1. DEL Akteozid zavira osteoklastogenezo, ki jo posreduje RANKL, z zaviranjem indukcije C-Fos in poti NF-KB ter zmanjšanjem proizvodnje ROS

Seung-Youp Lee^1,2., Keun-Soo Lee^3.¤, Sea Hyun Yi^2., Sung-Ho Kook², Jeong-Chae Lee^2,3*

1 Raziskovalni inštitut za klinično medicino Nacionalne univerze Chonbuk, Biomedicinski raziskovalni inštitut Nacionalne univerzitetne bolnišnice Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Južna Koreja, 2 Oddelek za ortodontijo, Inštitut za oralne bioznanosti in Šola za zobozdravstvo, Nacionalna univerza Chonbuk, Jeonju, Chonbuk, Južna Koreja, 3 Department of Bioactive Material Sciences, Research Center of Bioactive Materials, Chonbuk National University, Jeonju, Chonbuk, Južna Koreja

Povzetek

Številne študije so poročale, da so vnetni citokini pomembni mediatorji za osteoklastogenezo, s čimer povzročajo prekomerno resorpcijo kosti in osteoporozo.Akteozid, glavna aktivna spojinaRehmannia glutinosa, ki se pogosto uporablja v tradicionalni orientalski medicini, ima protivnetni in antioksidativni potencial. V tej študiji smo ugotovili, daakteozidizrazito zaviral diferenciacijo in tvorbo osteoklastov iz makrofagov kostnega mozga (BMM) in makrofagov RAW264.7, ki jih stimulira receptorski aktivator liganda jedrnega faktorja kapaB (NF-kB) (RANKL). Predhodna obdelava z akteozidom je tudi preprečila resorpcijo kosti s strani zrelih osteoklastov na način, odvisen od odmerka.Akteozid(10 mM) je oslabil z RANKL stimulirano aktivacijo p38 kinaze, kinaz, reguliranih z zunajceličnim signalom, in c-Jun N-terminalne kinaze ter tudi zavrl aktivacijo NF-kB z zaviranjem fosforilacije podenote p65 in zaviralca kBa. Poleg tega se z RANKL posreduje povečanje izražanja c-Fos in jedrskega faktorja aktiviranih T-celic, citoplazmatskih 1 (NFATc1), ter v nastajanju faktorja tumorske nekroze-a, interlevkina (IL)-1b , in IL-6 je očitno zaviralo predhodno zdravljenje z akteozidom. Nadalje, ustnoakteozidzmanjšana z ovariektomijo povzročena izguba kosti in vnetna proizvodnja citokinov na nadzorovane ravni. Naši podatki kažejo na toakteozidzavira diferenciacijo in zorenje osteoklastov iz osteoklastičnih prekurzorjev z zaviranjem aktivacije protein kinaz, aktiviranih z mitogenom, in transkripcijskih faktorjev, kot so NF-kB, c-Fos in NFATc1, ki jih povzroči RANKL. Skupaj ti rezultati kažejo na toakteozidlahko deluje kot antiresorpcijsko sredstvo za zmanjšanje izgube kosti z blokiranjem aktivacije osteoklastov.

