Ekstrakt oljčnih listov (OLE) oslabi promet z akvaporinom-2, ki ga povzroči vazopresin, prek aktivacije receptorja za zaznavanje kalcija

Za več informacij. kontakt:tina.xiang@wecistanche.com

Vazopresin (AVP) poveča prepustnost vode vledvičnazbiralni kanal z regulacijo trgovine z akvaporinom-2 (AQP2). Številne motnje, vključno s hipertenzijo in neustreznim izločanjem antidiuretičnega hormona (SIADH), so povezane z nenormalnostmi v homeostazi vode. Izkazalo se je, da so nekatere fito spojine koristne za zdravje ljudi. Tu so bili učinki izvlečka oljčnih listov (OLE) ocenjeni z uporabo modelov in vitro in in vivo. Konfokalne študije so pokazale, da OLE preprečuje z vazopresinom povzročeno translokacijo AQP2 na plazemsko membrano v celicah MCD4 in podganahledvice. Inkubacija z OLE zmanjša od AVP odvisno povečanje koeficienta osmotske prepustnosti za vodo (Pf). Za pojasnitev možnih učinkov OLE je bil ovrednoten znotrajcelični kalcij. OLE poveča znotrajcelični kalcij z aktivacijo receptorja za zaznavanje kalcija (CaSR).NPS2143 , selektivni zaviralec CaSR, je odpravil zaviralni učinek OLE na prepustnost vode, odvisno od AVP. Poskusi in vivo so pokazali, da zdravljenje z OLE poveča izražanje mRNA CaSR in zmanjša mRNA AQP2, vzporedno s povečanjem miRNA, ki cilja na AQP2--137. Te ugotovitve skupaj kažejo, da OLE antagonizira delovanje vazopresina s stimulacijo CaSR, kar kaže, da je ta izvleček lahko koristen za ublažitev motenj, za katere je značilno nenormalno signaliziranje CaSR in vpliva na reabsorpcijo vode v ledvicah.

Listi oljčnega drevesa se pogosto uporabljajo kot tradicionalno zdravilo za zdravljenje številnih bolezni, zlasti v sredozemskih državah. Listi se običajno uživajo v prehrani ljudi kot izvleček ali prah za pripravo poparkov ali zeliščnega čaja. Analiza kemijske karakterizacije je pokazala, da listi oljčnega drevesa vsebujejo več bioaktivnih spojin, ki lahko blagodejno vplivajo na nekatere bolezni, kot so presnovni sindrom, dislipidemija in hipertenzija. Pri bolnikih z esencialno hipertenzijo je OLE znižal krvni tlak ter rahlo zmanjšal glikemijo in kalciemijo. Ugotovljeno je bilo, da so številni polifenoli, kot so oleuropein, hidroksitirozol in tirozol, obogateni z izvlečkom zelenega oljčnega lista (OLE)5, za katere je znano, da sodelujejo pri preprečevanju nekaterih bolezni, za katere je značilen oksidativni stres. Zato se v zadnjih nekaj letih med znanstveniki na različnih področjih raziskav povečuje zanimanje za raziskovanje morebitnih koristnih učinkov izvlečka oljčnih listov. OIE je pokazal pomemben antiproliferativni učinek v celicah malignega mezotelioma s spreminjanjem intracelularne dinamike kalcija, verjetno usmerjenega na T- tip Ca2 plus kanalov. Zanimivo je, da je bilo ugotovljeno, da ima OLE antihipertenzivne učinke na genetsko hipertenzijo pri podganah s spontano hipertenzijo (SHR), kar je povezano z izboljšanjem vaskularne funkcije*. Prekomerna reabsorpcija vode igra pomembno vlogo v patogenezi zvišanega krvnega tlaka. Pri hipertenzivnih bolnikih, zdravljenih z izvlečkom oljčnih listov, so ugotovili znatno zmanjšanje več vnetnih dejavnikov, povezanih z znižanjem krvnega tlaka. Poleg tega je prekomerno zadrževanje vode značilno za številne bolezni, kot so ciroza jeter, srčno popuščanje in neustrezno izločanje antidiuretičnega hormona (SIADH). Homeostazo vode v telesu močno nadzoruje antidiuretični hormon vazopresin (AVP), ki se sprošča v dehidriranem stanju. AVP veže svoj sorodni receptor V2R, lokaliziran na bazolateralni membraniledvičnaglavne celice in tako aktivirajo signalno pot cAMP, ki povzroči translokacijo veziklov, ki vsebujejo akvaporin-2(AQP2), iz znotrajceličnega bazena v apikalno plazemsko membrano, kjer pride do reabsorpcije vode. Na molekularni ravni lahko več dejavnikov spremeni vodno ravnovesje v ledvicah. Povišana raven luminalnega kalcija je znižala kratkoročno od vazopresina odvisno trgovanje z AOP2 z aktivacijo receptorja za zaznavanje kalcija (CaSR)1,12. Po drugi strani pa je aktivacija CaSR v pogojno imortaliziranih ledvičnih proksimalnih tubularnih epitelnih celicah, izoliranih iz človeškega urina, povzročila znatno povečanje citosolnega kalcija in znatno zmanjšalo povečanje cAMP, ki ga je izzval forskolin (FK), neposredni aktivator adenilat cvclase3. v celicah ledvičnega zbiralnega kanala MCD4, ki stabilno izražajo vodni kanal AOP2, je stimulacija CaSR oslabila od cAMP odvisno povečanje fosforilacije AQP2 pri serinu 256, ki je ključni dogodek v kaskadi transdukcije signala, ki jo aktivira vazopresin, in ki je sčasoma povečala prepustnost za vodo4 ,15 Poleg tega vledvicarezine iz notranje medule mišje ledvice je aktivacija CaSR s kalcimimetikom NPS-R568 povzročila znatno povečanje AQP2-ciljne miRNA-137, kar potrjuje tesno medsebojno delovanje med signalno potjo CaSR in AQP{ {4}}odvisna prepustnost vodel.17. V tej študiji so bili učinki izvlečka oljčnih listov, pridobljenega iz lokalne sorte Coratina, ovrednoteni na z vazopresinom inducirano funkcijo AQP2 v celicah ledvičnega zbiralnega kanala MCD4, ki stabilno izražajo AOP2 in v dDAVP zdravljenih podgan, ki so jim vbrizgali ekstrakt. Ponujamo dokaze, da zdravljenje z OLE preprečuje odziv vazopresina v ledvičnih celicah, kar bi lahko delno pojasnilo njegov diuretični učinek. Zanimivo je, da se zdi, da je ta učinek povezan z OLE-inducirano aktivacijo CaSR, receptorja, za katerega je znano, da ima negativno medsebojno delovanje z receptorjem vazopresina12.

