Peroralni vnos peptidov kolagena piščančjih kosti Proti staranju kože pri miših z uravnavanjem razgradnje in sinteze kolagena, zaviranjem vnetja in aktiviranjem lizosomov 1. del

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

Povzetek:Vpliv prehrane na staranje kože je postal zanimiva raziskovalna tema. Prejšnje študije so se večinoma osredotočale na blagodejne učinke kolagenskih peptidov, pridobljenih iz morskih organizmov, na starajočo se kožo, če jih dajemo peroralno, medtem ko so o koristnih učinkih kolagenskih peptidov, pridobljenih iz perutnine, na starajočo se kožo redko poročali. V tej študiji so kolagenske peptide pripravili iz piščančjih kosti z encimsko hidrolizo ter raziskali učinek in mehanizem delovanja peroralno danih kolagenskih peptidov na ublažitev staranja kože, ki ga povzroča UV v kombinaciji z D-galaktozo. Rezultati so pokazali, da ima kolagen piščančjih kosti značilne značilnosti kolagena, peptidi kolagena piščančjih kosti (CP) pa so bili večinoma majhni molekularni peptidi z molekulsko maso<3000 da.="">cistanche podaljšanje življenjske dobePoskusi in vivo so pokazali, da imajo CP pomemben blažilni učinek na starajočo se kožo, kar se kaže v spremembah v sestavi in ​​strukturi starajoče se kože, izboljšanju ravni kožnih antioksidantov in zaviranju vnetja; učinek olajšanja je bil v pozitivni korelaciji z odmerkom CP. Nadaljnja preiskava je pokazala, da CP najprej zmanjšajo stopnjo oksidacije kože, zavirajo izražanje ključnega transkripcijskega faktorja AP-1 (c-Jun in c-Fos), nato aktivirajo signalno pot TGF-/Smad za spodbujanje sinteze kolagena , zavira izražanje MMP-1/3 za zaviranje razgradnje kolagena in zavira vnetje kože za ublažitev staranja kože pri miših. Poleg tega je kožni transkriptom ugotovil, da so lahko lizosomi, aktivirani po peroralnem dajanju CP, pomembna pot za CP v boju proti staranju kože in so vredni nadaljnjih raziskav. Ti rezultati kažejo, da bi se lahko CP uporabljali kot funkcionalna prehranska komponenta proti staranju.

Za več informacij kliknite tukaj

Ključne besede:kolagenski peptidi; proti staranju; kožni transkriptom; sinteza kolagena; lizosomi

1. Uvod

Doba zdravja, natančno sledenje zdravi prehrani, določanje vloge prehrane pri staranju kože in odločanje o tem, kaj jesti, da ohranimo mladostno in zdravo kožo, so težki problemi. Koža je največji organ v telesu, sestavljen iz povrhnjice, dermisa in podkožja. Deluje kot ovira za zaščito telesa pred zunanjimi dejavniki in ima tudi vlogo pri zdravju in lepoti[1]. Staranje kože je kompleksen proces, ki ga delimo na kronološko staranje in fotostaranje in nanj vplivajo tako notranji kot zunanji dejavniki. Glavne značilnosti vključujejo kopičenje makromolekularnih poškodb v celici, upad delovanja matičnih celic (spodbujanje obnove tkiva) in postopno izgubo fizične celovitosti kože [2]. Glavni molekularni mehanizmi, ki povzročajo staranje kože, vključujejo predvsem oksidativni stres, skrajšanje telomer, poškodbe DNK, genetske mutacije, regulacijo mikro-RNK, napredovalo kopičenje končnih produktov glikacije in staranje zaradi vnetja [3]. Fotostaranje je kožna epidermalna hiperplazija, izsušitev in razgradnja zunajceličnega matriksa, ki jih povzroči ultravijolično sevanje.cistanche nzGlavni vzrok za fotostaranje so reaktivne kisikove vrste (ROS), ki jih ustvarja ultravijolično sevanje, ki posreduje izražanje matričnih metaloproteinaz (MMP) in pro-kolagena tipa I prek signalnih poti, kot je signalizacija protein kinaze, aktivirane z mitogenom (MAPK). poti, kar vodi do razgradnje zunajceličnega matriksa (ECM) v koži in apoptoze fibroblastov [4]. V zadnjih letih je postalo priljubljeno ohranjanje zdravja kože in odložitev staranja, iskanje naravnih sestavin, kot so bioaktivni peptidi in polifenoli z antioksidativnimi funkcijami in funkcijami proti staranju, pa je postalo raziskovalna točka [5].

Vendar ima kolagen veliko molekulsko maso in ga je težko neposredno absorbirati in uporabiti, medtem ko imajo majhni molekularni kolagenski peptidi po hidrolizi kolagena močnejšo biološko aktivnost in visoko stopnjo absorpcije [6]. Medtem pa je široka uporaba kolagena v hrani, medicini, tkivnem inženiringu, kozmetiki in na drugih področjih naredila kolagenske peptide z nižjo molekulsko maso, večjo absorpcijsko učinkovitostjo in močnejšo biološko aktivnostjo, ki so postali novi favoriti v funkcionalni hrani in medicinskih raziskavah[{{1 }}]. Kolagenski peptidi so majhni in vsebujejo 2-20 aminokislinskih ostankov, pridobljenih po hidrolizi kolagena. Uporabljajo se kot prehransko dopolnilo za zdravljenje staranja kože zaradi svojih potencialnih protivnetnih in antioksidativnih funkcij ter imunske regulacije in učinkov antioksidacije in proliferacije na kožne fibroblaste [10].