Za več informacij se obrnite na:emily.li@wecistanche.com

Uvod

Kost se nenehno preoblikuje z uravnoteženo aktivnostjo osteoklastov in osteoblastov [1]. Osteoklasti izhajajo iz hematopoetskih prekurzorskih celic monocitne/makrofagne linije, medtem ko so osteoblasti mezenhimske linije [2]. Nenormalna aktivacija osteoklastov ali zmanjšana osteoblastogeneza lahko poruši homeostazo kosti, kar sčasoma povzroči bolezni, kot so osteoporoza, artritis in kostni rak [3,4]. Osteoporoza je pogosta bolezen kosti, ki vodi do povečanega tveganja za zlome. Najpogostejša oblika osteoporoze je posledica pomanjkanja estrogena pri ženskah v menopavzi. Tudi zdravila, kot so kortikosteroidi in antiepileptiki, lahko povzročijo neravnovesje med resorpcijo in tvorbo kosti, kar lahko povzroči osteoporozo [5]. Za zdravljenje osteoporoze so bili uporabljeni številni antiresorpcijski inhibitorji, vključno z bisfosfonati, kalcitoninom, estrogenom in selektivnimi modulatorji estrogenskih receptorjev. Ti zaviralci ohranjajo kostno maso z zaviranjem delovanja osteoklastov [6]. Estrogensko nadomestno zdravljenje je najbolj priljubljeno zdravljenje za preprečevanje in zdravljenje osteoporoze po menopavzi. Vendar lahko dolgotrajno nadomestno zdravljenje z estrogenom poveča tveganje za raka endometrija in dojke. Zato so številni raziskovalci svoja prizadevanja usmerili v razvoj novega antiresorpcijskega sredstva, ki nima stranskih učinkov [7–10]. Ker osteoklasti delujejo pri resorpciji kosti, je bilo specifično zaviranje osteoklastov glavno tarčo v številnih študijah. Osteoklasti so večjedrne velikanske celice, ki jih tvorijo mononuklearni predniki iz družine monocitov/makrofagov s sekvenčno proliferacijo, diferenciacijo in fuzijo hematopoetskih prekurzorskih celic [11]. Faktor, ki spodbuja kolonije makrofagov (M-CSF) in receptorski aktivator liganda jedrnega faktorja (NF)-kB (RANK) (RANKL) sta bistvena dejavnika za diferenciacijo osteoklastov [12]. Poleg tega več vnetnih citokinov, kot sta faktor tumorske nekroze (TNF) in interlevkin (IL)-1b, prispeva k osteoklastogenezi z moduliranjem indukcije RANKL, osteoprotegerina in M-CSF [7,13]. Vezava RANKL na receptor RANK na celični površini povzroči RANKL/RANK/TNFR

kompleksov povezanih faktorjev (TRAF), ki zaporedno aktivirajo NFkB in z mitogenom aktivirane proteinske kinaze (MAPK), vključno s cJun N-terminalno kinazo (JNK), p38 kinazo in zunajcelično signalno povezano kinazo (ERK) [14]. Ta aktivacija ima ključno vlogo pri posredovanju diferenciacije, aktivacije in preživetja osteoklastov. RANKL aktivira tudi izražanje transkripcijskih faktorjev, kot so jedrski faktor aktiviranih T-celic, citoplazemski 1 (NFATc1) in -Fos, ki so bistveni za razvoj osteoklastov [ 7,9]. Zato se signalizacija RANKL šteje za glavno tarčo antiresorpcijskih sredstev, ki zavirajo aktivacijo osteoklastov in so brez kosti.Akteozidje glavna aktivna spojina Rehmannia glutinosa, ki se pogosto uporablja v tradicionalni orientalski medicini [15,16].Akteozidje močan antioksidant in ima antihepatotoksično, protivnetno in antinociceptivno delovanje [17–20]. To smo že prej ugotoviliakteozidzmanjša aktivnost tirozinaze in biosintezo melanina z uravnavanjem signalizacije ERK [21], ščiti pred poškodbami dlesni, ki jih povzročajo reaktivne kisikove vrste (ROS) [22], in zavira poškodbe celic, ki jih povzročajo mikotoksini [23]. Ti učinki so tesno povezani zakteozidzmožnost odstranitve ROS in uravnavanja signalizacije, posredovane z MAPK. Zlasti se predlaga, da ROS posredujejo signalne poti, ki jih povzroča RANKL, in celične dogodke v osteoklastih. Predhodna obdelava z antioksidanti je zavrla aktivacijo NF-kB, ERK in IkBa, ki jo povzroča RANKL, in s tem zavira osteoklastogenezo [24]. Te ugotovitve so močno nakazovale, da je poleg protivnetnega delovanja antioksidativno delovanje ključnega pomena za antiresorpcijsko sredstvo, torejakteozidlahko zavre osteoklastogenezo, ki jo povzroči RANKL. V tej študiji smo raziskali, aliakteozidima terapevtski učinek na izgubo kostne mase. Preučili smo učinkeakteozido diferenciaciji osteoklastov in resorpciji kosti ter s tem povezanih celičnih mehanizmih z uporabo eksperimentalnih sistemov in vitro in in vivo.

akteozid

Materiali in metode

Etična izjava

Prakse oskrbe in uporabe živali je odobril Odbor nacionalne univerze Chonbuk za etiko pri oskrbi in uporabi laboratorijskih živali (dovoljenje št. CBU 2010-0007). Vsi poskusi v tej študiji so bili izvedeni v skladu s smernicami odbora za nego in uporabo živali Univerze.