Preberite več o učinkih cistanche na ledvice

Rezultati

Učinki OLE na z vazopresinom inducirano funkcijo AQP2 v celicah MCD4. Da bi raziskali možno vpletenost OLE v od vazopresina odvisno delovanje AQP2,ledvičnacelice zbiralnega kanala MCD4, ki stabilno izražajo receptor vazopresina 2 (V2R) in človeški AQP2, so bile uporabljene kot eksperimentalni model18. Konfokalne študije (slika 1A) so pokazale, da je v primerjavi s celicami, zdravljenimi z dDAVP, v katerih je barvanje z AQP2 lokalizirano na apikalni plazemski membrani, zdravljenje z OLE preprečilo lokalizacijo AOP2 na membrani, inducirano s stimulacijo z dDAVP. V skladu s temi opažanji je zdravljenje z OLE oslabilo z dDAVP povzročeno povečanje časovnega osmotskega odziva (označeno kot 1/t na sliki 1B) (OLE/dDAVP=88.70±1.86 odstotkov, n=292 celic v primerjavi z dDAVP=206.8±5,49 odstotka, n=186 celic;p<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="191 cells" vs="" ole/ddavp="88.70±1.86%,n=292"><0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Učinki OLE v ledvicah podgan, ki so jim vbrizgali OLE.

Za nadaljnjo preiskavo delovanja OLE so bile izvedene študije in vivo. Natančneje, podganam so injicirali OLE (250 mg/kg/dan) enkrat na dan tri dni. Alternativno so podgane sočasno zdravili z OLE 3 dni in dDAVP 30 min. Vrednotenje CaSR mRNA, ki je bila izolirana iz ledvičnega zbiralnega kanala podgan in obdelana za PCR v realnem času (slika 6), je razkrila znatno povečanje CaSR mRNA v OLE(OLE=1.87±0.29, n{{ 10}} podgan proti CTR=1.02±0.17, n=5 podgan; p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="">ledvica, western blotting analiza in konfokalne študije (slika 9). Pri podganah, ki so jim vbrizgali OLE/dDAVP, je bila fosforilacija AQP2 pri serinu 256 znatno zmanjšana v primerjavi z ledvičnim tkivom živali, zdravljenih z dDAVP (OLE/dDAVP=0). 77±0.16, n=5 podgan v primerjavi z dDAVP=2.16±0.25,n=5 podgan; p<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

