Osteoporoza je velik javnozdravstveni problem za vse bolj starajoče se prebivalstvo sveta

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

Povzetek:Osteoporoza je pomemben javnozdravstveni problem po vsem svetu, pri čemer je osteoporoza po menopavzi zaradi pomanjkanja estrogena v približno 3/4 primerov. V tej študiji je bilo 18 starim merino ovcam ovariektomiranih, 10 pa je bilo kontrolnih. Tri ovariektomirane ovce so bile zdravljene s 400 mg metilprednizolona tedensko 5 mesecev, tri pa so bile zdravljene tedensko 2 meseca, čemur je sledilo 3-mesečno obdobje okrevanja. Po 2 mesecih je bilo evtanaziranih pet kontrolnih živali in šest živali z ovariektomijo. Pri 5 mesecih so bile vse preostale ovce evtanazirane. Vzorci ledvic so bili zbrani posmrtno za analizo qPCR NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1Illc, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA in NCX1. Ovce z ovariektomijo so imele znatno večjo izraženost VDR v primerjavi z drugimi skupinami. Ovariektomirane ovce, zdravljene z glukokortikoidi 2 meseca, čemur je sledila evtanazija po 5 mesecih, so pokazale pomembne razlike v izražanju gena TRPV5, CYP24A1 in klotho v primerjavi z drugimi skupinami. Razlike v izražanju klotho so bile najbolj izrazite po prilagoditvi za ponavljajoče se meritve (p=0.1). Klotho je znan kot hormon "proti staranju" in sodeluje pri presnovi kalcija in fosforja. Klotho lahko sodeluje pri obnavljanju mineralne gostote kosti pri ovcah z ovariektomijo, zdravljenih z glukokortikoidi 2 meseca, čemur je sledila evtanazija po 5 mesecih. Priporočljive so nadaljnje raziskave o vlogi klotha.

Za več informacij kliknite tukaj

Ključne besede:osteoporoza; ovce; vitamin D; fosfatiranje; qPCR; metabolizem kalcija; presnova fosforja; klotho

1. Uvod

Osteoporoza je pomembna javnozdravstvena težava za vse bolj starajoče se prebivalstvo sveta, ki je leta 205 Združene države Amerike stala skoraj 17 milijard USD, leta 2025 pa naj bi narasla na 25 milijard USD [1,2]. Približno 70-75 odstotkov bremena osteoporoze je posledica postmenopavzalne osteoporoze pri ženskah [1], primarne osteoporoze, pri kateri pomanjkanje estrogena povzroči zmanjšano tvorbo kosti in povečano resorpcijo kosti, kar povzroči zmanjšanje kostne mase in krhkost kosti [3] . Osteoporoza se lahko pojavi tudi zaradi posebnih vzrokov, kot je zdravljenje z glukokortikoidi. Ovca je dobro uveljavljen velik živalski model za različne bolezni človeškega okostja, vključno z osteoporozo[4]. Ena od prednosti velikega živalskega modela, kot je ovca, je zmožnost testiranja ortopedskih vsadkov, kirurških tehnik in biomaterialov. [4] Poleg tega je ovca razmeroma nizka cena, enostavna za uporabo in zagotavlja obilico materiala za testiranje [4,5].

Najpogostejši modeli osteoporoze pri ovcah so 12-mesečne pooperativno ovariektomirane ovce in 6--mesečne ovce z ovariektomijo na dieti s pomanjkanjem kalcija in vitamina D, ki so prejemale glukokortikoide[4]. Z uporabo kombinacije znanih dejavnikov, ki povzročajo osteoporozo, vključno z ovariektomijo, zdravljenjem z glukokortikoidi in dieto z nizko vsebnostjo kalcija, smo lahko vzpostavili ovčji model osteoporoze v samo 5 mesecih [6,7], s čimer smo zmanjšali nastanitev, porod, in stroški krme, povezani z razvojem modela. V tem modelu je bilo ugotovljeno, da je ovariektomija povečala serumske koncentracije C-terminalnih telopeptidov kolagena tipa I (CTX-I, marker kostne resorpcije) in osteokalcina (marker kostne pregradnje) v primerjavi s kontrolnimi ovcami. Ovce, ki so 2 meseca prejemale glukokortikoidno zdravljenje, so imele višje serumske koncentracije CTX-I in nižje serumske koncentracije osteokalcina. Poleg tega so bile gostota kosti femoralne in ledvene hrbtenice ter skupna in trabekularna volumetrična mineralna gostota kosti proksimalne golenice nižje v eksperimentalno zdravljenih skupinah v primerjavi s kontrolnimi skupinami, zlasti pri ovcah, zdravljenih z ovariektomijo in glukokortikoidom [6]. Ugotovili so tudi, da je presnova aminokislin in lipidov spremenjena pri ovcah, ki so bile ovariektomirane in zdravljene z glukokortikoidi [7].cistanche wirkungPodobne spremembe so bile ugotovljene tudi pri drugih modelih ovčje osteoporoze [8].

