Oksidativni stres je eden od pomembnih predhodnikov različnih presnovnih bolezni 2. del

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

3. Razprava

Prosti radikali lahko napadajo beljakovine, lipide ali DNK, da pridobijo elektron, kar povzroči različne zdravstvene težave. Zaradi tega je bistveno uravnovesiti antioksidativni sistem telesa in proste radikale, ki nastanejo z oksidacijo. V primeru poslabšanja tega ravnovesja nastane oksidativni stres [29]. Oksidativni stres je eden glavnih dejavnikov, ki povzročajo različne kronične motnje, kot so rak, sladkorna bolezen, kardiovaskularne bolezni, Alzheimerjeva bolezen itd. Čeprav v človeškem telesu obstajajo samo-antioksidativni sistemi za boj proti oksidativnim poškodbam tkiv in organov, ti obrambni sistemi lahko izgubijo svojo učinkovitost zaradi različnih pogojev, kot so prekomerno uživanje alkohola, kajenje, stres, kronična uporaba drog in sevanje itd. [30]. Različna znanstvena poročila so pokazala, da imajo sekundarni rastlinski metaboliti pomembno vlogo pri preprečevanju oksidativnega stresa in njegovih škodljivih učinkov [13,14,31]Čeprav je biološka uporabnost pomemben parameter, ki vpliva na bioaktivnost teh spojin, ni bila upoštevana pri večina študij. Vendar pa je dobro znano, da so sekundarni metaboliti podvrženi strukturnim transformacijam zaradi različnih pogojev pH, encimske aktivnosti in telesne temperature v prebavilih. Poleg tega so pomembne dejavnike, ki vplivajo na njihovo biološko uporabnost, tudi kemijske lastnosti sekundarnih metabolitov, kot so molekulska masa, polarnost in stopnja vezave na makromolekule v rastlinskem matriksu [13]. Zato je absorpcija spojin ali njihovih metabolitov v krvni obtok po zaužitju bistvenega pomena za izvajanje njihovih sistemskih fizioloških učinkov. Simulacijski modeli prebave in vitro lahko zagotovijo dokaze za oceno možnih značilnosti biološke uporabnosti snovi. Medtem ko je potrditev v preskušanjih na ljudeh potrebna za uveljavljanje kakršnih koli funkcionalnih lastnosti, se simulacijski modeli in vitro pogosto uporabljajo kot alternativa študijam in vivo ali preskušanjem na ljudeh, ki so pogosto etično sporna, zahtevajo veliko virov, draga in dolgotrajna [32].

Za več informacij kliknite tukaj

Več raziskovalcev je preučevalo tudi antioksidativni potencial izvlečkov, pripravljenih iz različnih organov vrste Cistus. Glede na pregled literature je to prva študija o vrstah Cistus v zvezi z biološko uporabnostjo fenolnih snovi in ​​njihovim vplivom na antioksidativno aktivnost z uporabo simulacijskega modela prebave in vitro. Karas et al. [33] je predlagal, da 10 odstotkov polifenolnih komponent ostane neprebavljenih v rastlinskem matriksu in 90 odstotkov jih je izpostavljenih prebavi v želodčni ali črevesni fazi (približno 48 odstotkov oziroma 52 odstotkov). Kot smo že omenili, je in vitro postopek simulacije človeške prebave negativno vplival na vse količine fenolov v vodnih ekstraktih. Tako so bile odkrite pomembne izgube v vsebnosti fenolov biološko razpoložljivih vzorcev vseh ekstraktov. Poleg tega so bile skupne koncentracije proantocianidina v vzorcih IN pod mejo zaznavnosti v vseh vodnih ekstraktih. Različne študije so tudi spodbudile negativen vpliv postopka prebave na fenolne spojine v rastlinskih izvlečkih in s tem povezane bioaktivnosti. Na primer, poročali smo o skupni vsebnosti fenolov Salvia virgata Jacq. Nanj je negativno vplival tudi postopek prebave v naši prejšnji študiji. Poleg tega so se količine glavnih metabolitov ekstrakta, tj. rutina in rožmarinske kisline, zmanjševale [13]. Nasprotno pa je več študij poročalo o nasprotujočih si rezultatih. V študiji Celeba et al. [34] so opazili povečanje skupne količine fenolne kisline, flavonoida in fenola v biološko razpoložljivih vzorcih metanolnega izvlečka Hypericum perfoliatum L. Pravzaprav so imeli glavni presnovki, kvercitrin, klorogenska in galna kislina, razmerja biološke dostopnosti nad 100 odstotkov. Te študije so pokazale, da se lahko učinki postopka prebave razlikujejo glede na rastlinske materiale. Da bi razjasnili te razlike, je nujno upoštevati mehanizem delovanja prebavnega sistema na fenolne snovi. (koristi bioflavonoidov) Serra et al.[35] predlagal, da se fenolne spojine večinoma nahajajo v glikozidih, polimerih in estrskih oblikah v rastlinskem matriksu in se pred absorpcijo hidrolizirajo v prebavnem sistemu. Na strukturne transformacije fenolnih spojin v prebavnem traktu lahko vplivajo različni dejavniki. Na primer, spojine z večjo molekulsko maso, kot so proantocianidini ali procianidini, je treba pred absorpcijo v črevesju hidrolizirati. Struktura rastlinskega matriksa je prav tako pomemben dejavnik pri biološki uporabnosti fenolov; (kupi cistancheFenolne spojine se lahko vežejo na makromolekule v rastlinskem matriksu, kot so vlakna, proteini in lipidne molekule. Tako se lahko samo sproščene fenolne komponente iz matriksa absorbirajo iz prebavil. Poleg tega so različne vrednosti pH in encimsko delovanje črevesne mikrobiote med drugimi ključnimi dejavniki, ki vplivajo na transformacijo kemijske strukture fenolnih spojin [36]. Glede na te podatke lahko domnevamo, da so lahko različni rezultati, pridobljeni iz podobnih vrst eksperimentalnih študij, posledica kompleksnosti prebavnega sistema in sestave rastlinskega matriksa. Kot je prikazano v tabeli 3, so biološko razpoložljivi vzorci izvlečkov Cistus pokazali šibkejše antioksidativno delovanje kot neprebavljeni in post-gastrični primerki zaradi nižje vsebnosti fenolov.