Diskusija

Kalcij je pomemben znotrajcelični posrednik, ki uravnava množico celičnih funkcij2. Nenormalno signaliziranje kalcija lahko povzroči več bolezni, vključno s srčnim popuščanjem, rakom in hipertenzijo23. Specifična kontrola izražanja in aktivnosti proteinov, ki nadzorujejo več intracelularnih kalcijevih signalov, se je izkazala za uspešno pri soočanju s številnimi motnjami in je zato privlačna za razvoj zdravil. Ta študija ponuja nove vpoglede v mehanizem delovanja OLE, tako da pokaže njegovo sposobnost moduliranja intracelularnega signaliziranja kalcija s stimulacijo CaSR, ki je vključena v fino uravnavanje prometa in izražanja AQP2, ki ga povzroča vazopresin. V fizioloških pogojih ima AQP2 pomembno vlogo pri nadzoru homeostaze vode v telesu25. Stimulacija intracelularnega mehanizma, ki vodi do lokalizacije AQP2 na apikalni plazemski membrani, povzroči nenormalno zadrževanje vode in posledično hiponatriemijo, kot pri sindromu neustreznega izločanja antidiuretičnega hormona (SIADH), cirozi jeter in kongestivnem srčnem popuščanju. Pri miših modela SIADH, povezanega s haploinsuficienco policistične ledvične bolezni 1, je bila bazalna znotrajcelična raven kalcija znatno zmanjšana v primerjavi z ravnjo, izmerjeno v zbiralnih kanalih miši divjega tipa. Nizek intracelularni kalcij je znižal aktivnost nekaterih encimov, vključno s proteinsko fosfatazo PP2A, kar je povzročilo povečano regulacijo fosforilacije AOP2 pri serinu 2561. Nasprotno. aktivacija CaSR s kalcimimetikom NPS-R568 je povečala znotrajcelično koncentracijo kalcija in zmanjšala raven cAMP v celicah s pomanjkanjem PKD1. Pomembno je, da lahko citosolni kalcij zniža kalcijevo inhibirano adenilirano ciklazo3 in tako fino uravna znotrajcelično raven cAMP. V celicah MCD4 je stimulacija CaSR z NPS-R568 dejansko zmanjšala AQP2-pS256 z inhibicijo adenilata ciklazo4. V tej študiji je zdravljenje z OLE preprečilo od vazopresina odvisno povečanje cAMP in AOP2-pS256, verjetno sekundarno zaradi povečanja znotrajcelične koncentracije kalcija. Omeniti velja, da je izpostavljenost zunanjemu viru cAMP z uporabo prepustnega 8-Br-cAMP znatno preprečila zaviralni učinek OLE na pot V2R.

Povišana raven citosolnega kalcija lahko povzroči celično smrt in apoptozo. Vendar pa je trajno povečanje znotrajceličnega kalcija s 250 nM na več kot 600 nM spodbudilo nevronsko preživetje4. V celicah MCD4 zdravljenje z OLE pri 0,1 mg/ml ne kaže citotoksični učinek. Pri tej koncentraciji je OLE (0,1 mg/ml) rahlo povečal znotrajcelično raven kalcija. Slikanje s kalcijem je razkrilo, da je akutna stimulacija z OLE povzročila prehodno povečanje znotrajceličnega kalcija z aktivacijo CaSR, ki se odpravi, ko so bile celice predhodno inkubirane s selektivnim antagonistom CaSR NPS2143. V celicah proksimalnih tubulov ledvic alosterična aktivacija CaSR z I-ornitinom zmanjšal proizvodnjo ROS in s tem znižal mitohondrijski oksidativni stres, ki je povzročil celično apoptozo356. Poleg tega je naša prejšnja študija pokazala, da je izražanje variant povečanja funkcije CaSR zmanjšalo sproščanje ROS in S-glutationilacijo AQP237. Inkubacija z OLE je zmanjšala nastajanje ROS v celicah MCD435, kar je pokazalo njegovo antioksidativno sposobnost. Kljub temu trenutno ni jasno, ali OLE vpliva na AOP2-S-glutationilacijo. Številne študije so pokazale, da ima lahko OLE ali oleuropein, ki je glavna sestavina OLE, zaščitno vlogo z zaviranjem celične smrti,39 Vendar so bili pri podganah, ki so prejemale OLE, opisani učinki, odvisni od odmerka. Koristni odzivi so bili doseženi pri odmerkih 250 in 500 mg/kg. Nasprotno pa ima lahko zdravljenje z OLE pri višjih koncentracijah škodljive učinke, verjetno zaradi prooksidativnega delovanja več fitospojin. V tej študiji so podganam tri dni injicirali OLE v odmerku 250 mg/kg, kar je pokazalo uravnavanje CaSR. Raven izražanja CaSR povečajo nekatere spojine, ki delujejo kot alosterični aktivatorji receptorja. Kalcimimetiki so dejansko zmanjšali vaskularne kalcifikacije s povečanjem biosinteze CaSR v gladkih mišičnih celicah človeških žil0. V tem tekmovanju ni mogoče izključiti možnosti, da lahko nekatere spojine v OLE delujejo kot alosterični modulatorji CaSR. Po drugi strani pa lahko stimulacija z vazopresinom povzroči sproščanje IL-6, ki lahko prispeva k povečanju stopnje izražanja CaSR42.