Cistanche lahko upočasni staranje

Geni, ki se odzivajo na vitamin D, in sistem fosfatiranja še niso bili raziskani na modelih ovc z ovariektomijo. Vitamin D, od katerega je 1,25-dihidroksivitamin D aktivna oblika, končno vodi do povečane koncentracije ioniziranega kalcija in fosforja v plazmi z vezavo na heterodimer receptorja vitamina D (VDR)-retinoidnega X receptorja in spreminja izražanje številnih vitaminov Geni, ki se odzivajo na D, kot so proteini, ki vežejo kalcij (kalbindin D9 in 28k (CalD9k, CalD28k)) in kalcijevi kanali (član 5 in 6 poddružine V kanalov prehodnega receptorskega potenciala kationov (TRPV5, TRPV6), kalcijeva ATPaza plazemske membrane (PMCA) , natrijev kalcijev izmenjevalec 1 (NCX1) [9]. Proizvodnja 1,25-dihidroksivitamina D je strogo reguliran korak, pri katerem ledvična lo hidroksilaza (CYP27B1) katalizira pretvorbo 25-hidroksivitamina D na 1,25-dihidroksivitamin D, encim 24-hidroksilaza (CYP24A1) razgradi 25-hidroksivitamin D in 1,25-dihidroksi vitamin D v neaktivne stranske produkte.cistanche UKSistem fosfatiranja nadzoruje tudi koncentracije fosforja in kalcija v plazmi [10]. Glavni del tega sistema je fibroblastni rastni faktor 23, ki ga proizvajajo osteociti v kosteh in primarno nadzoruje koncentracije fosforja v plazmi z vezavo na kofaktor kloto, da se zmanjša izražanje natrijevega fosfatnega kotransporterja (NPT1, NPT2a, NPT2c). [11]. Zaradi medsebojno povezanih učinkov obščitničnega hormona in 1,25-dihidroksi vitamina D je bilo določanje učinkov FGF23 na presnovo kalcija zahtevno, vendar obstajajo dokazi, ki kažejo, da lahko uravnava črevesno absorpcijo kalcija in ledvic reabsorpcija kalcija [12,13].

Glukokortikoidi imajo številne učinke na presnovo kalcija in fosforja, vključno z zaviranjem absorpcije kalcija v črevesju, zmanjšano reabsorpcijo kalcija v ledvičnih tubulih in zmanjšano reabsorpcijo fosforja v ledvicah [14-16]. Poleg tega je malo raziskav preučevalo učinek pomanjkanja estrogena na gene, ki se odzivajo na vitamin D, in sistem fosfatiranja [17,18].

Ta ovčji model osteoporoze z ovariektomijo in nizko vsebnostjo kalcija, zdravljen z glukokortikoidi, je ponudil priložnost za pripravo predhodnih informacij o učinkih teh zdravljenj na izražanje genov, ki se odzivajo na fosfatiranje in vitamin D, v ovčjih ledvicah. Cilja te študije sta bila dvojna: (1) ugotoviti, ali je ovariektomija ali ovariektomija in zdravljenje z glukokortikoidi spremenilo izražanje vitamina D in genov, povezanih s fosfatiranjem, v ledvicah; (2) določiti razmerja med ledvičnim vitaminom D in geni, povezanimi s fosfatiranjem, serumski vitamin D in serumski markerji kostne pregradnje (CTX-I in osteokalcin).

