi.org/10.1186/ s13037-021-00291-9

Baden LR et al (2021) Učinkovitost in varnost cepiva mRNA-1273 SARS CoV-2. N Engl J Med 384: 403–416. https://doi.org/10. 1056/NEJMoa2035389

Becker PD, Noerder M, Guzmán CA (2008) Genetska imunizacija: bakterije kot nosilci dostave cepiva DNA. Hum Vaccin 4:189–202.https://doi.org/10.4161/hv.4.3.6314

Borah P et al (2021) Pogledi na kandidate za cepivo RNA za COVID-19. Sprednji Mol Biosci. https://doi.org/10.3389/fmolb. 2021.635245

Brocato RL et al (2021) Zaščitna učinkovitost cepiva SARS-CoV-2 DNA pri divjih in imunosupresiranih sirskih hrčkih. Npj Vaccines 6:1–7.https://doi.org/10.1038/s41541-020-00279-z

Brüssow H (2020) Prizadevanja za cepivo proti COVID-19. Environ Microbiol 22: 4071–4084. https://doi.org/10.1111/1462-2920. 15225

Buchholz UJ et al (2004) Prispevki strukturnih proteinov koronavirusa hudega akutnega respiratornega sindroma k zaščitni imunosti. Proc Natl Acad Sci 101:9804–9809. https://doi.org/ 10.1073/pnas.0403492101

Campbell JD (2017) Razvoj adjuvansa CpG 1018: študija primera. Vaccine Adjuv. https://doi.org/10.1007/ 978-1-4939-6445-1-2

Carter C et al (2019) Varnost in imunogenost preiskovanega cepiva DNA hemaglutinina proti sezonski infuenci, ki mu sledi trivalentno inaktivirano cepivo, aplicirano intradermalno ali intramuskularno pri zdravih odraslih: odprto randomizirano klinično preskušanje 1. faze. PLoS One 14:e0222178. https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0222178

Chapin-Bardales J, Gee J, Myers T (2021) Reaktogenost po prejemu cepiv proti COVID-19 na osnovi mRNA. JAMA. https://doi. org/10.1001/jama.2021.5374

Chen Y, Cheng L, Lian R, Song Z, Tian J (2021) Raziskave cepiv proti COVID-19 se osredotočajo na varnost, učinkovitost, imunoinformatiko ter proizvodnjo in dostavo cepiv: bibliometrična analiza, ki temelji na VOSviewerju. Biosci Trendi. https://doi.org/10.5582/bst.2021. 01061

Choi Y, Chang J (2013) Virusni vektorji za aplikacije cepiva. Clin Exp Vaccine Res 2:97.https://doi.org/10.7774/cevr.2013.2.2.97

Chowdhury MA, Hossain N, Kashem MA, Shahid MA, Alam A (2020) Imunski odziv pri COVID-19: pregled. J Okužite javno zdravje. https://doi.org/10.1016/j.jiph.2020.07.001

Coban C, Kobiyama K, Jounai N, Tozuka M, Ishii KJ (2013) DNK cepiva: preprosta snov za zaznavanje DNK? Hum Vaccin Immunother 9: 2216–2221.https://doi.org/10.4161/hv.25893

Conforti A et al (2022) COVID-eVax, kandidat za cepivo z elektroporirano DNK, ki kodira SARS-CoV-2 RBD, izzove zaščitne odzive na živalskih modelih. Mol Ther 30:311–326. https://doi. org/10.1016/j.ymthe.2021.09.011

Conforti A, Sanchez E, Salvatori E, Lione L, Compagnone M, Pinto E et al (2023) Kandidat za cepivo z linearno DNK, ki kodira vezno domeno receptorja SARS CoV-2, izzove močan imunski odziv in nevtralizirajoča protitelesa pri domačih mačkah. Klinika Mol Ther-Metho Dev 28: 238–248. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2022. 12.015

Croyle M, Cheng X, Wilson J (2001) Razvoj formulacij, ki povečujejo fizično stabilnost virusnih vektorjev za gensko terapijo. Gene Ther 8:1281–1290.https://doi.org/10.1038/sj.gt.3301527

Cu Y et al (2013) Izboljšana dobava in moč samopomnoževalnih mRNA cepiv z elektroporacijo in situ. Cepiva 1:367–383. https://doi.org/10.3390/vaccines1030367