Cistanchelahkoizboljšati imuniteto

Poleg tega sta oba izvlečka C. saluifolius pokazala boljšo antioksidativno aktivnost v testih DPPH, CUPRAC, FRAP in TOAC v primerjavi z drugimi vrstami. Poleg tega sta oba izvlečka C.paroiffourus pokazala večjo aktivnost lovljenja radikalov DMPD kot izvlečki drugih vrst. Kot je navedeno v tabeli 1, so skupni fenoli, flavonoidi,cistanche bienfaitsin vsebnosti fenolnih kislin C. salviifolius so bile višje kot v drugih vzorcih. Tako je lahko večji antioksidativni potencial izvlečkov C. salviifolius povezan z vsebnostjo fenolov.

Poleg tega je lahko zmanjšanje antioksidativnih potencialov, inhibitornih aktivnosti na encime, povezane z ogljikovimi hidrati, in AGE biološko razpoložljivih vzorcev povezano z upadom označevalnih flavonoidnih glikozidov. Vendar pa so ekstrakti Cistus vsebovali tudi druge fenolne snovi, kot je prikazano na sliki 1. Zato je potrebna podrobna kromatografska analiza ekstraktov za spremljanje vpliva prebave na biološko aktivnost.

Zaviralni potencial rastlinskih izvlečkov na prebavne encime je nedavno pritegnil več pozornosti zaradi pomislekov glede varnosti sintetičnih zaviralcev. Zato je bil inhibitorni učinek rastlinskih izvlečkov določen v več študijah in ta učinek je bil na splošno povezan s fenolnimi snovmi, kot so flavonoidi, fenolne kisline, proantocianidini itd. Sun et al. [37] je predlagal, da polifenolne spojine kažejo svoje inhibitorne učinke z vezavo na zgoraj omenjene encime s pomočjo hidrofobnih sil in nekovalentnih vezi. Zato je zaviranje aktivnosti encimov o-amilaze in a-glukozidaze s polifenoli povezano z njihovimi molekularnimi strukturami. Čeprav so ta mehanizem interakcij preučevali z uporabo različnih tehnik, kot so kinetika inhibicije, molekularno spajanje, dušenje fluorescence itd., še ni bil dosežen noben določen zaključek [38]. Vendar pa so številne študije poročale, da so zaviranja prebavnih encimov rastlinskih izvlečkov neposredno povezana z njihovo vsebnostjo fenolov. O podobnih študijah o encimskih inhibitornih aktivnostih vrst Cistus so poročali tudi prej. Sayah et al. [39] so raziskovali inhibitorne aktivnosti 8{{10}} % metanolnih in vodnih ekstraktov iz C. monspeliensis in C. saluifolius za -amilazo in -glukozidazo. Njihovi rezultati so bili v skladu s to študijo, ki je razkrila, da je vodni ekstrakt C. salvifolius pokazal višjo o-glukozidazo (ICso ug/mL:0.95±0.14) in -amilazo (IC5{ {55}} ug/mL:217,1±0,15) zaviralno aktivnost kot vodni ekstrakt C. monspeliensis （IC50 ug/mL∶ 14,58±1,26） oziroma （IC50 4g/mL:886,10±0,10). Zaviralne stopnje obeh vodnih ekstraktov na te encime so bile višje od referenčne spojine akarboze (ICso ug/mL:18,01±2.00). Podobno kot v naši študiji so ugotovili korelacijo s stopnjami zaviranja encimov in skupnim količine fenolov in flavonoidov. Skupna vsebnost fenolov in skupnih flavonoidov v vodnem izvlečku C. saloijfolius (408,43 ± 1,09 mg GAE oziroma 140.00 ± 1,15 RE) sta bili višji kot v vodnem izvlečku C. monspeliensis (261,76 ± 1,9 mg GAE oz. 78.00±1,15 RE oziroma). Orhan et al. [40] so prav tako raziskali inhibitorne potenciale 80-odstotnih vodnih in etanolnih izvlečkov iz listov C. laurifolius za prebavne encime. Glede na njihove rezultate je 80-odstotni etanolni ekstrakt (71,7 odstotka ±0,6) pokazal močno inhibitorno aktivnost za -amilazo v primerjavi z vodnim