V ledvicah je stimulacija signalizacije CaSR povezana z znižano regulacijo izražanja AQP2, verjetno prek generacije miR-137. miRNA so ključni posttranskripcijski modulatorji. Opisanih je bilo tudi več od vazopresina odvisnih miRNA, ki ciljajo na izražanje AQP243. Transfekcija z miR-32 in miR-137 je znatno zmanjšala raven izražanja AOP2 v celicah mpkCCDc14. Zanimivo je, da lahko OLE oslabi vnetne signale in izvaja zaščitne učinke z moduliranjem ravni izražanja več miRNA". Zlasti v celicah multiformnega glioblastoma je OLE spodbujal izražanje različnih miRNA, vključno z miR-13745, ki je vključena v znižanje regulacije signalna pot Akt/mTOR 46. Treba je opozoriti, da zdravljenje z oleuropeinom prepreči signalizacijo Akt/mTOR prek aktivacije s kalcijem induciranih CAMK in AMPK. Aktivacija CaSR z NPS-R568 aktivira AMPK in zmanjša aktivnost mTOR v človeških proksimalnih tubularnih celicah3. V skladu s temi ugotovitvami inkubacija z OLE poveča citosolni kalcij, zmanjša aktivnost PKA in zmanjša velikost ciste v modelu 3D-celične kulture48. Te ugotovitve skupaj kažejo, da je lahko OLE koristen pri zdravljenju motenj, za katere je značilna disregulacija znotrajcelične kalcijeve dinamike, povezane z znižanjem signalizacije CaSR.

Izvleček oljčnih listov je sestavljen iz več bioaktivnih sestavin, vključno s polifenoli, vlakni in minerali49. Trenutno ni jasno, ali je lahko ena spojina ali sinergična kombinacija fitospojin v OLE koristna pri moduliranju znotrajceličnih odzivov. Ekstrakt, uporabljen v tej študiji, je bil uporabljen kot možen aditiv za živila, zato je pomembno opredeliti fiziološki učinek samega ekstrakta, glede na to, da lahko več fenolov, vključno s hidroksitirozolom, filtrirajo ledvice in se pridobijo v urinu50. Nadaljnje študije bodo zagotovile učinkovitost specifičnih komponent, ki lahko aktivno uravnavajo intracelularno signaliziranje kalcija skozi CaSR. Za zaključek ta študija zagotavlja dokaze, da se OLE lahko šteje za nov potencialni adjuvans, uporaben za ublažitev motenj, za katere je značilno zmanjšanje izražanja CaSR ter signaliziranje in vplivanje na ledvično prepustnost vode.

Materiali in metode

Kemikalije in protitelesa.Vse kemikalije in antibiotiki so bili kupljeni pri Mercku (Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija). Calcein-AM, Fura-2-AM, gojišča celične kulture, fetalni goveji serum (FBS) in kemiluminiscenčne substrate Super Signal West Pico so bili kupljeni pri Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA). Aquaporin{ {2}}(AQP2) je bilo odkrito z uporabo specifičnih protiteles (C-tail Ab), pridobljenih proti sintetičnemu peptidu, ki ustreza zadnjih 15 C-terminalnim aminokislinam človeškega AQP2!. Protitelesa AQP2-pS256 je prijazno podaril profesor Peter Deen. Sekundarna kozja anti-kunčja protitelesa proti hrenu na peroksidazo so bila pridobljena pri Mercku (Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija). Sekundarno kozje protitelo proti kuncu, povezano z Alexa-488, je bilo kupljeno pri Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA).