Cistanche lahko upočasni staranje

Po peroralnem dajanju se kolagenski peptidi absorbirajo v obliki majhnih peptidov in hitro prenesejo v kri ter sčasoma do ledvic, kože, sklepov in drugih tkiv, kjer se shranijo in uporabijo. Po 14 dneh so ravni radioaktivnosti ostale visoke v koži miši, ki so jim dali C14-označene kolagenske peptide. Telo lahko skoraj v celoti absorbira in izkoristi kolagenske peptide, medtem ko je stopnja absorpcije in izkoriščenosti kolagena le 50-60 odstotkov [6,11-13]. V zadnjih letih je veliko poročalo, da imajo hidrolizati kolagena iz ribje kože, ribje luske, kravje kosti, kravje kože in svinjske kože ugodne učinke na blažitev staranja kože in so bili deležni precejšnje pozornosti raziskovalcev. Na primer, kolagenski peptidi, izolirani iz kože tolstolobnega krapa, spodbujajo sintezo pro-kolagena in zavirajo izražanje beljakovin AP-1, MMP-1 in MMP-3 z aktiviranjem poti TGF-/Smad za preprečevanje razgradnjo kolagena in popravilo fotostaranih kožnih celic [14]. Peroralno dajanje peptidov govejega kolagena lahko izboljša sprostitev kože, poveča vsebnost kolagena in aktivnost antioksidantnih encimov, popravi kolagenska vlakna in normalizira razmerje kolagena v koži pri starajočih se miših [15]. Vendar imajo kolagenski peptidi iz različnih virov različne učinke. Količina in struktura visoko aktivnih peptidov v krvi po peroralnem dajanju kolagenskih peptidov sta odvisni od vira kolagena[10]. Zaščitni učinek kolagenskega peptida, ekstrahiranega iz kože kokoši pred poškodbami fibroblastov, ki jih povzročajo UVA, je bil boljši od zaščitnega učinka kolagenskega peptida, ekstrahiranega iz kože prašičev, krav ali tilapije, njegov učinek pa je bil enakovreden tripeptidu, pridobljenemu iz kolagena (Gly-Pro). -Hyp) [16]. Verska prepričanja in skrbi glede bolezni (kot je bolezen norih krav) so privedli do tega, da so ljudje postopoma preusmerili smer razvoja kolagena in njegovih produktov s kopenskih sesalcev na perutnino in morske organizme [17]. Kot glavni stranski proizvod pri predelavi perutnine je piščančja kost obetaven vir kolagenskih produktov. Ne samo, da zmanjšuje potratnost virov in onesnaževanje okolja, temveč omogoča tudi učinkovito uporabo stranskih proizvodov. Zato smo v tej študiji kot surovino uporabili kolagenske peptide piščančjih kosti, z golimi mišmi, zdravljenimi z D-galaktozo in UV za induciranje staranja kože, kot model za oceno učinka peroralnega dajanja kolagenskega peptida na ublažitev staranja kože pri miši in določi ustrezen mehanizem.

2. Materiali in metode

2.1. Materiali, kemikalije in živali

Piščančje farme Yunnan Agricultural University (Kunming, Kitajska) so zagotovile porabljene kokoši, ki so bile ločene, posušene in zdrobljene, da so dobili piščančjo kostno moko. Kompleti su-peroksid dismutaze (SOD), katalaze (CAT) in glutation peroksidaze (GSH-PX) so bili kupljeni pri Soleibao Biotechnology Co., Ltd. (Peking, Kitajska). Hidroksiprolin (HYP), interlevkin-1 (IL-1 ), matrična metaloproteinaza-1/3 (MMP-1/3), pro-kolagen tipa I in hialuronska kislina ( HA) kompleti za encimski imunski test (ELISA) so bili kupljeni pri Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kitajska). Zdrave samice miši brez dlake BALB/C (18± 2 g, stare šest tednov) so bile kupljene pri Nanjing Junke Bioengineering Corporation, Ltd. (Nanjing, Kitajska) s številko dovoljenja: SCXK(SU)2016-0010. Pepsin in papain sta bila kupljena pri Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. (Šanghaj, Kitajska), druge kemikalije pa so bile analitske kakovosti. Z vsemi mišmi so ravnali v skladu s predpisi za oskrbo laboratorijskih živali province Yunnan in jih je odobril odbor za oskrbo in uporabo živali kmetijske univerze Yunnan (ID odobritve: YAUACUC01).

2.2. Priprava kolagena in sestava aminokislin

Ekstrakcija in aminokislinska sestava kolagena iz piščančjih kosti sta sledili metodi, ki so jo opisali Lieut al. [18] z manjšimi spremembami. Prah piščančjih kosti smo premešali in namočili v 0.05 M NaOH, 10 odstotkov n-heksana in 0.25 raztopino MEDTA (pH 7,5) pri razmerje 1/10 (m/o). V vsakem koraku je bil vzorec obdelan 36 ur, raztopina za namakanje pa je bila zamenjana vsakih 6 ur, da je kostni prah nabreknil in odstranil nekolagenske beljakovine, maščobo in minerale iz kostnega prahu. Vzorec smo po vsakem koraku sprali s čisto vodo do nevtralnosti. Prej obdelano piščančjo kostno moko smo zmešali z 0,5 M ledenoocetno kislino, ki je vsebovala 0,1 odstotka (m/v) pepsina v razmerju med trdno in tekočo snovjo 1:10 (m/v) ter nenehno mešali in ekstrahirali pri 4 stopinjah. 48 h. Nato smo ga filtrirali in filtrat centrifugirali pri 15,000×g 15 minut pri 4 stopinjah.velikost penisa cistancheSupernatant smo naravnali na 7.5-7.8 z raztopino NaOH in dodali NaCl do končne koncentracije 1,5 M. Potem ko je bila zmes 12 ur nemotena pri 4C za izsoljenje, je bila kolagenska oborina centrifugirana pri 15,000×g 15 minut pri 4 stopinjah, nato raztopimo s 0.5 M ocetno kislino, dializiramo v čisti vodi, liofiliziramo in končni produkt je bil kolagen piščančje kosti.