ekstraktom (39,3 odstotka ±2,2) pri koncentraciji 1 mg/mL. Predlagali so, da fenolne spojine, zlasti flavonoidi, neposredno vplivajo na izločanje inzulina s preprečevanjem apoptoze celic beta in podpiranjem antidiabetičnega delovanja. Ta hipoteza v korelaciji z našimi rezultati kaže, da je vzorec ND vodnih izvlečkov C. salviifolius pokazal najvišjo skupno vsebnost flavonoidov in fenolov ter največje inhibitorne aktivnosti za -amilazo in o-glukozidazo. Kot je navedeno v tabeli 4, je vodni ekstrakt C. salviifolius pokazal boljše inhibitorne aktivnosti na prebavne encime kot drugi ekstrakti. Poleg tegacistančni holesterolIN vzorci vodnih ekstraktov so vsebovali nižje količine fenolov in flavonoidov kot vzorci ND in so tako razkrili nižje inhibitorne aktivnosti encimov v tem delu. Medtem ko je postopek prebave negativno vplival na vsebnost fenolov v izvlečkih, so še vedno pokazali pomembno inhibitorno aktivnost prebavnih encimov. V več študijah so poročali o flavonoidnih glikozidih kot glavnih presnovkih rastlinskih izvlečkov z močnim inhibitornim potencialom za -amilazo in -glukozidazo[41-43]Medtem ko mehanizem zaviranja fenolnih spojin na prebavne encime še ni razkrit, struktura- Študije razmerja med aktivnostmi so bile izvedene na nekaterih fenolnih komponentah, kot so flavonoidi, fenolne kisline, proantocianidini in tanini. Študije razmerja med strukturo in aktivnostjo flavonoidov so pokazale, da dvojna vez C2=C3 obroča C poveča potencial zaviranja prebavnih encimov takih spojin. Ker ta vez poveča elektronsko gostoto, se poveča moč interakcije med flavonoidom in encimom [44]. Poleg tega hidroksilne skupine na C-5 in C-7 olajšajo inhibitorni potencial flavonoidov za -amilazo. Predlagano je bilo tudi, da hidroksilacija ogrodja flavonoidov pozitivno vpliva na njihov inhibitorni potencial a-amilaze in -glukozidaze [45]. Kot je bilo že omenjeno, so bili vsi označevalni flavonoidi v tej študiji flavonolni glikozidi, ki so imeli zgoraj opisane strukturne zahteve. Vendar so se po postopku prebave in vitro njihove povezane aktivnosti znatno zmanjšale v biološko razpoložljivih vzorcih vodnih izvlečkov.

Na splošno je zaviralni potencial rastlinskih izvlečkov na AGE povezan z več dejavniki, tj. njihovo vsebnostjo fenolov, antioksidativnim potencialom, zmožnostjo keliranja kovin, interakcijami z beljakovinami in aktivnostmi blokiranja receptorjev AGE [13]. Kot je predstavljeno v tabeli 4, so biološko razpoložljivi vzorci vodnih izvlečkov pokazali nižje inhibitorne aktivnosti AGE v primerjavi z vzorci ND, saj je postopek prebave in vitro negativno vplival na vsebnost fenolov v izvlečkih. Glede na trenutne rezultate študije je vzorec ND vodnega ekstrakta C. (cistanche in tongkat ali reddit) saluifolius je imel največjo inhibitorno aktivnost AGE ter skupno vsebnost fenolov in flavonoidov. Za primerjavo je IN vzorec vodnega ekstrakta C. monspeliensis pokazal najšibkejši inhibicijski potencial AGE, kar lahko pripišemo njegovi najnižji skupni vsebnosti flavonoidov in fenolov. Ker so flavonoidi široko razširjeni v rastlinskih izvlečkih, sadju, zelenjavi in ​​pijačah, se je okrepilo več študij o potencialu zaviranja flavonoidov na tvorbe AGE. Isti flavonoidi, ki so bili v tej študiji označeni kot označevalni fenoli, so bili navedeni tudi kot označevalne spojine v drugih študijah [46-48].