2. Materiali in metode

Podrobne metode za razvoj modela osteoporoze pri ovcah z ovariektomijo in glukokortikoidi so bile že objavljene [6]. Na kratko, stare merino ovce (7-9 let, n=28) so bile naključno razporejene v skupine: kontrolna (n=10) ovariektomirana (OVX) (n=12), ovariektomirana in zdravljenje z glukokortikoidi (40 mg metilprednizolona v subkutani injekciji) mesečno 2 meseca, ki mu sledi 3 mesece brez zdravljenja (n=3) in zdravljenje z glukokortikoidi (400 mg metilprednizolona) mesečno 5 mesecev (n=3) .bioflavonoidi citrusovOvce so bile nameščene v hlevu in hranjene bodisi s kontrolno (115 g/kg kalcija; 2,2 g/ovco na dan) bodisi z nizko vsebnostjo kalcija (5 g/kg kalcija; 1 g/ovco na dan) s koncentratom ovčjih pelet [19]. Vzdrževalne zahteve za nebreje ovce so 1,2 g/ovco na dan[19].

Vzorci krvi so bili zbrani z jugularno venepunkcijo 2 meseca in 5 mesecev po operaciji. Osteokalcin je bil izmerjen z uporabo kompleta za imunski test Micro Vue Osteocalcin, CTX-I pa z uporabo kompleta IDS Serum CrossLaps ELISA, kot smo že poročali [6] Koncentracije skupnega kalcija in fosforja v serumu so bile izmerjene s spektrofotometrijo na klinično kemijskem analizatorju AU680 (Beckman Coulter, Brea , CA, ZDA). Koncentracija 25-hidroksivitamina D v serumu je bila izmerjena s tekočim kromatogramom redčenja izotopov; rafijsko masno spektrometrijo v Endolabu, Canterbury Health Laboratories, Christchurch, Nova Zelandija.

Po mesecih so 5 ovc iz kontrolne skupine in 6 iz skupine OVX evtanazirali in naredili obdukcijo. Pri 5 mesecih so bile evtanazirane tudi preostale ovce (kontrolna skupina n =5, skupina OVX n=6, OVX plus 2m glukokortikoidi n=3 in OVX plus 5m glukokortikoidi n=5 ) in nekropsijo. Vzorci ledvic so bili zbrani v 30 minutah po smrti in razdeljeni na dva dela, pri čemer je bil en vzorec postavljen v 10-odstotni nevtralni puferski formalin in obdelan za histologijo, drugi vzorec pa je bil zamrznjen v tekočem dušiku in shranjen pri -80 stopinjah do obdelave s hematoksilinom in z eozinom obarvane dele ledvic je pregledal primarni avtor in potrdil odsotnost pomembnih lezij.

Vse eksperimentalne postopke je odobril odbor za etiko živali Univerze Massey (številka odobritve 14/103) in izvedeni v skladu s Kodeksom etičnega ravnanja za uporabo živih živali za raziskave na Univerzi Massey, Palmerston North, Nova Zelandija.

Ekstrakcija RNA in qPCR sta bila izvedena, kot je opisano prej [20,21]. Na kratko, Tri reagent (Gigma-Aldrich Inc, Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija) smo uporabili za ekstrakcijo RNA po navodilih proizvajalca. Genomsko DNK smo odstranili z Ambion Turbo DNA free (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ZDA) po navodilih proizvajalca. Koncentracija RNA je bila določena z uporabo fluorometra Qubit 2.0 in kompleta Qubit RNA širokega razpona (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ZDA), kakovost RNA pa je bila ocenjena z določitvijo razmerja 260/280 in tekom na agaroznem gelu. Za sintezo cDNA smo uporabili Transcriptor first strand cDNA synthesis kit (Roche). Vsaka 20 μL reakcijska mešanica je vsebovala 600 ng RNA, 2,5 μM oligo（dT）, 8 mM reakcijski pufer RT, 1 mM dNTP, 10U reverzne transkriptaze, 20 U inhibitor RNaze in vodo brez Rnaze-Dnaze. Reakcija je bila izvedena pri 55 stopinjah 30 minut, 85 stopinjah 5 minut in nato ohlajena pri 4 stopinjah z uporabo Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ZDA). qPCR v realnem času je bil izveden z uporabo naprave StepOne Plus za PCR v realnem času (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA, ZDA). Vsaka mešanica PCR je vsebovala 5 uL glavne mešanice Power SYBR Green PCR (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ZDA), začetnih in povratnih primerjev v koncentracijah, navedenih v tabeli S1, 10 ng cDNA, nato pa je bila dopolnjena do 10 μL. z RNazo, vodo brez DNaze. Protokol PCR je obsegal 95 stopinj za 20 s, 40 ciklov pri 95 stopinjah za in 60 stopinjah za ter končno krivuljo taljenja v razponu od 60 stopinj do 95 stopinj s hitrostjo segrevanja 0,3 stopinje /15 s. Voda in reakcijska mešanica brez reverzne transkriptaze sta bili vključeni kot negativne kontrole v vsak postopek PCR in vsi vzorci so bili izvedeni v dvojniku. Ocenjeni so bili naslednji geni: NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1IIC, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA in NCX1. Prej je bilo ugotovljeno, da sta PKG1 in SDHA stabilno izražena v ovčjih ledvicah [20], vzorci pa so bili normalizirani glede na izražanje teh genov in učinkovitost genov z uporabo metode 2-AACt [22].