Miši, kemikalije in laboratorijski izdelki

Štiri tedne stare samice miši ICR so bile kupljene pri OrientBio Inc. (Seul, Koreja) in nameščene pri 2261 °C in 5565-odstotni vlažnosti v 12-urnem ciklu svetloba/tema s prostim dostopom do hrane in vode. Akteozid (3,4-dihidroksi-b-fenetil-Oa-ramnopiranoza syl-(1R3)-4-O-kafeoil-bD-glukopiranozid; C29H36O15) (slika S1) je bil izoliran iz listov Rehmannia glutinosa. Akteozid smo pred uporabo raztopili v fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (PBS). RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 in M-CSF so bili kupljeni pri sistemih za raziskave in razvoj (Minneapolis, MN, ZDA). Protitelesa, specifična za c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa in b-aktin, so bila pridobljena pri Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, ZDA). ). Protitelesa za p-p38 in p38 so bila kupljena pri Cell Signaling Technology (Danvers, MA, ZDA). Kompleti CalciumAssay in Osteocalcin (OC) EIA so bili kupljeni pri BioAssay Systems (Hayward, CA, ZDA) oziroma Biomedical Technologies (Stoughton, MA, ZDA) za določitev biokemičnih parametrov seruma. Za merjenje ravni TRAP5b v serumu je bil uporabljen tudi testni komplet mišje kisle fosfataze (TRAP), odporne na tartrat (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, ZDA). Če ni drugače navedeno, so bile dodatne kemikalije pridobljene od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, ZDA), laboratorijski izdelki pa od SPL Life Sciences (Pochun, Južna Koreja).

Celične kulture

Celice kostnega mozga so bile pridobljene iz golenice in stegnenice 6 tednov starih samic miši ICR v skladu z metodami, opisanimi prej [25]. Suspenzijo kostnega mozga smo inkubirali v posodi s 100- mm kulturo v prisotnosti 50 ng/ml M-CSF. Po 3 dneh so bile adherentne celice uporabljene kot makrofagi kostnega mozga (BMM) za induciranje osteoklastične diferenciacije. Nekatere celice kostnega mozga so bile tudi inkubirane 48 ur brez M-CSF, adherentne celice pa so bile gojene v mediju za diferenciacijo osteoblastov, kot je opisano drugje [25]. Celice makrofagov RAW264.7 smo gojili v Dulbeccovem modificiranem Eagleovem mediju (DMEM), dopolnjenem z 10 odstotki fetalnega govejega seruma (FBS), 2 mM L glutamina in antibiotikov. Te celice so bile uporabljene kot nasprotna celična linija za BMM za raziskovanje učinka akteozida na osteoklastogenezo.

Osteoklastična diferenciacija in barvanje s TRAP

BMM so bili predhodno obdelani z različnimi koncentracijami (0–50 mM) akteozida 2 uri pred stimulacijo s 100 ng/ml RANKL. Gojišča smo 2. in 5. dan zamenjali s svežimi gojišči. Po 7 dneh inkubacije smo kulture fiksirali v 4-odstotnem PBS-pufranem paraformaldehidu in obarvali s TRAP z uporabo kompleta sigma Aldrich v skladu z navodili proizvajalca. TRAP-pozitivne celice so bile preštete z optično mikroskopijo in celice, ki so vsebovale 3 ali več jeder, so veljale za osteoklaste. Celice RAW 264.7 so bile prav tako izpostavljene 100 ng/ml RANKL po predhodnem zdravljenju z akteozidom za 2 uri in po 7 dneh inkubacije, celice smo obdelali za barvanje s TRAP.

Merjenje viabilnosti celic

Viabilnost celic je bila določena z reagentom vodotopne tetrazolijeve soli (WST)-8. Na kratko, celice BMM ali RAW264.7, gojene v rastnem mediju, ki je vseboval 10 odstotkov FBS in antibiotike, smo obdelali z 10 mM akteozida ali fenolnimi spojinami, kot so kvercetin, luteolin, apigenin ali epigalokatehin-3-galat (EGCG). Reagent WST-8 je bil dodan kulturam po 48 urah inkubacije. Po dodatnih 4 urah inkubacije je bila izmerjena WST-8-specifična absorbanca pri 450 nm z uporabo bralnika mikroplošč (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, ZDA).