Podobno kot zaviranje prebavnih encimov so zaviralne aktivnosti flavonoidov AGE spodbudili dvojna vez C2=C3 in hidroksilacija obročev A in C. Vendar pa vezava sladkorja na flavonoidni skelet povzroči zmanjšano zaviralno aktivnost [49]. Po drugi strani pa Cervantes-Lauren et al.[50] predlagal, da imajo flavon-3-glikozidi večji potencial inhibicije AGE kot drugi flavonoidni glikozidi. Ta hipoteza je lahko razlaga za zmanjšano inhibicijo AGE v biološko razpoložljivih vzorcih. V biološko razpoložljivih vzorcih vodnega izvlečka C. monspeliensis na primer kvercitrina in hiperozida nismo zaznali, kar je razlog za nižjo aktivnost vzorcev IN C. monspeliensis v primerjavi z izvlečki drugih vrst. Čeprav kvercitrin ni bil odkrit v vodnem izvlečku C. saloifolius, so lahko znatno večje količine hiperozida in salidrozida vzrok za njegovo visoko inhibicijsko aktivnost AGE. Na splošno so opazili pozitivno korelacijo med vsebnostjo označevalnih flavonoidov v vzorcih in njihovim inhibitornim potencialom na AGE.

4. Material in metode

4.1.Kemikalije

Vse reference, encimi in kemikalije, uporabljene v poskusih, so bile kupljene pri Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, ZDA). V poskusih so bili uporabljeni materiali analitične kakovosti.

4.2 Vzorci rastlin

Nadzemni deli C.creticus in C.saloifolius so bili zbrani v kampusu univerze Yeditepe (Kayisdagi, Istanbul) zadnji teden aprila 2018. Nadzemni deli C.mon-speliensis in C. paroiflorus so bili zbrani v bližini Alacant Kutlu Aktas Balaji, Cesme, Izmir v drugem tednu maja 2018. Nadzemni deli C. laurifolius so bili zbrani na cesti Kemer-Doganhisar, Konya, v prvem tednu junija 2018. Prof. dr. Erdem Yesilada je potrdil pristnost rastlinskih materialov. Vzorci vavčerjev za C. creticus (YEF18013), C. Lauri folium (YEF18017), C. monspeliensis (YEF18015), C. paroiflorus (YEF18016) in C. salvifolius (YEF18014) so ​​bili shranjeni v Herbariju Oddelka za farmakognozijo FK. farmacije, Univerza Yeditepe, Istanbul, Turčija. 4.3. Postopek ekstrakcije

Vodna ekstrakcija je bila izbrana, ker se običajno uporablja kot tehnika priprave v tradicionalni medicini. Grobo na zraku posušene in v prah zmlete nadzemne dele vrste Cistus (100 g) smo ekstrahirali z vročo destilirano vodo (80 stopinj, 1,5 L) s pomočjo stresalne naprave 15 minut. Nato smo vodne ekstrakte filtrirali skozi filtrirni papir in uparili do suhega pod znižanim tlakom. Po končanem postopku liofilizacije smo ekstrakte raztopili v destilirani vodi za nadaljnjo obdelavo (neprebavljeni vzorec: ND) (dobitek ekstraktov: 13,04 % za C.creticus, 15,7 % za C.laurifolus, 12,8 % za C.monspeliensis 14,94 odstotka za C.parviflorus, 14,74 odstotka za C.salvifolius). 4.4. Metoda simulacije človeške prebave in vitro