Statistična analiza je bila izvedena s programom R Studio 1.3.1093[23] z različico R

4.0.3 in tidyverse, nlme 3.1-150 in Gary

2.1.2 paketi. Linearni modeli so bili uporabljeni za log10 transformirane podatke o zgibni ekspresiji genov. V prvem modelu je bila ekspresija genov spremenljivka izida, medtem ko sta bili skupina (kontrola ali OVX, vendar brez ovc, zdravljenih z glukokortikoidi) in čas (evtanazirana pri 2 m ali 5 m) odvisni spremenljivki, z vključenim izrazom interakcije (skupina: čas). V drugem modelu je bila ekspresija genov spremenljivka izida, medtem ko je bila skupina (kontrola, OVX, OVX z zdravljenjem z glukokortikoidi 2 m in OVX z zdravljenjem z glukokortikoidi 5 m) odvisna spremenljivka.prednosti cinomorijaKer je bilo testiranih več spremenljivk izida (genov) za razlike med skupinami, so bile p-vrednosti prilagojene za večkratno testiranje z uporabo zaporednega Holmovega postopka [24]. Koncentracije serumskega kalcija, fosforja in 25-hidroksivitamina D so bile testirane v modelih genske ekspresije, vendar niso bile pomembne in so bile odstranjene zaradi pomanjkanja pomembnih razlik med skupinami. Poleg tega je bila analiza glavnih komponent uporabljena za oceno, ali se podatki o ekspresiji transformiranega gena log10 razlikujejo glede na skupino, čas evtanazije ali koncentracijo 25-hidroksivitamina D v serumu. Spearmanova parna korelacija in razpršeni diagrami so bili uporabljeni za preučevanje korelacije med log10 transformiranimi podatki o ekspresiji zgubanega gena in serumskimi analiti.

3. Rezultati

3.1. Učinek ovariektomije, časa od ovariektomije in zdravljenja z glukokortikoidi na serumske koncentracije kalcija, fosforja in 25-hidroksivitamina D

Celotni rezultati za serumske koncentracije kalcija, fosforja in 25-hidroksivitamina D v vsaki skupini so predstavljeni na sliki 1. ovariektomirana skupina z nizko vsebnostjo kalcija in skupina brez ovariektomije z ustrezno kalcijevo dieto ter čas od ovariektomije 2 meseca in 5 mesecev. Ti rezultati kažejo, da ovariektomija v kombinaciji z dieto z nizko vsebnostjo kalcija ni vplivala na serumske koncentracije kalcija. Ovce, ki so bile ovariektomirane in mesece zdravljeni z glukokortikoidi, čemur je po 5 mesecih sledila evtanazija, so imeli pomembno nižje koncentracije kalcija v serumu (p =0.0462, adj R20.13) v primerjavi s 5 m ovariektomiranimi na dieti z nizko vsebnostjo kalcija in 5 m ovariektomiranimi na dieta z nizko vsebnostjo kalcija in ovce, zdravljene z glukokortikoidi. Vendar pregled podatkov kaže, da je to lahko posledica ene živali, ki je imela hipokalciemijo (1,52 mmol/L, referenčno območje 2.0-2.7 mmol/L); odstranitev od ta žival je odstranila kakršen koli pomen.puščavska hijacintaVse druge ovce so imele koncentracijo kalcija v serumu znotraj referenčnega območja. V serumskih koncentracijah fosforja ali 25-hidroksivitamina D pri 5 m ovariektomiranih ovcah, zdravljenih z glukokortikoidi, niso opazili razlik.