Test resorpcije kosti

BMM (16105 celic/ml) smo suspendirali v a-MEM, ki je vseboval 50 ng/ml M-CSF in 100 ng/ml RANKL, nato pa jih razdelili na ploščo z vdolbinicami, prevlečeno z nanokristali kalcijevega fosfata (OAAS{{6} }; substrat za testiranje osteoklastne aktivnosti, Oscotec Inc., Choongnam, Južna Koreja) pri gostoti 26104 celic/cm2 z akteozidom in brez njega. Po 7-dnevni inkubaciji smo celice odstranili s plošč s 5-odstotnim natrijevim hipokloritom in pod optičnim mikroskopom opazili nastanek jamic. Resorbirano površino smo prav tako izmerili z analizatorjem slike in jo izrazili kot odstotek kontrolne vrednosti.

Western blot analiza

Lizati celih beljakovin so bili pripravljeni v pufru za lizo, kot je opisano drugje [26]. Citosolne in jedrske beljakovine smo pripravili, kot je opisano prej [25]. Enake količine beljakovinskega ekstrakta so bile ločene z 12–15 odstotki SDS-PAGE in popivnane na polivinil difluoridne membrane. Blote so testirali s primarnimi protitelesi čez noč pri 4 °C pred inkubacijo s sekundarnim protitelesom v pufru za blokiranje 1 uro. Bloti so bili razviti z izboljšano kemiluminiscenco (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK) in izpostavljeni rentgenskemu filmu (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, ZDA).

Test aktivnosti MAPK

Celice so bile predhodno obdelane z akteozidom 2 uri in nato stimulirane z RANKL še -30 min. Aktivnosti MAPK so bile določene z uporabo kompletov za imunometrične teste, kot je komplet za test p-p38kinaze (Assay Designs, Inc., MI, ZDA), komplet za encimski test p-ERK (Assay Designs) in komplet za sendvič ELISA p-SAPK/JNK ( Cell Signaling Technology, MA, ZDA). Vsi postopki so potekali po navodilih proizvajalca, absorbanca pa je bila izmerjena z čitalcem mikroplošč.

Preizkus elektroforetične mobilnosti (EMSA)

Reakcije vezave DNA na beljakovine so bile izvedene 30 min pri sobni temperaturi z 10–15 mg beljakovin v 20 ml pufra, ki je vseboval 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml poli (dI-dC), 5 odstotkov glicerola ,1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mm NaCl, 30,000 CPM [a-32P] dCTP-označenih oligonukleotidov in Klenow fragment DNA polimeraze. Vzorci so bili ločeni na 6 odstotnih poliakrilamidnih gelih, ki so bili posušeni in izpostavljeni rentgenskemu filmu (Eastman Kodak Co.) 12–24 ur pri 270 °C. Zaporedja oligonukleotidnih primerjev, specifičnih za NF, sta bila 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 in 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 }}.

Test NF-kB luciferaze

Makrofage RAW264.7 v 24-ploščah z jamicami smo transficirali z0.8 mg kB-luciferaze reporterskim vektorjem z uporabo 2 ml Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. 24 ur po transfekciji smo celice stimulirali z RANKL v prisotnosti in odsotnostiakteozidza 24 ur. Celice smo resuspendirali v 100 ml pufra za lizo reporterja (Promega, Madison, WI, ZDA). Enake količine vzorcev beljakovin smo dali v 96-mikroplošče z vdolbinicami in zmešali s substratom luciferaze. Luminescenco smo izmerili z uporabo mikroploščnega luminometra (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Nemčija). V tem poskusu je bil kot pozitivni inhibitor kB uporabljen permeabilni inhibitorni peptid NF-B (BIOMOL, Butler Pike, PA, ZDA).

Merjenje citokinov

Celice BMM ali RAW264.7 so bile stimulirane z RANKL v prisotnosti akteozida v 24-ploščih za kulture vdolbinic. Po 48 urah inkubacije smo zbrali supernatante kulture in ocenili z ELISA z uporabo kompletov OptEIATM, specifičnih za TNF-a-, IL-1b- in IL-6-, v skladu z navodili proizvajalca.