Model simulacije človeške prebave je bil uporabljen za vzorce Cistus in vitro po metodi, ki so jo prej podrobno opisali Celeb et al [34]. Najprej smo 1 g NaCl in 1,6 g pepsina raztopili v 500 ml destilirane vode, da smo dobili raztopino simulirane želodčne tekočine (SGF). Kasneje smo pH raztopine SGF naravnali na 2 s HCl (5 M); 17,5 ml te raztopine zmešali z 2,5 ml rastlinskih vzorcev in to zmes postavili v stresalno vodno kopel pri 37 stopinjah za 2 uri, da bi posnemali peristaltična gibanja prebavnega sistema. Po 2 urah smo vzorce postavili v ledeno kopel, da smo inaktivirali encimske reakcije; 2 mL vzorcev smo dali na stran kot "post-gastrični" (PG) vzorec za nadaljnje poskuse. Celulozna dializna membrana, napolnjena z ustrezno količino NaHCO3 (1 M, pH7), je bila nameščena v hladnih raztopinah vzorcev; tako je bila posnemana gastrointestinalna absorpcija. Nato smo 4,5 ml raztopine žolčnih kislin/pankreatina združili z raztopinami in zmes inkubirali še 2 uri pri 37 stopinjah. Končno je bila tekočina znotraj dializne membrane pridobljena kot "biološko razpoložljiv" vzorec (IN). Po končanem postopku so bili vsi vzorci shranjeni pri -20 stopinji za nadaljnje poskuse. 4.5 Ocena fenolnega profila in vitro 4.5.1. Test vsebnosti skupnega fenola Spektrofotometrična določitev vsebnosti celotnega fenola v vzorcih je bila izvedena v šabloni plošče z vdolbinicami 96-v skladu z metodo, ki so jo prej podrobno opisali Barak et al.【32】;75 uL NagCO3（20 odstotkov v H2O ） smo dodali 20 μL sveže pripravljenih vzorcev in referenčnih raztopin. Nato smo z mešanico združili 100 μL reagenta Folin-Ciocalteu. Po 30 minutah inkubacije pri sobni temperaturi v temi smo izmerili absorbanco pri 690 nm. Galna kislina je bila uporabljena kot referenčna raztopina pri različnih koncentracijah za vzpostavitev umeritvene krivulje, skupne vsebnosti fenolov pa so bile izražene kot ekvivalenti galne kisline (GAE). 4.5.2. Test vsebnosti skupnih flavonoidov Spektrofotometrična določitev vsebnosti skupnih flavonoidov v vzorcih je bila izvedena v šabloni plošče z vdolbinicami 96-v skladu s predhodno razloženo metodo Bardakci et al. 【51】; 150 µL 75-odstotnega etanola, 10 µL aluminijevega klorida in 10 uL 1M natrijevega acetata trihidrata smo ločeno zmešali s 50 uL vzorčne in referenčne raztopine. Nato smo te mešanice inkubirali pri temperaturi temnice 30 minut. Po inkubacijskem obdobju je bila absorbanca izračunana pri 405 nm. Kvercetin je bil uporabljen kot referenčna raztopina pri različnih koncentracijah za vzpostavitev umeritvene krivulje, skupne vsebnosti flavonoidov pa so bile predstavljene kot ekvivalenti kvercetina (QE).

4.5.3. Test vsebnosti skupne fenolne kisline

Celotna vsebnost fenolne kisline v vzorcih je bila izmerjena spektrofotometrično po postopku, o katerem so prej poročali Barak et al. [52]. Najprej smo ustrezne količine natrijevega nitrita in natrijevega molibdata raztopili v destilirani vodi, da smo dobili Arnow reagent. Nato smo 1 ml vzorcev ločeno združili z 1 ml Arnow reagenta, 1 ml 0.1 M HCl in 1 ml 1 M NaOH. Nato smo volumen mešanice naravnali na 10 ml z destilirano vodo in takoj odčitali absorbanco pri 490 nm. Kofeinska kislina je bila uporabljena kot referenčna raztopina pri različnih koncentracijah, da bi dobili umeritveno krivuljo, skupne vsebnosti fenolne kisline pa so bile podane kot ekvivalenti kofeinske kisline (CAE).

4.5.4. Test vsebnosti celotnega proantocianidina

Spektrofotometrična določitev celotne vsebnosti proantocianidina v vzorcih je bila izvedena v 96-šabloni plošče z vdolbinicami po metodi Baraka et al. [11]. Na kratko, 25 uL raztopine vzorca smo zmešali s 150 uL 4-odstotne raztopine vanilina oziroma 75 uL raztopine HCl (32 odstotkov). Po 15-minutnem času inkubacije pri temperaturi temnice je bila absorbanca naravnana na 492 nm. Katehin hidrat smo uporabili kot referenčno raztopino v različnih koncentracijah, da smo dobili umeritveno krivuljo. Kot kontrolno raztopino smo uporabili metanol. Celotna vsebnost proantocianidina v vzorcih je bila navedena kot katehinski ekvivalenti (CE).

4.6. Testi aktivnosti lovljenja prostih radikalov 4.6.1. Test aktivnosti lovljenja radikalov DPPH

Aktivnost odstranjevanja radikalov DPPH v vzorcih je bila določena v 96-šabloni plošče z vdolbinicami po metodi, ki so jo spremenili Celeb et al.[53]. Najprej smo sveže pripravili 150 uM raztopine DPPH. Nato smo 200 μL raztopine DPPH zmešali s 25 uL raztopine vzorcev. Nato smo to mešanico inkubirali pri temperaturi temnice 50 minut. Absorbanca je bila izračunana pri 540 nm. Butilirani hidroksitoluen (BHT) je bil uporabljen kot referenčna raztopina pri različnih koncentracijah. Kot kontrolno raztopino smo uporabili metanol. Aktivnost vzorcev je bila predstavljena kot EC50, kar ustreza koncentraciji, ki kaže 50-odstotno aktivnost.