3.2. Učinek ovariektomije in časa od ovariektomije na ekspresijo genov v ledvicah, povezanih z vitaminom D in fosfatoninom

Genska ekspresija vitamina D in genov, povezanih s fosfatiranjem, ni bila povezana z ovariektomijo ali časom po ovariektomiji (slika 2). Izjema je bil receptor za vitamin D (VDR), pri čemer je imela skupina OVX bistveno večjo izraženost VDR (p=0.05, adj R2 0.16); vendar je ta pomen izginil po prilagoditvi za ponavljajoče se meritve.

3.3. Vpliv ovariektomije in zdravljenja z glukokortikoidi na ekspresijo genov, povezanih z vitaminom D in fosfatoninom, v LEDVICAH 5 mesecev po operaciji

Celotni rezultati so predstavljeni na sliki 3. Izražanje PTH1R je bilo bistveno večje pri ovcah OVX, zdravljenih z glukokortikoidi 5 mesecev, v primerjavi z drugimi skupinami (p=0.04, adj R40.18), medtem ko je bil TRPV5 (p{ {8}}.01, adj R20.31) in CYP24A1(p=0.005, adj R40.40) je bilo značilno večje pri ovcah OVX, zdravljenih z glukokortikoidi 2 meseca, v primerjavi z drugimi skupinami.

Izraženost klotho se je bistveno razlikovala med vsemi skupinami (p =0.01, adj R20.48), z najnižjo izraženostjo pri kontrolnih ovcah. Ovce OVX, zdravljene z glukokortikoidi 2 meseca, so imele najvišjo izraženost (p =0.002), sledile so ovce OVX (p=0.008) in nato ovce OVX, zdravljene z glukokortikoidi 5 mesecev (p{ {10}}.03). Vendar pa se po prilagoditvi za ponavljajoče se meritve izražanje genov med tema skupinama ni bistveno razlikovalo, pri čemer je klotho pokazal največjo razliko pri ovcah OVX, zdravljenih z glukokortikoidi 5 mesecev (p=0.1).

Podobno se je izražanje VDR bistveno razlikovalo med vsemi skupinami (p=0.03, adj R20.38). Največja izraženost VDR je bila pri ovcah OVX, zdravljenih z glukokortikoidi več mesecev (p=0.009), sledile so ovce OVX (p=0.01), nato ovce OVX, zdravljene z glukokortikoidi 5 mesecev (p=0.05), najnižja izraženost pa je bila prisotna pri kontrolnih ovcah.

3.4. PCA splošnega izražanja genov med skupinami

Analiza PCA OVX, kontrole in evtanazije po 2 in 5 mesecih ni uspela ločiti različnih skupin (slika S1). PCL in PC2 sta pojasnila 69,6 odstotka variacije. Podobno tudi analiza PCA skupin, ki so bile evtanazirane po 5 mesecih, ni uspela ločiti različnih skupin. PCL in PC2 sta pojasnila 53,2 odstotka variacije (slika S2). Analiza PCA je pokazala, da splošnega genskega izražanja ni mogoče razložiti s koncentracijami kalcija in fosforja v serumu 25-hidroksivitamina D (slika S3).