Proizvodnja ekstrakta, bogatega s fenoli, in kemična karakterizacija.Proizvodnja s fenoli bogatega ekstrakta iz oljčnih listov je bila izvedena, kot je navedeno v Ranieri et al.35. Po mletju z mešalnikom (Waring-Commercial, Torrington, CT, ZDA) smo dodali vodo ddH2O (razmerje 1/20, w/y) in nato trikrat izpostavili ultrazvoku (CEIA, Viciomaggio, Italija). , vsakič 30 minut pri 35±5 stopinj. Nazadnje smo ekstrakte filtrirali skozi filtrirni papir, liofilizirali in shranili pri -20 stopinji C. Dobljene ekstrakte smo filtrirali z najlonskimi filtri 0,45 μm（Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija） in uporabili za kemijsko karakterizacijo. Celotna vsebnost fenola, antioksidativna aktivnost in identifikacija posameznih fenolnih spojin je bila izvedena po Difonzo et al.. OLE je pokazala vsebnost polifenolov, določeno s Folin-Ciocalteu, enako 195 mg. ekvivalenti galne kisline (GAE) in antioksidativna aktivnost, določena z ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-diamonijeva sol sulfonske kisline), kar predstavlja 750 μmol TE （ekvivalent troloksa) .

Celična kultura in zdravljenje.Kot eksperimentalni model so bile uporabljene mišje kortikalne zbiralne celice MCD4, ki stabilno izražajo človeški AQP2 in himerni V2R-Rluc18. Celice smo gojili v mešanici 1:1 Dalbec-cos modificiranega Eagleovega medija in F-12, dopolnjenega s 5 odstotki (y/y) fetalnega govejega seruma. 1 odstotek (y/y) L-glutamina in 1 odstotek penicilina/streptomicina, 5 μM deksametazona, 400 ug/ml G418（za odpornost na AQP2） in 1 ug/ml puromicina (za odpornost na V2R-Rluc) , v vlažnem ozračju s 5 odstotki CO, pri 37 stopinjah . Celice MCD4 smo pustili v bazalnem stanju (CTR) ali dolgoročno obdelane z OLE pri 0,1 mg/ml O/N, dDAVP pri 100 nM za 30 minut ali sočasno obdelane z OLE in dDAVP ali NPS2143 pri 1 μM O/N Alternativno so bile celice izpostavljene 8-Br-cAMP pri 500 μM za 45 minut. Kratkotrajne poskuse smo izvedli z OLE pri 1 mg/ml za 5 minut in NPS2143 pri 10 μM za 15 minut. Poskusi so bili izvedeni 3-5 neodvisno z uporabo celic iz različnih prehodov.

Živalski model in zdravljenje.Vsi postopki so bili izvedeni v skladu z danskimi nacionalnimi smernicami za nego in ravnanje s poskusnimi živalmi ter objavljenimi smernicami nacionalnega inštituta za zdravje. Protokole je odobril Inštitut za klinično medicino. Univerza Aarhus, v skladu z dovoljenji za uporabo poskusnih živali, ki jih je izdalo dansko ministrstvo za pravosodje (številka odobritve 2015-15-0201-00658). Študije so bile izvedene na odraslih samcih podgan Wistar z začetno težo 200-225 g. Živali so bile na standardni dieti za glodalce (Altromin, Lage, Nemčija) in so imele prost dostop do vode iz pipe. Med poskusi so bile podgane nameščene v skupinah po dve na kletko, s ciklom svetlo-tema 12:12 ur, temperaturo 21±2 stopinj C in vlažnostjo 55±2 odstotka. Pet podgan je bilo zdravljenih s subkutano injekcijo 1 ng dDAVP (Sigma-Aldrich, Glostrup, Danska) v 200 ul fiziološke raztopine/žival, pet podgan, zdravljenih z nosilcem, pa je služilo kot kontrola. Po 30 minutah smo podgane usmrtili in ledvice obdelali, kot je opisano spodaj.