Povratna transkripcija v realnem času – verižna reakcija s polimerazo (RT-PCR)

Ekspresija mRNA osteoklastičnih markerjev, kot so c-Fos, NFATc1 in TNF-a, je bila določena z RT-PCR v realnem času. Na kratko, celotno RNA smo ekstrahirali iz makrofagov s Trizolreagentom po navodilih proizvajalca (Invitrogen). cDNA smo sintetizirali z 1 mg celotne RNA z uporabo SuperScriptReverse Transcriptase II in primerjev (Invitrogen). Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA) je bil uporabljen za odkrivanje kopičenja produkta PCR med cikliranjem s sistemom za odkrivanje zaporedja ABI 7500 (AppliedBiosystems). Po 10-minutni denaturaciji pri 95 °C smo izvedli PCR

Merjenje znotrajceličnega ROS

Osnovno raztopino 29,79-diklorodihidrofluorescein-diacetata (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Nemčija) smo pripravili v DMSO in shranili pri 220 °C v temi. Na kratko, BMM (106 celic/ml v 6-ploščah z jamicami) smo gojili s 50 ng/MLM-CSF 24 ur in nato obdelali z različnimi koncentracijami (0–10 mM) akteozida 2 uri pred stimulacijo s 100 ng/mlRANKL. Po 1 uri soinkubacije smo te celice nato 30 minut inkubirali s 25 mM DCFH-DA. Zelena fluorescenca 29,79-diklorofluoresceina (DCF) je bila zabeležena pri 515 nm (FL 1) s sistemom FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, ZDA) in 10,000 dogodkov so šteli na vzorec.

Indukcija osteoporoze, povzročene z ovariektomijo

Za to študijo so bile uporabljene samice miši ICR (stare 6 tednov). Miši so prejele lažno operacijo (Sham, n=10) ali kirurško ovariektomijo (OVX, n=20) pod anestezijo. En teden po operaciji so miši OVX naključno razdelili v 2 skupini po 10 miši: dvostranski OVX in dvostranski OVX, dopolnjen z 200 ml PBS, ki je vseboval 1 mM akteozid peroralno (skupina AC). Oralnoakteoziddajali enkrat vsake 3 dni 8 tednov po operaciji, enako količino PBS pa so dajali skupinama Sham in OVX. Po 1 dnevu zadnjega dajanja so miši žrtvovali in nato analizirali biokemične parametre v serumu in 3-dimenzionalno strukturo kosti.

Določanje biokemičnih parametrov seruma

Vzorce krvi smo zbrali s srčno punkcijo, serum pa s centrifugiranjem. Vzorci seruma so bili shranjeni pri 280 °C za analize biokemičnih parametrov. Serumske ravni IL-1b in IL-6 so bile ocenjene z uporabo kompleta ELISA, kot je opisano zgoraj, medtem ko je bila aktivnost alkalne fosfataze (ALP) določena z uporabo biokemičnega kolorimetričnega testa, ki meri količino p -nitrofenol, proizveden iz p-nitrofenol fosfatnega substrata, kot je opisano drugje [27]. Za oceno biomarkerjev tvorbe in resorpcije kosti so bile v skladu z navodili proizvajalca določene tudi serumske vrednosti OC, kalcija in TRAP5b.

Analize strukture kosti in morfometričnih parametrov

Femoro miši (skupine Sham, OVX in AC) smo razrezali in napolnili s fiziološko raztopino za mehansko testiranje. Mehanska trdnost stegnenice je bila izmerjena, kot je opisano drugje [28]. Zlomna obremenitev je bila zabeležena kot najvišja sila v newtonih na točki, ko se zlomi srednji del desne stegnenice. Poleg tega je bila lahka stegnenica vsake živali histomorfometrično analizirana z uporabo sistema za mikroračunalniško tomografijo (mikro-CT) (SkyScan 1076 microfocus X-ray system, Kontich, Belgija). Na kratko, kosti v 4-odstotnem skladišču formaldehida so bile površinsko posušene na papirnatem robčku, preden so jih zavili v plastično "oprijemljivo folijo" ali v parafilm, da se prepreči sušenje med skeniranjem. Vsaka kost, ovita s plastiko, je bila nameščena v cevi iz plastične/polistirenske pene, ki so bile nameščene navpično vodoravno v komori za vzorce skenerja 1076 za mikro-CT slikanje. Skeniranje je bilo izvedeno z izvorno napetostjo 100 kV in izvornim tokom 140 mA z ločljivostjo 35 mm. Tridimenzionalne modele trabekularnih kosti stegnenice smo rekonstruirali s pomočjo SkyScan CT Analyzer različice 1.11. Strukturni parametri, kot so trabekularna mineralna gostota kosti (BMD, g/cm3), odstotek kostnega volumna (kostni volumen (BV)/tkivni volumen (TV), odstotek), debelina (Tb.Th, mm), ločitev (Tb.Sp , mm) in nato izmerili število (Tb.N, 1/mm).