3.5. Parna korelacija med vsemi analiti in izražanjem genov

Ne glede na status ovariektomije, vsebnost kalcija v prehrani, čas od ovariektomije (2 m ali 5 m) ali status zdravljenja z glukokortikoidi je bila ekspresija gena NPT1 pomembno in pozitivno povezana (p<001) with="" pth1r,="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" trpv5,="" cald9k,="" and="" cald28k="" gene="" expression.="" pth1r="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><001) with="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" npt2a="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" fgfr1wic.="" klotho="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" cyp24a1="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" trpv5="" and="" cald28k.="" trpv6="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cal9dk="" and="" pmca,="" while="" cal9dk="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cald28k="" and="" pmca.="" none="" of="" the="" serum="" analytes="" measured="" (osteocalcin,="" ctx,="" 25ohd,="" ca,="" and="" p)="" were="" correlated="" with="" the="" expression="" of="" any="" genes.="" the="" full="" pairwise="" correlations="" are="" shown="" in="" figure="">

4. Razprava

Rezultati te študije kažejo, da je imelo zdravljenje ovariektomiranih ovc z glukokortikoidi največji vpliv na izražanje genov, medtem ko sta imela sama ovariektomija in čas od ovariektomije (2 in 5 mesecev) majhen vpliv na izražanje genov. V univariatni analizi so opazili pomembne razlike v ekspresiji gena TRPV5, CYP24A1 in klotho pri ovariektomiranih ovcah, zdravljenih z glukokortikoidi 2 meseca, čemur je sledila evtanazija po 5 mesecih, in v PTH1R pri ovariektomiranih ovcah, zdravljenih z glukokortikoidi 5 mesecev. Razlike so bile najbolj izrazite v izražanju klotho po prilagoditvi za ponavljajoče se meritve.

Kvantitativna periferna računalniška tomografija proksimalne golenice teh ovac je pokazala, da je ovariektomija zmanjšala celotno volumetrično mineralno gostoto kosti (vBMD) za 8 odstotkov, ovariektomija z zdravljenjem z glukokortikoidi za 5 mesecev za 27 odstotkov in ovariektomija z glukokortikoidi za 2 meseca in evtanazija po 5 mesecih za 13 odstotkov [6]. Zanimivo je, da so bili trabekularna MKG, trabekularna površina in vsebnost trabekularnih kostnih mineralov podobni ali večji kot pri kontrolnih ovcah pri ovariektomiranih ovcah, ki so bile 2 meseca zdravljene z glukokortikoidi in evtanazirane po 5 mesecih, kar kaže na okrevanje kostne mase [6]. Glukokortikoidi imajo več dobro dokumentiranih učinkov na kosti, ki vodijo v razvoj z glukokortikoidi povzročene osteoporoze. Ti učinki vključujejo zaviranje tvorbe matičnih celic osteoblastov in osteoblastov, povečanje apoptoze osteoblastov in zmanjšanje proizvodnje osteoidov, kar vse zmanjša tvorbo kosti [25, 26]. Hkrati glukokortikoidi povečajo resorpcijo kosti z zmanjšanjem izražanja OPG, povečanjem izražanja RANKL, povečanjem tvorbe osteoklastov, zmanjšanjem apoptoze osteoklastov in povečanjem izločanja katepsinov in matričnih metaloproteinaz s strani osteoklastov [25, 26].

Klotho je sestavni del sistema fosfatiranja, pri čemer se veže na rastni faktor 23 fibroblastov (FGF23) v ledvicah. Kompleks klotho-FGF23 se nato veže na receptor FGFR1IIC, ki sproži več celičnih poti in na koncu povzroči uravnavanje ekspresije ledvične 24-hidroksilaze (CYP24A1) in znižanje ledvične la-hidroksilaze (CYP27B1) in ledvičnih tubulov Kotransporterji Na/P II (NPT2a in 2c) [10]. Povečana ekspresija (razlike v kateri so bile najbolj izrazite po prilagoditvi za ponavljajoče se meritve) klotha pri ovcah, ki so bile 2 meseca na glukokortikoidih in nato evtanazirane po 5 mesecih, lahko pojasni povečano ekspresijo CYP241, opaženo tudi pri tej skupini ovc, čeprav ni bistvenih razlik v serumske koncentracije 25OHD.