Celice in lizati IMCD.Celice smo gojili na {{0}} mm posodah in resuspendirali v pufru, ki je vseboval 220 mM manitola, 70 mM saharoze, {{10}}. 5 M EGTA pH 8,0,0,5 M EDTA pH 8,0,1 M Tris-HCl pH 7,4 v prisotnosti proteaz (1 mM PMSF, 2 mg/ml leupeptina in 2 mg/ml pepstatina A) in fosfataz (10 mM NaF in 1 mM zaviralci natrijevega ortovanadata). Alternativno smo pripravili približno 0,5 mm velike odseke ledvic in jih 10 minut uravnotežili v pufru, ki je vseboval 1-8 mM NaCl, 16 mM Hepes, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glukoze, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgSO4 in 1,8 mM KH2PO4 (pH 7,4). Ledvično papilo smo zdrobili s škarjami v istem pufru v prisotnosti proteaz (1 mM PMSF, 2 mg/mlleupeptina in 2 mg/mlpepstatina A) in fosfataz (10 mM NaF in 1 mM natrija). orthovanadate) inhibitorji. Po sonikaciji (60 kHz za 5 s) smo lizate centrifugirali pri 12,000×g 10 minut. Supernatante smo zbrali in uporabili za študije imunoblotinga'8.

Konfokalna mikroskopija.Konfokalne študije so bile izvedene, kot je opisano prej1. Na kratko, celice smo gojili na PET vložkih celične kulture in obdelali, kot je opisano zgoraj. Alternativno so bili odseki ledvic, pridobljeni iz kontrolnih, OLE, dDAVP in OLE z dDAVP zdravljenih podgan, izpostavljeni imunofluorescenčnim poskusom, kot je opisano prej. Slike so bile pridobljene s konfokalnim lasersko skenirajočim fluorescenčnim mikroskopom Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Heerbrugg, Švica). Gel elektroforeza in imunobloting. Proteini so bili ločeni na 12-odstotnih poliakrilamidnih gelih brez madežev (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ZDA) pod redukcijskimi pogoji, kot je opisano prej=5,52. Na kratko, proteinske trakove smo prenesli na membrane Immobilon-P (Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija) in jih imunoblotirali z uporabo protiteles anti-AQP2 (Pre-C-tail Ab) in anti-AQP2-pS256. Imunoreaktivni signali so bili pridobljeni z uporabo kemiluminiscenčnih substratov Super Signal West Pico s sistemom Chemidoc (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ZDA). Trakovi so bili normalizirani na celotne beljakovine s tehnologijo brez madežev (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ZDA). Analiza denzitometrije je bila izvedena z uporabo ImageLab (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ZDA) in analizirana z uporabo GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, ZDA).

Test vodoprepustnosti.Osmotska prepustnost vode je bila izmerjena, kot je opisano prej43. Na kratko, celice MCD4 so bile gojene na 40- mm steklenih pokrovnih stekelcih. Po zdravljenju so celice naložili z 10 μM membransko prepustnim Calcein-AM 45 minut pri 37 stopinjah, 5 odstotkih CO v DMEM/F-12. Pokrovnice so bile nameščene v perfuzijski komori (FCS2 Closed Chamber System, BIOPTECHS, Butler, ZDA). Meritve so bile izvedene z invertnim TE2000-S mikroskopom (Nikon Eclipse microscope, Tokio, Japonska), opremljenim za enocelične fluorescenčne meritve in slikovna analiza. Vzorci, napolnjeni s Calcein-AM, so bili vzbujeni pri 490 nm. Meritve fluorescence po izosmotskih (140 mM NaCl.5 mM KCl, 1 mM MgCl..1 mM CaCl., 10 mM Hepes sulfonske kisline, 5 mM glukoze, pH 7,4) ali hiperosmotskih (izosmotski raztopini dodamo 135 mM manitola) raztopinah . so bile izvedene s programsko opremo Metafluor (Molecular Devices, MDS Analytical Technologies, Toronto, Kanada). Zabeleženi so bili podatki o časovnem poteku fluorescence po perfuziji celic z izo- in hiperosmotskimi raztopinami. Časovni potek krčenja celic je bil izmerjen kot časovna konstanta (Ki, izražena kot 1/r, s), parameter v korelaciji s prepustnostjo za vodo, pridobljen s prilagajanjem podatkov z eksponentno funkcijo, analizirano z uporabo GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego) , CA, ZDA).