4.6.2. Test aktivnosti lovljenja radikalov DMPD

Aktivnost lovljenja radikalov DMPD* (N, N-dimetil-p-fenilendiamin) vzorcev je bila izvedena v šabloni plošče z vdolbinicami 96- v skladu z metodo, ki so jo prej opisali Inan et al. [13]. Prvič, 10{{10}} mM DMPD plus raztopina, 0,05 M FeCl; Raztopina 6H2O in 0,01 M acetatni pufer sta bila sveže pripravljena. Nato smo zmešali 1 mL raztopine DMPD, 100 mL acetatnega pufra in 0,2 mL raztopine FeCl3-6H2O, kasneje pa 15 uL raztopin vzorca združili z 210 μL te mešanice. Po inkubacijskem obdobju pri temni sobni temperaturi 50 minut smo izmerili absorbanco pri 492 nm. Trolox smo uporabili kot referenčno raztopino v različnih koncentracijah, da smo dobili umeritveno krivuljo. Koncentracije vzorčnih raztopin so bile 1 mg/mL. Aktivnosti odstranjevanja radikalov DMPD v vzorcih so bile navedene kot Trolox ekvivalenti (TE). 4.7. Testi redukcijske aktivnosti kovin

4.7.1. Preskus moči antioksidantov, ki zmanjšuje železo (FRAP)

Določanje aktivnosti FRAP vzorcev je bilo izvedeno v šabloni plošče s 96 jamicami po postopku, ki so ga prej opisali Bardakci et al [54]. Na začetku poskusa je bil reagent FRAP oblikovan z mešanjem raztopin acetatnega pufra, feri-tripiridiltriazina in raztopin FeCl;6H2O. Po tem smo reagent FRAP dali v pečico pri 37 stopinjah za 30 min. Nato smo 10 uL vzorčnih raztopin združili s 30 μL destilirane vode oziroma 260 uL reagenta FRAP. Po inkubacijskem času pri 37 stopinjah 30 minut smo absorbanco prilagodili na 593 nm. Standardna krivulja je bila zgrajena z uporabo različnih molarnosti raztopine železovega sulfata (0.25-2 mM) za ovrednotenje rezultatov. BHT je bil uporabljen kot referenčna raztopina v različnih koncentracijah. Aktivnosti FRAP vzorcev so bile predstavljene kot mM FeSO4 v 1 g suhega ekstrakta.

4.7.2. Preizkus zmanjševanja antioksidativne zmogljivosti bakra (CUPRAC)

Aktivnost CUPRAC vzorcev je bila določena v 96-šabloni plošče z vdolbinicami po metodi, ki so jo spremenili Celeb et al. 【31】; 85 µL raztopin CuSO4 （10 mM）, neokupraina in amonijevega acetata ter 51 µL destilirane vode je bilo ločeno dodanih 43 µL raztopin vzorca. Po inkubacijskem obdobju (20 minut) pri 50 stopinjah v vodni kopeli smo izmerili absorbanco pri 450 nm. Za pridobitev umeritvene krivulje smo kot referenčno raztopino uporabili askorbinsko kislino v različnih koncentracijah. Aktivnosti CUPRAC vzorcev so bile predstavljene kot ekvivalenti askorbinske kisline (AAE). 4.8. Test skupne antioksidativne aktivnosti (TOAC)

Določitev celotne antioksidativne aktivnosti vzorcev je bila izvedena v 96-šabloni plošče z vdolbinicami po postopku Celeba et al. [55]. Najprej smo zmešali določeno količino monobazičnega natrijevega fosfata, amonijevega molibdat tetrahidrata in žveplove kisline, da smo dobili raztopino TOAC. Nato smo 300 µL raztopine TOAC dodali 30 µL raztopin vzorcev. Po inkubacijskem obdobju pri 95 stopinjah v vodni kopeli 90 minut smo določili absorbanco pri 690 nm. Za pridobitev umeritvene krivulje smo kot referenčno raztopino uporabili askorbinsko kislino v različnih koncentracijah. Aktivnosti TOAC vzorcev so bile predstavljene kot ekvivalenti askorbinske kisline (AAE). 4.9. Ocena indeksa biološke uporabnosti

Indeks biološke uporabnosti (BAvI) je bil izračunan v skladu s teoretično enačbo, ki so jo opisali Inan et al [13]:

BAVI=CIN/CND »Indeks biološke uporabnosti« (BAvI) je bil opisan kot razmerje med številom fenolov v biološko razpoložljivem vzorcu (IN) in tistim v neprebavljenem vzorcu (ND). 4.10. Kvantifikacija označevalnih flavonoidov s HPTLC