Aminokislinsko sestavo kolagena piščančje kosti smo določili z avtomatskim analizatorjem aminokislin Sykam S433D (München, Nemčija). Določeno količino vzorca kolagena za testiranje smo vzeli v zaprto epruveto, dodali 1 0 mL 6 M HCl in hidrolizirali pri 110 stopinjah 24 ur. Hidrolizat smo koncentrirali s pihanjem dušika in ponovno raztopili v 20 ml pufra citronske kisline. Po mikrofiltraciji z 0,22 μm mikroporozno membrano smo vzeli 20 μL hidrolizata za analizo aminokislinskega spektra. Vsebnost aminokislin v vzorcu smo izrazili v odstotkih.

2.3. Priprava in porazdelitev molekulske mase kolagenskih peptidov (CP)

Glede na rezultate našega prejšnjega procesa optimizacije so bili CP pripravljeni z uporabo papaina v razmerju encim/substrat 1:4 0 (masno razmerje). Po prilagoditvi pH na 7 in encimski hidrolizi pri 63 stopinjah 5 ur smo encim inaktivirali v vreli vodni kopeli 15 minut. Encimski hidrolizat smo razsolili in liofilizirali, ponovno raztopili v 0,1-odstotni raztopini mravljinčne kisline in centrifugirali, da smo dobili supernatant. Masni spektrometer visoke ločljivosti AQ Exactive HF Orbitrap-OE-HF (Thermo Fisher, Waltham, MA, ZDA), opremljen z ionizacijo z elektrosprejem (ESI), je bil uporabljen za analizo hidrolizata kolagena v načinu polnega skeniranja 350-1800 m/z, rezultati pa so bili pridobljeni in analizirani z uporabo Proteome Discovererja

2.1 programska oprema

2.4 Preskus na živalih

Samice miši BALB/Chairless (n {{0}}) so bile v prostoru pod nadzorovanimi pogoji temperature (24±1 stopinj), vlažnosti (60± 5 odstotkov) in 12 h dan-nočni cikel za en teden. Zagotovljen jim je bil ad libitum dostop do hrane in vode. Po enem tednu prilagoditve so bile miši naključno razdeljene v naslednjih pet skupin (n =11 na skupino): (i). Normalna skupina (N): UV neizpostavljeno; peroralno dajanje 0.4 ml fiziološke raztopine dnevno. (ii). Modelna skupina (M): izpostavljena UV plus D-galaktoza (0.2 mL); peroralno dajanje 0,4 ml fiziološke raztopine na dan. (jaz). Skupina kolagenskih peptidov z nizkimi odmerki (LCP): izpostavljena UV-žarkom in D-galaktoza (0,2 ml); oralno

dajanje 0.4 ml CP (odmerek: 200 mg kg-1 telesne teže) dnevno. (iv). Skupina kolagenskih peptidov s srednjim odmerkom (MCP): izpostavljena UV plus D-galaktoza; ustni

dajanje 0.4 ml CP (odmerek: 500 mg:kg-1 telesne teže) dnevno.

(v). Skupina kolagenskih peptidov z visokim odmerkom (HCP): izpostavljena UV-žarkom in D-galaktoza; peroralno dajanje 0.4 mL CP (odmerek: 1000 mg·kg-1 telesne mase) dnevno.

Zdravljenje z D-galaktozo je bilo izvedeno s subkutano injekcijo 0.2 ml 10-odstotne raztopine D-galaktoze na zadnji strani vratu miši (odmerek: 1.0g/ kg-1telesne teže) dnevno. UV obsevanje je bilo izvedeno s 40 W UVA-340 LUČKO (O-panel, Cleveland, ZDA, največja valovna dolžina: 340 nm), razdalja med svetilko in hrbtom miši je bila 30 cm (230 m J/ cm-), obsevanje pa je trajalo 30 minut vsak dan sedem tednov (49 dni). Intenzivnost sevanja je bila izmerjena z UVA365-radiometrom (Xinbao Keyi Electronic Technology Co., Ltd., Xi'an, Kitajska). Eno uro po D-galaktozi in UV obdelavi so miši peroralno vsak dan dajali 0,4 ml CP. Po zadnjem obsevanju so miši anestezirali, stehtali in tkiva odvzeli za nadaljnjo analizo.

2.5. Vlažnost kože, visceralni indeks in povečanje telesne mase

Vlažnost kože je bila določena z ISO 1442, visceralni indeks pa je bil izračunan z naslednjo enačbo: visceralni indeks (g/kg)=visceralna teža/telesna teža.

2.6. Vsebnost oksidacijskega stresa, HA in HYP v koži

Vzorce kože smo homogenizirali z devetkratno količino običajne fiziološke raztopine (m/m) v ledeni kopeli s homogenizatorjem tkiv (TGrinder OSE-Y30, Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Peking, Kitajska) in nato centrifugirali pri 2000 ×g in 4 stopinje za 10 minut. V zbranem supernatantu smo določali aktivnosti superoksid dismutaze (SOD), katalaze (CAT), glutation peroksidaze (GSH-PX) ter vsebnosti hialuronske kisline (HA) in hidroksiprolina (HYP) po metodi, opisani v navodilih. ki ustreza ustreznim kompletom.