Meritve fluorescenčnega resonančnega prenosa energije.Za ovrednotenje znotrajceličnih sprememb cAMP je bila uporabljena tehnologija fluorescenčnega resonančnega prenosa energije (FRET). Za poskuse FRET so bile celice transfektirane s plazmidom, ki kodira senzor H96, ki vsebuje cAMP-vezavni konsenzni motiv EPAC1, vdelan med cian fluorescentni protein (CFP) in cp173Venus-Venus, kot je bilo prej prikazano 32.33.54. Plazmid, ki kodira sondo H96, je bil dar dr.K. Jalink. Vizualizacija celic, ki izražajo ECFP in/ali EYFP, ter detekcija FRET je bila izvedena z invertnim mikroskopom TE2000-S (mikroskop Nikon Eclipse, Tokio, Japonska). Vsaka slika je bila popravljena in analizirana, kot je bilo prikazano prej55.

Meritve znotrajceličnega kalcija. Meritve znotrajceličnega kalcija so bile izvedene, kot je prikazano prej56. Na kratko, celice MCD4 smo naložili s 4 μM Fura-2 AM 15 minut pri 37 stopinjah v DMEM/F-12. Med poskusom smo za perfuzijo celic uporabili Ringerjevo raztopino, ki je vsebovala 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM glukozo, 1,8 mM CaCl, pH 7,4. Pri meritvah fluorescence so bila pokrovna stekelca s preobremenjenimi celicami nameščena v perfuzijsko komoro (FCS2 Closed Chamber System. BIOPTECHS. Butler, ZDA). Meritve so bile izvedene z invertnim mikroskopom TE2000-S (Mikroskop Nikon Eclipse, Tokio, Japonska). Razmerje intenzivnosti fluorescence pri 340 in 380 nm je bilo narisano in izračunano kot sprememba fluorescence. Zlasti stimulacijo z OLE（1 mg/ml） ali NPS2143 （10 μM） so primerjali v istem tipu celic s tistimi, pridobljenimi po stimulaciji z največjim odmerkom kalcijevega agonista ATP（100 μM）, ki je bil uporabljen kot notranji nadzor (100 odstotkov).

Raven znotrajceličnega kalcija je bila izmerjena v stanju dinamičnega ravnovesja in umerjena, kot je opisal Grynkiewicz57. OLE in NPS2143 sta bila dolgoročno uporabljena pri 0,1 mg/ml oziroma l uM, vsak vzorec pa je bil umerjen z dodatkom 5 μM ionomicina v prisotnosti 1 mM EGTA（Rm.）, čemur je sledilo 5 μM ionomicina v 5 mM CaCl (RMA).

Analiza PCR v realnem času mRNA AQP2 in CaSR pri kontrolnih in zdravljenih podganah.Poskusi PCR v realnem času so bili izvedeni za merjenje relativne ekspresije mRNA v zbiralnem kanalu notranje medule (IMCD), izoliranega iz kontrolnih in zdravljenih ledvičnih papil podgan. Naredili smo rezine ledvic velikosti približno 0,5 mm in jih 10 minut uravnotežili v pufru, ki je vseboval 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glukoze, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgSO4 in 1,8 mM KH2PO4 (pH 7,4). Ledvična papila je bila izolirana pod stereomikroskopom. Vzorce kontrolnih in zdravljenih podgan smo nato zmleli s škarjami neposredno v Trizolu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA). Reverzno transkripcijo smo izvedli na 2,5 ug celotne RNK z uporabo SuperScriptVilo Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA), v skladu s predlogi proizvajalca (25C za 10 minut; 42C za 60 minut; 85C za 5 minut). Pomnoževanje PCR v realnem času je bilo izvedeno z uporabo TagMan Fast Advanced Master Mix s testi CaSR, AOP2 in GAPDH (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) v sistemu StepOne Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA). ), nastavitev temperaturnih ciklov, kot jih je določil proizvajalec (95 stopinj C za 20 s; 40 ciklov izmenično pri 95 °C za 1 s in 60 stopinj C za 20 s). Rezultati so bili izraženi kot 2- vrednosti (relativna kvantifikacija) z △ACt=(Ct target-Ct GAPDH) obdelan-(Ct target-Ct GAPDH)Sham1.