Klotho je znan kot protein proti staranju in miši s pomanjkanjem klotho imajo nizko tvorbo kosti in resorpcijo kosti, kar vodi do nizke osteopenije pri presnovi kosti [27, 28]. Poleg tega so specifični polimorfizmi gena klotho povezani z zmanjšano mineralno gostoto kosti pri ljudeh [29, 30]. Topni kloto uravnava protein zgodnjega odziva na rast 1 (EGR-1) in inducira izražanje markerjev kostne diferenciacije v celični kulturi osteoblastov [31] Poleg tega lahko glukokortikoidi zavirajo rastni faktor fibroblastov 232. Morda je večje izražanje klotho pri ovcah, ki so 2 meseca prejemale glukokortikoide in nato evtanazirane po 5 mesecih, odraz procesa okrevanja te ovce po zdravljenju z glukokortikoidi in je glede na njegovo vlogo pri tvorbi in resorpciji kosti domnevno ključno gonilo okrevanja kosti in zato potencialno tarča zdravljenja osteoporoze pri ljudeh.

Vendar so imele OVX ovce tudi povečan izraz klotho v primerjavi s kontrolnimi ovcami. Podobno je ena študija pri miših s pomanjkanjem aromataze pokazala, da je pomanjkanje estrogena povečalo raven beljakovin klotho, zdravljenje z estradiolom pa je zmanjšalo izražanje klotho pri teh miših [17]. Pri miših estrogen zniža NPT2a v procesu, ki je neodvisen od klotho/FGF23 in PTH[18]. Vendar tega učinka v tej študiji niso opazili pri ovcah z ovariektomijo. Sicer je malo literature o vplivu pomanjkanja estrogena na kloto. Nadaljnje raziskave bi morale preučiti učinke tako ovariektomije kot glukokortikoidov na izražanje klotho, glede na njegovo vlogo pri staranju in kronični ledvični bolezni.

TRPV5 je epitelijski kalcijev kanal, ki je v glavnem izražen v distalnih zavitih tubulih in povezovalnih tubulih ledvic [20, 33]. Kanal TRPV5 je konstitutivno odprt, vendar je podvržen inaktivaciji, odvisni od kalcija, v povezavi s kalmodulinom, proteinom, ki zaznava kalcij [34]. Ekspresijo TRPV5 lahko povečata PTH in 1,25(OH)D3 [35]. Ena ovca, ki je bila 2 meseca na glukokortikoidih in nato evtanazirana po 5 mesecih, je bila hipokalciemična, serumske koncentracije kalcija pa so bile pri ovcah v tej skupini znatno nižje v primerjavi z drugimi skupinami. Zato je verjetno, da je povečana ekspresija TRPV5 posledica zmanjšane koncentracije kalcija v serumu pri teh živalih. Pokazalo se je, da glukokortikoidi zmanjšajo absorpcijo kalcija v črevesju z zmanjšanjem izražanja TRPV6 in CalD9k [36,37] in povečanim izločanjem kalcija z urinom [14], vendar je klinično pomembna hipokalciemija pri zdravih posameznikih redka. Podobno ovce z nizko koncentracijo kalcija v serumu niso kazale kliničnih znakov hipokalcemične tetanije. Druga možnost je, da povečana ekspresija TRPV5 pri ovcah na glukokortikoidih 2 meseca in nato evtanaziranih po 5 mesecih lahko odraža proces okrevanja, pri čemer je za nadomestitev obnovljene trabekularne BMD, površine in vsebnosti mineralov v kosteh potrebna povečana resorpcija kalcija iz ledvic.

Pri ovcah, zdravljenih z glukokortikoidi 5 mesecev, je bila ekspresija PTH1R povečana v primerjavi z drugimi skupinami. Poleg tega je bilo v primerjavi z drugimi skupinami malo razlik v izražanju med ovcami v skupini. Čeprav pri ovcah, zdravljenih z glukokortikoidi 5 mesecev, niso opazili nobenih razlik v koncentracijah kalcija v serumu, bi to morda lahko bilo povezano s povečanim delovanjem PTH in njegovega receptorja. Učinki glukokortikoidov na izločanje in delovanje PTH niso jasni. Nekatere študije pri ljudeh so pokazale, da imajo bolniki, zdravljeni z glukokortikoidi, povečane koncentracije PTH v serumu, skupaj z zmanjšano absorpcijo kalcija, povečanim izločanjem kalcija z urinom in zmanjšano kostno maso [38,39]. Vendar večina študij ni odkrila nobenih sprememb v serumskih koncentracijah PTH pri ljudeh pri zdravljenju z glukokortikoidi [38, 40, 41]. Ena študija je pokazala, da je morda vpliv glukokortikoidov na spreminjanje izločanja PTH, s povečanim utripajočim izločanjem PTH pri posameznikih, zdravljenih z glukokortikoidi [4]. Drugi so prav tako pokazali povečano izražanje PTH1R v mezenhimskih matičnih celicah in osteoblastom podobnih celicah kot odziv na zdravljenje z deksametazonom [43,44]. Tako je povečanje ledvičnega izražanja PTH1R pri ovcah, zdravljenih z glukokortikoidi 5 mesecev, verjetno posledica 5 mesecev zdravljenja z glukokortikoidi.