2.7. Histološki pregled kože

Vzorci mišje kože so bili 24 ur fiksirani v 4-odstotni raztopini paraformaldehida, dehidrirani, vstavljeni v parafin in narezani. Odseki kože so bili obarvani s hematoksilinom in eozinom (HE) in opazovani s prednjim fluorescenčnim mikroskopom ECLIPSE CI-E (Nikon, Japonska). Debelina kožne povrhnjice in dermisa je bila ocenjena s programsko opremo Halcon 13.0.1.1 (MVTec, München, Nemčija).

2.8. Sekvenciranje kožnega transkriptoma

2.8.1. Ekstrakcija RNA, konstrukcija knjižnice in sekvenciranje transkriptoma

Celotno RNK smo ekstrahirali iz kože miši z uporabo RNeasy Mini Kit (Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Peking, Kitajska) v skladu z navodili proizvajalca. Čistost in koncentracijo RNA smo preverili s spektrofotometrom kaiaoK5500 (Kaiao, Peking, Kitajska); Celovitost RNA je bila ocenjena z uporabo RNA Nano 6000 Assay Kit in sistema Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ZDA). Analizo transkripcijskega zaporedja vsakega vzorca je izvedla družba Biolinker Technology Company Limited (Kunming, Kitajska).cistanche v prahuNa kratko, združevanje v skupine indeksno kodiranih vzorcev je bilo izvedeno na sistemu za generiranje gruč cBot z uporabo HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS (Illumina) v skladu z navodili proizvajalca. Po generiranju gruče so bile knjižnice sekvencirane na platformi Illumina in ustvarjenih je bilo 150 bp parnih branj.

2.8.2. Bioinformatske analize podatkov o zaporedju RNA

Gene Ontology (GO) in Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) obogatitvena analiza diferencialno izraženih genov (DEG) je bila izvedena z uporabo paketa R jezikovnega analizatorja grozdov. Ko je bila p-vrednost manjša od 0,05, so se postavke in poti, obogatene z GO in KEGG, štele za pomembne.

2.8.3. Verižna reakcija reverzne transkriptaze-polimeraze (qRT-PCR)

QRT-PCR je bil izveden, kot je opisano prej [19].

2.9.Wester1 Blot

Po metodi, ki so jo opisali Park et al. [20] je bila izvedena analiza Western blot (WB) za kvantificiranje izražanja proteinov, povezanih s staranjem kože pri miših. Koncentracijo beljakovin kožnega lizata v vsaki tretirani skupini smo kvantificirali z uporabo kompleta BCA, ločili s SDS-PAGE (10-odstotnim akrilamidnim gelom), prenesli na membrano PVDF, blokirali s 5-odstotnim posnetim mlekom in inkubirali z ustrezno količino primarnega protitelesa (TGF-b1, c-Fos, c-Jun, Samd2/3 in -aktin) pri 4 stopinjah čez noč. Po izpiranju s TBST smo vzorce zmešali s sekundarnimi protitelesi in inkubirali pri sobni temperaturi 1 uro. Za odkrivanje specifičnih proteinov je bil uporabljen ChemiDoc XRS plus kemiluminiscenčni gelski slikovnik (BioRAD, Hercules, CA, ZDA). Programska oprema Image ] je bila uporabljena za kvantificiranje izražanja ciljnega proteina v vsaki zdravljeni skupini, rezultati pa so bili predstavljeni z vrednostmi gostote, normaliziranimi na -aktinski protein.

2.10.ELISA

Stopnje izražanja MMP-1, MMP-3, pro-kolagena tipa I in IL-1 v tekočini za lizo kože so bile določene z encimsko vezanim imunskim testom. Test je bil izveden v skladu z navodili, priloženimi kompletu.

2.11. Statistične analize

Vsi rezultati so bili analizirani s programsko opremo SPSS 21 (IBM Inc., Armonk, NY, ZDA) z enosmerno analizo variance (ANOVA) in Duncanovim testom večkratnega razpona, pri čemer je bila stopnja pomembnosti nastavljena na p<0.05. originpro="" 2017="" (originlab,="" northampton,="" ma,="" usa)was="" used="" to="" plot="" the="" data.="" all="" data="" were="" expressed="" as="" the="" mean="" ±standard="" deviation="">

3. Rezultati in razprava

3.1. Aminokislinska sestava kolagena

Aminokislinska sestava kolagena piščančjih kosti je prikazana v tabeli 1. Gly je bila glavna aminokislina v vzorcih, ki je predstavljala skoraj eno tretjino (27.86 odstotkov) vseh aminokislin, Hyp pa je bila posebna aminokislina v kolagenu, ki predstavlja 9,83 odstotka. Glavne značilnosti kolagenskih molekul so bile ponavljajoče se sekvence Gly-XY in edinstvena trojna spiralna struktura, sestavljena iz treh c verig. Gly je predstavljal približno eno tretjino skupnih aminokislin, X in Y sta bila pogosto prolin in hidroksiprolin ali pa sta lahko katerikoli ostanek [21]. Aminokislinska sestava vzorca je bila podobna kolagenu iz piščančjih kosti, o katerem so poročali v prejšnjih študijah, in je imela tipične lastnosti kolagena [22].