Osteogena diferenciacija in test mineralizacije

Celice kostnega mozga, gojene v {{{{10}}}}ploščah za kulture vdolbinic, smo obdelali z DAG (10 nM deksametazona, 50 mM askorbinske kisline in 20 mM b-glicerofosfata) v prisotnosti 10 mM akteozida. Po 2 tednih diferenciacije smo celice fiksirali z ledeno mrzlim 70-odstotnim (vol/vol) etanolom 1 uro in obarvali z 0,2-odstotnim alizarin rdečim sin destilirano vodo 30 minut pri sobni temperaturi. Ko so bile celice razbarvane in posušene na zraku, so bile plošče celične kulture ovrednotene s svetlobno mikroskopijo z uporabo invertnega mikroskopa (Nikon TS100, Japonska). Za kvantificiranje količine rdečega barvila smo madež eluirali z 10-odstotnim acetil piridinijevim kloridom s stresanjem 20 minut in izmerili absorbanco pri 560 nm. Količina kalcija, odloženega v celičnih plasteh, je bila prav tako izmerjena z uporabo Calcium Kit (Wako Chemical Inc. Osaka, Japonska) v skladu z navodili proizvajalca. Poleg tega je bila ekspresija kostno specifičnih označevalcev mRNA, kot so z runtom povezani transkripcijski faktor-2(Runx2), osterix, kostni sialoprotein (BSP) in OC, določena z RT-PCR v realnem času. Oligonukleotidni primerji teh markerjev so bili zasnovani z velikostjo produkta manj kot 200 bp z uporabo programske opreme PrimerExpress 3.0 (Applied Biosystems), kot je opisano drugje [27].

Statistična analiza

Če ni drugače navedeno, so vsi podatki izraženi kot povprečje6 standardnega odklona (SD) 3 ali več neodvisnih poskusov. Enosmerna ANOVA je bila uporabljena za več primerjav z uporabo programske opreme SPSS različice 12.0. P-vrednost 0.05 je veljala za statistično pomembno.

Rezultati

Akteozid zavira tvorbo osteoklastov z makrofagi na način, ki je odvisen od odmerka

Da bi preverili učinek akteozida na diferenciacijo BMM v osteoklaste, smo celice gojili z različnimi koncentracijami (0–20 mM) akteozida 7 dni v prisotnosti 50 ng/ml M CSF in 100 ng/ml RANKL . Akteozid je zmanjšal število osteoklastov na način, ki je bil odvisen od odmerka. Ko so bile celice predhodno obdelane z 10 mM akteozidom 2 uri, se je število osteoklastov zmanjšalo za 43 odstotkov v primerjavi s celicami, dopolnjenimi z M-CSF in RANKL (slika 1A). Slika 1B prikazuje diferenciacijo osteoklastov, ki jo posreduje RANKL, in njeno inhibicijo s kombiniranim zdravljenjem z akteozidom. V skladu s tem rezultatom je predhodna obdelava z akteozidom zmanjšala diferenciacijo celic RAW264.7, stimulirano z RANKL, in tvorbo osteoklastov (sliki 1C in D). Ko so anti-osteoklastni potencial akteozida na BMM primerjali z anti-osteoklastnimi potenciali več fenolnih spojin pri isti koncentraciji (10 mM), je luteolin pokazal največjo aktivnost (slika 2A). Vendar pa so luteolin, kvercetin ali apigenin sami zmanjšali sposobnost preživetja celic (slika 2B). Vse spojine so zavirale osteoklastično diferenciacijo z makrofagi RAW264.7 z naslednjimi relativnimi aktivnostmi: luteolin. kvercetin=apigenin .EGCG=akteozid (slika 2C). Tudi luteolin, kvercetin ali apigenin so pokazali zmanjšano sposobnost preživetja celic (slika 2D). Nasprotno pa je zdravljenje s kvercetinom povzročilo le znatno zmanjšanje sposobnosti preživetja v celicah BMM in RAW264.7, ko so bile te celice 2 dni izpostavljene 10 mM vsake spojine s 50 ng/ml M-CSF, 100 ng/ml RANKL, ali oboje (podatki niso prikazani). Kadar je potrebna koncentracija teh spojin za zaviranje 50 odstotkov

tvorba osteoklastov v BMM (IC50) je bila izračunana z uporabo krivulj koncentracija-aktivnost, IC50 akteozida, kvercetina, luteolina, apigenina in EGCG je bil 5,1, 2,3, 2,6, 4,8 oziroma 6,6 mM (slika 2E). Ta rezultat je bil podoben primeru, ko so pregledali makrofage RAW264.7. Ti podatki kažejo, da imata luteolin in kvercetin večjo antiklastogeno aktivnost kot akteozid. V nasprotju s tem je imel kvercetin pri IC50 tudi blag toksičen učinek na celice (podatki niso prikazani).