Kvantitativno določanje koncentracij salidrozida, hiperozida in kvercitrina v vseh simulacijskih vzorcih (ND, PG, IN) vodnih izvlečkov vrste Cistus je bilo izvedeno s tankoplastno kromatografijo visoke ločljivosti (HPILC) (CAMAG, Muttenz, Švica) po metodi, ki so jo potrdili Guzelmeric et al. [16]. Hiperozid, salidrozid in kvercitrin smo pripravili v koncentracijah 25,50 in 10{{30}} ug/mL, koncentracije sveže pripravljenih raztopin vzorcev pa prilagodili 10 mg/ml. Te raztopine smo nanesli na plošče s silikagelom s steklom v normalni fazi (20 cm × 10 cm, Merck, Darmstadt, Nemčija) z določenimi volumni （1-5 μL standardne raztopine in 5 μL raztopine vzorcev） z uporabo 100 μL brizg （ Hamilton, Bonaduz, Švica）. Postopek nanašanja je bil izveden z aplikatorjem vzorcev Linomat 5. Postopek razvijanja je potekal v avtomatizirani razvojni komori (ADC 2) in etil acetat: diklorometan. ocetna kislina. mravljinčna kislina: voda (10:25:10). :10:10:10me) smo izbrali kot mobilno fazo. Nato smo plošče derivatizirali z reagentom naravnega produkta (NPR) (1 g 2-aminoetil estra difenilborove kisline v 200 ml etil acetata) v potopni napravi (CAMAG) Medtem ko smo hiperozid in kvercitrin analizirali spektrofotometrično pri 260 nm, smo količino salidrozida izmerili pri 330 nm z UV skenerjem.Rf vrednosti standardov so bile določene kot hiperozid (≈0,35), kvercitrin (c0,45), tilirozid (≈ 0,65）. Ugotovljeno je bilo, da korelacijski koeficienti (r²) ×0,98 za kvantifikacijo markerskih flavonoidov.

4.11. Inhibitorna aktivnost na encime, povezane s sladkorno boleznijo 4.11.1. - Inhibitorna aktivnost glukozidaze

Inhibicijske aktivnosti -glukozidaze neprebavljenih in biološko razpoložljivih vzorcev, pridobljenih iz vodnih izvlečkov vrste Cistus, so bile preučene po metodi, ki so jo prej pojasnili Balan et al. [56]. Najprej smo zmešali ustrezne količine mononatrijevega fosfata in dinatrijevega fosfata z nabavo 100 mM fosfatnega pufra (pH7). ac glukozidazni encim smo raztopili v fosfatnem pufru, da smo dobili raztopino -glukozidaze （0.2U/mL）. Nato smo združili 170 uL fosfatnega pufra, 20 μL raztopine -glukozidaze in 20 μL raztopin vzorcev ter 15 minut inkubirali v pečici pri 37 stopinjah. Nato smo zmesi dodali 20 uL 2,5 mM raztopine p-nitrofenil- -D-glukopiranozida v 100 mM kalijevega fosfatnega pufra (pH7,0) in izvedli drugo inkubacijsko obdobje pri 37 stopinjah 15 minut. Nato smo zmesi dodali 80 μl 0,2 M raztopine natrijevega karbonata, da smo zaključili reakcijo. Absorbanca je bila izmerjena pri 405 nm. Kot referenco smo uporabili raztopino kvercetina v različnih koncentracijah. Rezultati so bili ocenjeni kot odstotek inhibitorne aktivnosti v koncentracijah 1 mg/mL in 0,5 mg/mL vzorcev ND in IN vodnih izvlečkov vrste Cistus.

4.11.2. -Inhibitorna aktivnost amilaze

-amilazno inhibitorno aktivnost neprebavljenih in biološko razpoložljivih vzorcev, pridobljenih iz vodnih ekstraktov vrste Cistus, smo določili po postopku, ki so ga predhodno podrobno opisali Balan et al. [56]. Spektrofotometrično določanje inhibitornih aktivnosti vzorcev za a-amilazo smo izvedli z uporabo reagenta DNS (3,5-dinitrosalicilna kislina). Kot je navedeno v metodi, maltoza nastane s pretvorbo škroba, rumena barva alkalnega DNS pa se spremeni v oranžno-rdečo zaradi maltoze, proizvedene iz škroba. Tako smo 96 mM raztopino DNS pripravili iz mešanice raztopine natrijevega kalijevega tartrata (raztopljenega v 2 M NaOH) in določene količine DNS (raztopljenega v destilirani vodi). Nato smo pripravili 20mM natrijev fosfatni pufer s 6,7 mM NaCl (kofaktor encima a-amilaze) pri 20 stopinjah (pH:6,9). encim a-amilaza (1U/mL) in škrob (10 mg/mL) smo raztopili v tem pufru. Po tem smo 50 μL natrijevega fosfatnega pufra in 10 μL raztopine encima a-amilaze zmešali z 20 μL raztopin vzorcev. To zmes smo inkubirali pri 37 stopinjah 45 minut. Po inkubacijski dobi smo mešanici dodali 20 μL raztopine škroba. Druga inkubacijska doba se je začela pri 37 stopinjah za 45 minut. Enak postopek smo uporabili za vzorce brez dodatka raztopine encima o-amilaze, imenovane "ozadje vzorca". Kontrolno skupino smo proučevali z enakim postopkom v odsotnosti raztopin vzorcev. Absorbanco smo izmerili pri 540 nm. Akarbozo smo uporabili kot referenčno raztopino pri različnih koncentracijah. Rezultati so bili predstavljeni kot odstotek inhibitorne aktivnosti v koncentracijah 1 mg/mL in 0,5 mg/mL vzorcev ND in IN iz vodnih ekstraktov vrste Cistus. 4.11.3. Zaviralna aktivnost AGE