3.2. Porazdelitev molekulske mase CP

Molecular weight distribution reflects the degree of collagen hydrolysis. The molecular weight of the CPs was mainly below 3000 Da(Figure 1), accounting for about 87.61%of all collagen hydrolysates, indicating that almost all of the CPs were small peptides. Many studies claim that collagen peptides with a lower molecular weight have better biological activity [23]. For example, Song et al. [24]. reported that lower molecular weight (200-1000 Da,65%)silver carp skin collagen peptides repaired UV-induced aging skin in mice more effectively than similar peptides with a higher molecular weight(>1000 Da, 72 odstotkov). Vendar je nemško podjetje Gelita z več kliničnimi študijami pokazalo, da je učinek kolagenskih peptidov v glavnem določen s stopnjo ujemanja z lastnostmi kolagenskih peptidov po razgradnji človeškega kolagena, ne pa z molekulsko maso kolagenskih peptidov. Ugotovili so, da najbolj stimulativno na kožne fibroblaste deluje izdelek VERISOL⑧ s povprečno molekulsko maso 2000 Da, medtem ko ima izdelek FortigelTM s povprečno molekulsko maso 3000 Da poseben učinek na obnovo hrustanca [25-27].

3.3. Vpliv peroralnih CP na ublažitev staranja kože

3.3.1. Telesna teža in organski indeks

Indeks telesne teže in organski indeks sta pomembna in odražata zdravstveno stanje miši. Teža miši v vsaki skupini se je med preskusnim obdobjem normalno povečala (tabela 2). Povprečno povečanje telesne mase skupine M je bilo nižje kot pri skupini N, pri skupinah, zdravljenih s CP, pa je bilo višje kot pri skupini M, kar nakazuje, da CP niso imeli stranskih učinkov na miši. V prejšnjih poročilih je bil odmerek miši, zdravljenih s kolagenskimi peptidi, večinoma med 100-1000 mg/kg.tm·d, varni odmerek kolagenskih peptidov tilapije pa je dosegel 4,07 g/kg.tm·d [{{6} }].izvleček cistanche salsa Similarly, the growth of skin-aged mice after gavage with tilapia scale collagen peptides (dose: 500 and 1000 mg/kg.bw·d)was also similar to our results [29]. The spleen plays an important role in humoral and cellular immunity, thus, the spleen index is often used to evaluate immune system function. The liver index was used to evaluate the toxicity of the tested sample. In these tests, the liver and spleen indices in the M group were lower than those in the N group, and both recovered after treatment with CPs, but there was no significant difference across the treatment groups(p>0.05). Rezultati so bili podobni tistim iz prejšnjih študij [30], kar kaže, da so CP varni in lahko nekoliko izboljšajo imunost miši.

3.3.2. Sestava kože

Zdravljenje z UV in D-galaktozo (skupina M) je znatno zmanjšalo vsebnost vlage, HA in Hyp v koži v primerjavi s tistimi v skupini, in sicer za 13,36 odstotka, 24,08 odstotka oziroma 15,83 odstotka (p<0.05)(table 2).the="" contents="" of="" moisture,="" ha,="" and="" hyp="" in="" the="" skin="" were="" significantly="" higher="" in="" mice="" after="" the="" oral="" administration="" of="" cps="" compared="" to="" the="" contents="" of="" those="" in="" the="" mice="" of="" the="" m="" group=""><0.05). among="" the="" dose="" groups,="" the="" contents="" of="" the="" three="" skin="" components="" were="" significantly="" different="" between="" the="" lcp="" and="" hcp="" groups="" and="" were="" dependent="" on="" the="" dose="" of="" intake="" of="" cps.="" the="" hcp="" group="" had="" even="" higher="" contents="" than="" the="" n="" group,="" and="" ha="" and="" hyp="" were="" significantly="" different="" between="" the="" two="" groups="" (p=""><>

Spremembe vsebnosti vlage v koži povzročajo gube in povešenost kože, nanje pa vplivajo komponente matriksa, kot sta kožni kolagen in HA[31]. Hidroksiprolin je stabilna, bogata in posebna aminokislina v kolagenu, njegova vsebnost pa lahko posredno odraža vsebnost kolagena v koži, pa tudi staranje kože. Poleg tega ima HA, ki je močno izražen v kožnem ECM, pomembno vlogo pri nadzoru vodnega ravnovesja kože, osmotskega tlaka, zadrževanja vlage in elastičnosti kot sistem za shranjevanje vode in strukturna komponenta kože [32]. V tej študiji se je vsebnost vlage, HYP in HA v koži znatno povečala po zaužitju CP, kar je lahko povezano s spodbujanjem sinteze kolagena in HA s CP. Poleg tega je povečanje HYP in HA povečalo vsebnost vlage.