Medtem ko je ovariektomija v kombinaciji z dieto z blago nizko vsebnostjo kalcija povzročila minimalne spremembe izražanja genov, se je izkazalo, da je spremenila izražanje VDR, pri čemer so imele ovce z ovariektomijo na dieti z blago nizko vsebnostjo kalcija večje izražanje VDR v primerjavi s kontrolnimi ovcami. To je v nasprotju s študijo na podganah z ovariektomijo, pri čemer so tiste, ki so bile hranjene z normalno vsebnostjo kalcija, pokazale povečano ledvično izražanje VDR, medtem ko so tiste, ki so bile hranjene z dieto z nizko vsebnostjo kalcija, zmanjšale izražanje VDR [45]. V tej študiji na ovcah je težko ločiti učinek ovariektomije na ledvično izražanje VDR od učinka diete z nizko vsebnostjo kalcija. Vendar ni bilo pomembnih razlik v serumskih koncentracijah kalcija med skupinami (z izjemo skupine z glukokortikoidi), kar kaže na to, da je imela dieta z rahlo nizko vsebnostjo kalcija minimalen učinek in da so učinki na VDR morda posledica ovariektomije. Vendar bodo potrebne nadaljnje raziskave, da bi raziskali ta razmerja.

Dve prejšnji študiji sta proučevali ločena razmerja med geni, ki se odzivajo na vitamin D, in geni, povezanimi s fosfatiranjem, v ovčjih ledvicah [20, 21]. Vendar povezave med vitaminom D in fosfatiranjem niso bile raziskane. Zanimivo je, da najpomembnejše korelacije med geni, o katerih so poročali v teh dveh dokumentih, veljajo tudi za genske odnose v tej sedanji študiji ovc, kar kaže na doslednost v rezultatih med študijami in odnosi med temi geni.izvleček cistanche salsaOd zanimivih odnosov, o katerih prej ni bilo poročanih, kot bi lahko pričakovali glede na njegovo ključno vlogo pri presnovi kalcija, je bila ekspresija PTH1R močno povezana s CalD28k, CalD9k, TRPV5 CYP27B1, CYP24A1, VDR, Klotho in NPT2c. Ekspresija klotho je bila močno povezana z gensko ekspresijo TRPV5, kar je skladno z drugo literaturo, ki kaže, da klotho uravnava TRPV5 in spodbuja reabsorpcijo kalcija v ledvicah [46, 47].

Na žalost različnih skupin ni bilo mogoče ločiti na podlagi odziva na vitamin D in izražanja genov za fosfatiranje z analizo PCA. To je verjetno posledica glavne omejitve te študije - majhne velikosti vzorca. S samo 3-6 živalmi v vsaki od skupin je to verjetno omejilo zmožnost zaznavanja razlik v izražanju genov med skupinami.

5. Sklepi

Rezultati te študije kažejo, da so bile najbolj izrazite razlike v izražanju genov v izražanju klotho v ledvicah pri ovcah z ovariektomijo, zdravljenih z glukokortikoidi 2 meseca, čemur je sledilo obdobje okrevanja 5 mesecev. Glede na to, da je kloto hormon "proti staranju" in ima ključno vlogo pri presnovi kalcija in fosfata, je možno, da je ta hormon ključno vključen v obnovo trabekularne mineralne gostote in površine kosti pri zdravljenih ovcah in je zato lahko potencialno cilj zdravljenja osteoporoze pri ljudeh. Vendar je potrebnih več raziskav o učinkih glukokortikoidov in ovariektomije na kloto.

Ta članek je izvleček iz Animals 2022, 12, 67. https://doi.org/10.3390/ani12010067 https://www.mdpi.com/journal/animals