Inhibicijska aktivnost AGE neprebavljenih in biološko razpoložljivih vzorcev iz vodnih ekstraktov vrste Cistus je bila določena po metodi, ki so jo opisali Starow-icz et al. [57]. Pred kakršnim koli postopkom so bile sveže pripravljene koncentracije 1 mg/mL in 0.5 mg/mL vzorcev ND in IN. Nato smo 1 ml raztopine govejega serumskega albumina (BSA) s koncentracijo 10 mg/mL dodali k 1 ml raztopin vzorca ND in IN. Kontrolne vzorce smo pripravili brez dodajanja raztopin vzorcev ND in IN, slepe vzorce pa brez dodajanja 0,5 M glukoze. Nato smo vse pripravljene vzorce inkubirali 40 ur v stresalni vodni kopeli pri 55 stopinjah. Po končanem inkubacijskem obdobju je bil za izračun intenzivnosti fluorescence uporabljen večmodni čitalnik mikroplošč Thermo ScientificTM VarioskanTMLUX v območju vzbujanja 370 nm/440 nm emisij. Kot referenčno raztopino smo uporabili kvercetin v različnih koncentracijah.

5. Sklepi

V tej študiji so bili vodni izvlečki vseh vrst Cistus, zabeleženih v turški flori, raziskani glede njihovih fenolnih profilov in in vitro antioksidativnih in antidiabetičnih potencialov. Ker je prevretek ali poparek običajna oblika v tradicionalni medicini, je uporaba vodnih izvlečkov za oceno aktivnosti v eksperimentalnih študijah še posebej pomembna. Po drugi strani pa so hidrofilne sestavine v vodnem izvlečku po zaužitju podvržene vrsti presnovnih transformacij v prebavilih. Zato je treba za pravilno oceno aktivnosti tradicionalnih formulacij raziskati tudi aktivnosti biološko razpoložljivih metabolitov.

To je prva študija, ki preučuje posledice in vitro metode simulacije človeške prebave na turške vrste Cistus. Poleg tega je bil v tej študiji prvič preučen inhibicijski potencial vrst Turkish Cistus na AGE. Poleg tega so bili salidrozid, hiperozid in kvercitrin označeni kot markerski flavonoidi, spremembe v njihovih koncentracijah pa so bile spremljane v postopku prebave in vitro. Medtem ko so postopki prebave v prebavilih negativno vplivali na vsebnost fenolov ter antidiabetično in antioksidativno delovanje izvlečkov, so še vedno pokazali pomembno bioaktivnost. Glede na rezultate je bil ekstrakt C. salviifolius odkrit kot najmočnejša rastlina v smislu vsebnosti fenolov ter antioksidativnega in antidiabetičnega delovanja. Skratka, nadzemni deli turške vrste Cistus imajo bogato vsebnost fenolov ter potencialne antioksidativne in antidiabetične aktivnosti. Medtem ko je bila za oceno biološke uporabnosti uporabljena metoda simulacije prebave in vitro, morda ne bo v celoti posnemala presnovnih poti, ki potekajo v organizmu. Zato so potrebne nadaljnje in vivo in klinične študije za natančno oceno biološke uporabnosti fenolnih spojin in njihovega prispevka k poročanim farmakološkim učinkom.

Avtorski prispevki:Konceptualizacija, YI, EC, EY; metodologija, YI, SA, IK, EC formalna analiza, YI, IK.-C., SA; preiskava, YI, IK.-C, SA; viri, YI, IK.SA, EC in EY; obdelava podatkov, YI, IK-C., SA; pisanje-—YI, pisanje—pregledovanje in urejanje, YI, EC, EY; vizualizacija, YI; nadzor, EC in EY Vsi avtorji so prebrali in se strinjali z objavljeno različico rokopisa.

Financiranje:Ta raziskava ni prejela zunanjega financiranja. Izjava institucionalnega nadzornega odbora: Ni primerno. Izjava o informiranem soglasju: Ni primerno.

Izjava o razpoložljivosti podatkov:Podatki, predstavljeni v tej študiji, so na voljo na zahtevo ustreznega avtorja.

Nasprotja interesov:Avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov.

Razpoložljivost vzorcev:Vzorci spojin niso na voljo pri avtorjih.

Ta članek je izvleček iz Molecules 2021, 26, 5322. https://doi.org/10.3390/molecules26175322 https://www.mdpi.com/journal/molecules