3.3.3. Histološke spremembe kože

Histološke spremembe na koži hrbta miši po sedmih tednih neprekinjenega zdravljenja so prikazane na sliki 2. Starajoča se koža skupine M je v primerjavi s kožo skupine N pokazala značilnosti hrapave površine, odebeljene povrhnjice, stanjšanega dermisa in redkih celic. Vendar pa se je stanje starajoče se kože pri miših izboljšalo po peroralnem dajanju CP, pri čemer se je ohranila gladka, urejena in popolna struktura, podobna tisti pri miših skupine N. Tako je bila usnjica kože bistveno tanjša, povrhnjica pa bistveno debelejša v skupini M kot v skupini N (p<0.05). the="" change="" in="" skin="" dermis="" and="" epidermal="" thickness="" was="" significantly="" better="" after="" treatment="" with=""><0.05), and="" the="" effect="" was="" more="" obvious="" with="" the="" increase="" in="" the="" dose="" of="" cps="" (figure="" 2).="" the="" effect="" of="" oral="" cps="" on="" the="" histological="" structure="" of="" aging="" skin="" was="" similar="" to="" that="" reported="" previously[4,28,31].="" the="" increase="" in="" the="" thickness="" of="" the="" epidermis="" might="" be="" an="" adaptive="" change="" to="" protect="" the="" skin="" from="" external="" stimuli,="" loss="" of="" skin="" moisture,="" and="" uv="" damage,="" possibly="" due="" to="" the="" increase="" in="" uv-activated="" epidermal="" growth="" factor="" receptor="" (egfr)="" that="" induces="" keratinocyte="" proliferation="" and="" epidermal="" hyperplasia[4].="" however,="" the="" mechanism="" by="" which="" oral="" cps="" alleviate="" the="" increase="" in="" epidermal="" thickness="" remains="" unclear.="" the="" dermis="" imparts="" elasticity="" and="" strength="" to="" the="" skin,="" and="" the="" degradation="" of="" ecm="" and="" the="" reduction="" in="" the="" ability="" to="" repair="" fibroblasts="" are="" the="" main="" causes="" of="" dermal="" thinning="" in="" aging="" skin.="" dermal="" thickness="" increased="" after="" the="" treatment="" with="" cps,="" which="" might="" be="" due="" to="" the="" removal="" of="" ros="" from="" the="" skin="" and="" inhibition="" of="" the="" increase="" of="" mmps="" by="" cps.="" this,="" in="" turn,="" inhibited="" the="" degradation="" of="" skin="" collagen="" and="" elastin="" (figure="" 3),="" the="" entry="" of="" cps="" into="" the="" skin,="" and="" their="" participation="" in="" the="" synthesis="" of="" collagen="" and="" ha="" [6],="" which="" was="" confirmed="" by="" the="" increase="" in="" the="" content="" of="" hyp="" and="" ha="" in="" the="" skin="" (table="">

3.3.4. Antioksidativne in vnetne ravni kože

Določanje aktivnosti antioksidativnih encimov je najpogosteje uporabljena metoda za oceno ravni antioksidantov v telesu [28]. Kot je prikazano na sliki 3, so bile aktivnosti vsebnosti CAT, SOD, GSH-Px in MDA v skupini M znatno nižje od tistih v skupini N (p<0.05). administering="" cps="" effectively="" inhibited="" the="" decrease="" of="" cat,="" sod,="" gsh-px="" activities,="" and="" the="" mda="" content="" in="" the="" skin="" of="" mice,="" compared="" to="" those="" in="" the="" mice="" skin="" of="" the="" m="" group,and="" was="" positively="" correlated="" with="" the="" dose="" of="" cps;="" there="" were="" significant="" differences="" among="" the="" different="" dose="" groups=""><0.05). when="" ros,="" accumulated="" by="" skin="" oxidative="" stress,="" exceed="" the="" antioxidant="" defense="" ability="" of="" the="" body,="" they="" destroy="" the="" ecm,="" which="" is="" the="" key="" cause="" of="" skin="" aging.="" ros="" can="" cause="" the="" oxidation="" of="" lipids="" and="" proteins="" in="" the="" skin,="" resulting="" in="" fibroblast="" degeneration="" and="" changes="" in="" the="" skin.="" ros="" activates="" the="" mapk="" signaling="" pathway="" and="" the="" ap-1="" protein="" to="" upregulate="" the="" expression="" of="" mmps="" and="" promote="" the="" degradation="" of="" matrix="" collagen="" [21].="" although="" the="" antioxidant="" enzymes="" and="" antioxidants="" in="" the="" body="" can="" remove="" ros="" to="" protect="" the="" skin="" from="" damage,="" when="" the="" content="" of="" rosexceeds="" the="" defense="" (antioxidant)="" ability="" of="" the="" body="" or="" the="" body's="" defense="" ability="" declines,="" it="" causes="" oxidative="" stress="" and="" skin="">

Poleg tega k staranju kože prispeva tudi celični vnetni odziv, ki ga povzroča ROS. Po zdravljenju z UV in D-galaktozo (skupina M) se je vsebnost IL-1 v koži miši znatno povečala v primerjavi s tisto v skupini N (slika 3D), kar kaže, da je koža pokazala pomemben vnetni odziv (str<0.05). the="" cps="" significantly="" reduced="" the="" content="" of="" il-1α="" in="" the="" skin="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" compared="" to="" that="" in="" the="" skin="" of="" mice="" in="" the="" m="" group.="" there="" was="" a="" significant="" difference="" between="" hcps="" and="" lcps=""><0.05), indicating="" that="" cps="" alleviated="" skin="" inflammation.="" the="" o2="" produced="" by="" ultraviolet="" irradiation="" stimulated="" the="" expression="" of="" mmp-1="" in="" dermal="" fibroblasts="" through="" the="" secretion="" of="" il-1α="" and="" il-6,="" thereby="" disrupting="" the="" ecm="" [33].="" therefore,="" this="" study="" suggested="" that="" cps="" significantly="" increased="" the="" activity="" of="" skin="" antioxidant="" enzymes="" and="" inhibited="" inflammatory="" responses,="" which="" might="" be="" important="" in="" delaying="" skin="" aging="" in="">