vrednotenje miRNA{0}} pri kontrolnih in zdravljenih podganah.Vsebnost miRNA{{0}} v zbirnem kanalu notranje medule podgan je bila ovrednotena z uporabo naprednih testov miRNA TagMan (has-miR-137; ID testa; 477904 mir; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA .US.A), ki je omogočil visoko občutljivo in specifično obveščanje o zreli miRNA z uporabo kvantitativnega PCR. Izdelali smo rezine ledvice s približno 0,5 mm in jih 10 minut uravnotežili v pufru, ki je vseboval 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM glukoze, 3,2 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,8 mM MgSO4 in 1,8 mM KH2PO4(pH7,4). Ledvična papila je bila izolirana pod stereomikroskopom. Vzorce kontrolnih in zdravljenih podgan smo nato zmleli s škarjami neposredno v Trizolu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA), da smo ekstrahirali celotno RNA. TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit （Katalog n²∶A25576; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA）je bil uporabljen za pridobitev sinteze cDNA, v skladu s protokolom, ki ga je zagotovil proizvajalec (reakcija Poly(A)tailing; reakcija ligacije; reakcija reverzne transkripcije; reakcija miR-Amp). Sintetično RNA (UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG) s 59-fosforjem je sintetiziral Thermo Fisher Scientific in jo uporabil za izvedbo umeritvene krivulje za interpolacijo vrednosti vzorcev miRNA in za pridobitev natančne ocene (v nanogramih) vsebnosti miR-137 v vzorcev16 z uporabo GraphPad Prism (programska oprema GraphPad, San Diego, CA, ZDA).

Statistična analiza.Vse vrednosti so navedene kot povprečje ± SEM. Statistična analiza je bila izvedena z enosmerno ANOVA, ki ji je sledil Newman-Keulsov test večkratnih primerjav z *p<0.05 considered="" statistically="" different="">

Izjave, etična odobritev in soglasje za sodelovanje.Študije na živalih so bile izvedene v skladu z danskimi nacionalnimi smernicami za nego in ravnanje s poskusnimi živalmi ter objavljenimi smernicami nacionalnega inštituta za zdravje. Odbor za etiko oskrbe živali Inštituta za klinično medicino Univerze Aarhus je odobril protokole študije v skladu z dovoljenji za uporabo poskusnih živali, ki jih je izdalo dansko ministrstvo za pravosodje (številka odobritve 2015-15-0201-00658). Avtorji potrjujejo, da so bile vse metode izvedene v skladu z ustreznimi smernicami in predpisi. Poleg tega avtorji potrjujejo, da je bila študija izvedena v skladu s smernicami ARRIVE.

Reference

1. El, SN & Karakaya, S. Oljčno drevo (Olea europaea) pušča možne ugodne učinke na zdravje ljudi. Nutr. Rev. 67, 632–638.

2. Javadi, H., Yaghoobzadeh, H., Esfahani, Z., Reza Memarzadeh, M. & Mehdi Mirhashemi, S. Učinki izvlečka oljčnih listov na presnovni odziv, delovanje jeter in ledvic ter biomarkerje vnetja pri hipertenzivnih bolnikih. PJBS 22, 342–348.

3. Saibandith, B., Spencer, JPE, Rowland, IR & Commane, DM Oljčni polifenoli in presnovni sindrom. Molekule

4. Cherif, S. et al. Klinično preskušanje titriranega izvlečka Olea pri zdravljenju esencialne arterijske hipertenzije. J. Pharm. Belg. 51, 69–71 (1996).

5. Difonzo, GRA et al. Zeleni izvlečki iz oljčnih listov sorte cortina imajo antioksidativno karakterizacijo in biološko aktivnost. J. Funk. Živila 31, 8.

6. Herrero, M. et al. Nove možnosti valorizacije stranskih proizvodov oljčnega olja. J. Chromatogr. 1218, 7511–7520.

7. Marchetti, C. et al. Izvleček oljčnih listov, obogaten z oleuropeinom, vpliva na dinamiko kalcija in zmanjšuje sposobnost preživetja celic malignega mezotelioma. eCAM 2015, 908493.

8. Romero, M. et al. Antihipertenzivni učinki ekstrakta oljčnih listov, obogatenega z oleuropeinom, pri spontano hipertenzivnih podganah. Funkcija hrane 7, 584–593.

9. Hall, JE Ledvična disfunkcija namesto neledvične vaskularne disfunkcije. Posreduje s soljo povzročeno hipertenzijo. Naklada 133, 894–906.

10. Wilson, JL, Miranda, CA & Knepper, MA Vazopresin in regulacija akvaporina-2. Clin. Exp. Nefrol. 17, 751–764.