AkteozidZavira resorpcijo kosti s strani makrofagov Akteozid je tudi preprečil resorpcijo kosti, ki jo posreduje RANKL, na način, ki je odvisen od odmerka, kar je bilo izmerjeno z modelnim sistemom in vitro (slika 3A). Resorpcija kosti je bila znatno zavrta, ko so bili BMM inkubirani z 1 mM akteozida (slika 3B). Zdravljenje z 10 mM akteozidom je skoraj popolnoma oslabilo tvorbo jam, ki jo povzroči RANKL, z BMM. Podobno je akteozid zmanjšal resorpcijo kosti v RANKL-stimuliranih celicah RAW264.7 (sliki S2A in B). Sposobnostakteozidza zaviranje resorpcije kosti je bilo odvisno od časa zdravljenja glede na stimulacijo RANKL. Akteozid (10 mM), dodan 4 dni po stimulaciji RANKL, ni zmanjšal tvorbe jamic v BMM, medtem ko je zmanjšal število nastalih osteoklastov (slika 3C). Ta drugačen rezultat je bil delno posledica območja jamice, ki je že nastalo po 4 dneh po nastanku stimulacije RANKL (slika 3D).

AkteozidNavzdol regulira zgodnje signalne poti RANKL

RANKL inducira aktivacijo 3 dobro znanih MAPK in NF-kB v prekurzorjih osteoklastov in ta aktivacija je potrebna za zgodnjo diferenciacijo osteoklastov. Da bi razumeli možne mehanizme, s katerimi akteozid zavira osteoklastogenezo, smo raziskali učinek akteozida na MAPK in aktivacijo NF-B v makrofagih. BMM in celice RAW264.7 so bile 2 uri predhodno obdelane z 10 mM akteozida in nato 30 minut stimulirane s 100 ng/ml RANKL. Fosforilacijo MAPK smo pregledali z Western blottingom in imunometrično analizo. RANKL je povzročil fosforilacijo p38, ERK in JNK v BMM (slika 4A) in celicah RAW264.7 (slika 4B). Akteozid je preprečil ta z RANKL povzročena povečanja p-p38, p-ERK in p-JNK. Ta rezultat je bil podprt z imunometrično analizo, ki kaže, da je predhodno zdravljenje z 10 mM akteozidom znatno zaviralo ravni fosforiliranih MAPK v teh makrofagih (slika 4C). Zdravljenje z RANKL je povečalo vezavo NF-kB na DNA, medtem ko je akteozid zaviral z RANKL inducirano aktivacijo vezave NF-kB-DNA (slika 5A). Ta inhibicija je bila bolj izrazita v BMM kot v celicah RAW264.7. Akteozid je tudi zmanjšal fosforilacijo p65 in IkBa, stimulirano z RANKL, v celicah BMM in RAW264.7 (sliki 5B in C). Dodajanje 10 mMakteozida je skoraj popolnoma zaviralo razgradnjo in aktivacijo IkBa v BMM (slika 5B). Za nadaljnjo potrditev, da je aktivacija NF kB vključena v delovanje akteozida, so bili konstrukti promotorja kB kB začasno transficirani v celice RAW264.7. Celice, inkubirane s 100 ng/ml RANKL, so imele 3--krat večjo kB promotorsko aktivnost, ki je bila znatno oslabljena z 10 mM akteozidom (slika 5D).

Akteozid zavira nastajanje vnetnih citokinov in izražanje TNF-a, c-Fos in NFATc1 v makrofagih, stimuliranih z RANKL

TNF-a, IL-1b in IL-6 so pomembni pri tvorbi in delovanju osteoklastov, kar je posredovano s signalizacijo NF-kB v makrofagih, stimuliranih z RANKL. RANKL je spodbudil proizvodnjo teh citokinov in ta proizvodnja je bila opazno zmanjšana s predobdelavo z 10 mM akteozida v BMM (slika 6A). Podobno je akteozid oslabil RANKL-inducirano proizvodnjo citokinov, razen IL-6, v makrofagih RAW264.7 (slika S3). Da bi razumeli molekularne mehanizme delovanja akteozida pri osteoklastogenezi, smo nadalje preučili učinek akteozida na izražanje TNF-a, c-Fos in NFATc1. RANKL je navzgor reguliral izražanje mRNA teh dejavnikov v celicah BMM in RAW264.7 (sliki 6B in C). Predhodna obdelava z 10 mM akteozidom je pomembno zavirala izražanje teh dejavnikov, ki ga povzroča RANKL, pri obeh