3.4. Mehanizem delovanja prehranskih CP pri blaženju staranja kože

3.4.1. Analiza in validacija podatkov RNA-Seq

Analysis techniques, such as PCA, HCA, gene GO enrichment, and KEGG pathway enrichment were used to analyze the transcriptome data. Based on the PCA analysis (Figure 4A)and hierarchical clustering analysis (heat map)of 4303 differential genes with average channel strength greater than 100, the relative expression levels of total DEGs between the two treatment groups are shown to provide an overview of the changes in gene expression(Figure 4B).The M group and the HCP group were significantly separated, and the expression patterns of most DEGs in the M and HCP groups were opposite, indicating that there were significant differences between the mouse skin after HCP treatment and the M group(Figure 4A,B).Pairwise comparisons showed that after feeding HCPs, 4303 genes were significantly expressed in the mice's skin, including 1790 upregulated genes and 2513 downregulated genes(Foldchange>2,p<0.05)(figure 4c).among="" the="" six="" genes="" associated="" with="" skin="" aging="" quantified="" by="" qrt-pcr,="" five="" genes(including="" fos,="" jun,="" cxcl1,="" and="" egr1)were="" downregulated,="" and="" one="" gene="" was="" upregulated(figure="" 4d),="" which="" was="" consistent="" with="" the="" overall="" trend="" of="" transcriptomic="" data.="" the="" rna="" expression="" levels="" of="" fos,="" jun,="" and="" cxcll="" were="" significantly="" upregulated="" in="" damaged="" skin="" compared="" to="" that="" in="" intact="" skin="" [34],="" and="" inhibition="" of="" egr1="" expression="" alleviated="" skin="" inflammation="" [35].="" these="" results="" reflected="" the="" reliability="" of="" transcriptome="" sequencing="" data,="" and="" oral="" cps="" effectively="" alleviated="" skin="">

analiza obogatitve in analiza obogatitve baze podatkov KEGG sta zagotovili podporo za nadaljnje raziskovanje bioloških funkcij DEG. Analiza GO je pokazala, da so bili DEG znatno obogateni v bioloških procesih, kot so replikacija DNA, regulacija hemopoeze, regulacija aktivnosti hidrolaze in proizvodnja citokinov; v celičnih komponentah, ki so vključevale litično vakuolo in lizosom, so bili geni, ki vsebujejo kolagen, in drugi sorodni geni znatno obogateni; glede na molekularno funkcijo, aktivnost receptor-ligand, aktivnost citokinov in drugi sorodni geni so bili znatno obogateni (slika 5). Analiza obogatitve KEGG prvih 20 signalnih poti, ki so jih DEG bistveno spremenili, je prikazana na sliki 5. Interakcija citokin-receptor, lizosom, interakcija nevroaktivnega liganda in receptorja, celični cikel, sistemski eritematozni lupus in pot TGF (p<0.05)were closely="" related="" to="" aging,="" especially="" cytokine-receptor="" interactions,="" lysosomes,="" and="" tgf-βsignaling.="" an="" important="" feature="" of="" cellular="" senescence="" is="" the="" accumulation="" of="" damaged="" organelles="" and="" protein="" aggregates.="" lysosomes="" play="" an="" important="" role="" in="" degrading="" damaged="" organelles="" and="" protein="" aggregates="" in="" senescent="" cells="" [36].="" cytokine-receptor="" interaction="" is="" the="" main="" pathway="" of="" enrichment="" in="" the="" skin="" after="" being="" affected="" by="" various="" factors="" such="" as="" inflammation="" [37],="" sulfur="" mustard="" exposure="" [38],="" and="" terahertz="" pulse="" [39].="" cytokines,="" as="" small="" molecular="" proteins="" synthesized="" and="" secreted="" by="" various="" tissue="" cells,="" maintain="" skin="" homeostasis="" by="" controlling="" the="" balance="" between="" keratinocyte="" proliferation,="" differentiation,="" and="" apoptosis="" through="" complex="" interactions="" with="" growth="" factors="" [40].="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" is="" also="" important="" for="" regulating="" skin="" aging="" [14].="" gene="" functional="" enrichment="" analysis="" showed="" that="" tgf-β="" was="" highly="" expressed="" during="" cytokine-receptor="" interaction="" and="" in="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway.="" tgf-β="" is="" a="" major="" pro-fibrotic="" cytokine="" that="" regulates="" cell="" differentiation="" and="" proliferation="" while="" inducing="" extracellular="" matrix="" protein="" synthesis="" [41.="" therefore,="" we="" verified="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" and="" some="">

3.4.2. Preverjanje mehanizma delovanja CP pri blaženju staranja kože

Za preverjanje vloge signalne poti TGF in interakcije citokin-receptor pri blaženju staranja kože s peroralnimi CP je bila izvedena analiza WB za preverjanje TGF- in transkripcijskega faktorja Smad2/3 v signalni poti TGF, kot tudi ključnega transkripcijski faktor AP-1(c-Fos in c-Jun), ki uravnava citokine. Vsebnost MMP-1, MMP-3, pro-kolagena tipa I in I-1 je bila določena z ELISA testom. Rezultati WB analize so pokazali, da je bila ekspresija TGF-, Smad2 in Smad3 v skupini M bistveno manjša kot v skupini N(p<0.05). the="" expression="" levels="" of="" tgf-β="" and="" smad3="" were="" significantly="" higher="" in="" mice="" after="" the="" oral="" administration="" of="" cps="" compared="" to="" their="" levels="" in="" group="" m="" mice;="" additionally,="" smad2="" also="" increased="" significantly=""><0.05), except="" for="" in="" the="" lcps="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (figure="" 6).="" on="" the="" contrary,="" the="" expression="" of="" c-fos="" and="" c-jun="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" n="" group.="" the="" expression="" of="" c-fos="" and="" c-jun="" in="" the="" cp="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" in="" the="" m="" group,="" except="" for="" the="" expression="" of="" c-jun="" in="" the="" lcp=""><0.05), and="" the="" change="" was="" dose-dependent.="" these="" results="" indicated="" that="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" was="" activated="" and="" ap-1="" was="" inhibited="" after="" feeding="">

Protein AP-1 je dimerni kompleks proteinov družine Jun in Fos in je pomemben regulator vnetja kože in izražanja citokinov. Na splošno kaže kompleks, sestavljen iz c-Jun in c-Fos, najvišjo transkripcijsko aktivnost v koži [41, A42]. ROS, ki nastane v starajočih se kožnih celicah, najprej aktivira protein AP-1 in nato s transkripcijo in translacijo uravnava citokine navzdol (kot je IL-1), MMP in TGF-signalno pot, s čimer olajša staranje kože [43]. ,44]. Signalna reakcija TGF-/Smad je klasična pot sinteze kolagena in transkripcijski faktor Smad je jedro te poti prenosa signala. TGF- sproži fosforilacijo in aktivacijo spodnjih Smad2 in Smad3 z vezavo na receptor, s čimer se poveča sinteza COLI [14].

Poleg tega so rezultati testa ELISA pokazali, da je bila vsebnost MMP-1, MMP-3 in IL-l v koži skupine M znatno višja kot v skupini N, vsebnost tipa I pro-kolagen je bil bistveno nižji (str<0.05). however,="" the="" contents="" of="" mmp-1,="" mmp-3,="" and="" il-1α(figure="" 3d)in="" the="" skin="" after="" oral="" administration="" of="" cps="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" m="" group="" (p=""><0.05); type="" i="" pro-collagen="" increased="" significantly,="" and="" all="" the="" changes="" were="" dose-dependent="" with="" cps="" (figure="" 7).="" mmps="" are="" involved="" in="" the="" decomposition="" of="" skin="" collagen,="" il-1α="" shows="" the="" level="" of="" inflammation="" of="" the="" skin,="" and="" type="" i="" pro-collagen="" reflects="" the="" synthesis="" of="" skin="" collagen.="" accumulating="" evidence="" suggests="" that="" the="" role="" of="" the="" jun/ap-1="" protein="" pathway="" has="" also="" been="" proposed="" to="" regulate="" skin="" inflammation="" [40].="" the="" elisa="" results="" showed="" that="" the="" combined="" treatment="" of="" uv="" and="" d-galactose="" caused="" skin="" collagen="" degradation,="" decreased="" collagen="" synthesis,="" and="" caused="" skin="" inflammation,="" leading="" to="" skin="" aging.="" however,="" these="" changes="" were="" reversed="" after="" the="" oral="" administration="" of="">

Poleg zgornjih poti so bili v tej študiji navzgor regulirani geni po zdravljenju s CP znatno obogateni z lizosomsko potjo, kar kaže, da je zdravljenje s CP aktiviralo lizosom v koži (slika 5). Prejšnje študije kažejo, da aktivirani lizosomi čistijo agregate in povečajo aktivacijo starajočih se nevralnih matičnih celic med staranjem [45]. Poleg tega lahko povečana funkcija lizosomov zmanjša koncentracijo znotrajceličnega ROS, da se prepreči celično mirovanje. Podobno lahko kakršno koli zmanjšanje delovanja lizosoma poveča znotrajcelično koncentracijo ROS, ki na koncu spodbuja celično mirovanje [46]. Čeprav tega v tem prispevku nismo sistematično preverjali, ti rezultati in prejšnja poročila kažejo, da je lahko aktivacija lizosomske funkcije glavni način za CP za ublažitev staranja kože, in še naprej si bomo prizadevali to preveriti.

Zato je ta študija pokazala, da bi prehranski CP lahko ublažili staranje kože, ki ga povzročata UV in D-galaktoza, na način, ki je odvisen od odmerka. CP blažijo staranje kože z znižanjem ravni oksidacije kože, zavirajo izražanje ključnih transkripcijskih faktorjev AP-1 (c-Jun in c-Fos), aktivirajo signalno pot TGF-/Smad za spodbujanje sinteze kolagena, zavirajo izražanje MMP-1 in MMP-3(ki zavirajo razgradnjo kolagena) in zaviranje vnetja kože za ublažitev staranja kože (slika 8). Še več, naše ugotovitve v tok

4. Sklepi

Če povzamemo, ta študija je potrdila, da lahko prehransko dopolnilo kolagenskih peptidov iz piščančjih kosti znatno ublaži staranje kože, ki ga povzročata ultravijolično sevanje in D-galaktoza, po več poteh, ki vključujejo spodbujanje sinteze pro-kolagena, zaviranje razgradnje kolagena, izboljšanje ravni kožnih antioksidantov in zaviranje vnetje; olajšanje je bilo odvisno od odmerka s CP. Podrobna raziskava je pokazala, da CP najprej zmanjšajo stopnjo oksidacije kože, zavirajo izražanje ključnega transkripcijskega faktorja AP-1 (c-Jun in c-Fos), nato pa aktivirajo signalno pot TGF-/Smad za spodbujanje sintezo kolagena, zavira izražanje MMP-1 in MMP-3 za zaviranje razgradnje kolagena in zavira vnetje kože za ublažitev staranja kože pri miših. Poleg tega je lahko aktivacija lizosomov tudi glavna pot za CP za ublažitev staranja kože, kar je vredno nadaljnjih raziskav in preverjanja. Ti rezultati zagotavljajo teoretično osnovo za uporabo kolagenskih peptidov za lajšanje staranja kože in razširitev obsega za celovito uporabo živalskih stranskih proizvodov v funkcionalnih živilih.

Prispevki avtorja: CC je oblikoval, izmeril in napisal rokopis; ZX in HT sta oblikovala in revidirala rokopis; YL zagotavlja metodološke napotke; CG in YW sta pregledala rokopis. Vsi avtorji so prebrali in se strinjali z objavljeno različico rokopisa.

Ta članek je izvleček iz Nutrients 2022, 14, 1622. https://doi.org/10.3390/nu14081622 https://www.mdpi.com/journal/nutrients