BMM in celice RAW264.7. Predhodna obdelava z akteozidom je tudi močno zmanjšala ravni beljakovin c-Fos in NFATc1 v BMM, stimuliranih z RANKL (slika 6D). Ti rezultati kažejo na toakteozidzniža RANKL, ki inducira mediatorje tvorbe osteoklastov na ravni genov in beljakovin.

Akteozid zmanjša znotrajcelično nastajanje ROS v BMM na način, ki je odvisen od odmerka

Ker je znano, da je intracelularna proizvodnja ROS povezana z osteoklastogenezo, ki jo spodbuja RANKL, smo raziskali, ali akteozid zavira proizvodnjo ROS med diferenciacijo osteoklastov, ki jo posreduje RANKL, z uporabo celično prepustnega in na oksidacijo občutljivega barvila DCFH-DA. Analiza s pretočno citometrijo je pokazala, da je bil srednji fluorescenčni signal, specifičen za DCF v BMM, po stimulaciji z RANKL očitno premaknjen v desno v primerjavi z neobdelanimi kontrolnimi celicami (slika 7A). Ta premik je bil podoben primeru, ko so opazili makrofage RAW264.7 po stimulaciji RANKL (podatki niso prikazani). Zdravljenje BMM z akteozidom je zmanjšalo intenziteto signala DCF na način, ki je odvisen od odmerka. Predhodna obdelava z 10 mM akteozidom je skoraj popolnoma zmanjšala ravni intracelularnih ROS, proizvedenih med diferenciacijo osteoklastov, na neobdelane kontrolne ravni (slika 7B).

Peroralna uporaba akteozida zavira spremembo biokemičnih markerjev osteoporoze in izgubo kosti pri miših z ovariektomijo

Da bi raziskali učinek akteozida na izgubo kosti, smo z ovariektomijo pripravili osteoporotični živalski model. Med poskusnim obdobjem ni bilo pomembne razlike v telesni teži med OVX in Shammice (podatki niso prikazani). Skupina je imela bistveno višje serumske ravni IL-1b in IL-6 kot skupina Sham (slika 8). Povečanja teh vnetnih citokinov, povzročena z ovariektomijo, so bila oslabljena s peroralnim dajanjem akteozida (skupina AC). Serumske ravni markerjev kostne pregradnje, kot so ALP, kalcij, TRAP5b in OC, so bile v skupini OVX znatno povečane. Od teh markerjev osteoporoze so bile zvišane ravni kalcija, TRAP5b in OC pri miših OVX očitno zavirane z zdravljenjem z akteozidom, medtem ko serumska raven ALP z zdravljenjem ni bila spremenjena. Povprečna največja obremenitev zloma na sredini stebla desne stegnenice je bila znatno nižja v skupini OVX kot v skupini Sham (slika 9A). Zdravljenje z akteozidom je povečalo največjo rezervo zlomov na tisto v skupini Sham. Ko je bila kortikalna kost stegnenice secirana in opazovana z optično mikroskopijo, so osteoporotične značilnosti, prikazane v skupini OVX, skoraj popolnoma izginile pri AC miših (slika 9B). Da bi preverili učinek akteozida na model osteoporoze, povzročene z OVX, so bili MKG in morfološki parametri kosti v trabekuli svetle proksimalne stegnenice analizirani z mikro-CT. Kot je prikazano na sliki 9C, je bila pri miših OVX ugotovljena sprememba femoralne trabekularne arhitekture, medtem ko je bila ta sprememba zmanjšana z zdravljenjem z akteozidom. Rezultati mikro-CT analize so pokazali, da je bila MKG, merilo trdnosti kosti, dramatično zmanjšana pri miših OVX (slika 9D). V primerjavi s skupino Sham so miši OVX pokazale tudi pomembne spremembe v BV/TV, Tb. Sp in Tb. N, vendar ne Tb.Th. Peroralno zdravljenje z akteozidom miši OVX je pomembno preprečilo spremembo BMD, kot tudi BV/TV in Tb.N.