DEL 1 Cistanche Deserticola Polysaccharide zavira izgubo kosti, ki jo povzroči OVX, pri miših in osteoklastogenezi, ki jo povzroči RANKL

1. Uvod

Osteoporoza – bolezen, za katere je značilna zmanjšana kostna masa, Abnormalna mikrostruktura kostno tkivo, povečana krhkost kostiju i fraktura (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli, & Ginaldi, 2006)— trenutno prizadene več od 200 milliona ljudi u svetu i predstavlja znatno medicinsko i socioekonomsko breme za moderno društvo (Strom et al., 2011). Klinično zdravljenje osteoporoze se osredotoča predvsem na hormonsko zamenjavo, bisfosfonat ali zdravljenje z denosumabom. Te metode so učinkovite, vendar predstavljajo dolgoročne neželene učinke, kot so potencialno tveganje za raka dojk in netipične zlome stegnenice (Black, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof- Bauer, 2011). Zato je nujno treba raziskati zdravila, ki ne morejo le zaviratiOsteoporozavendar imajo tudi manj neželenih neželenih učinkov.

Cistanche deserticola(CD), tonik in zdravilna hrana, ki se pogosto uporablja na Kitajskem, znana kot "puščavski ginseng", je posušeno sočni steb z lestvico listC. deserticolaYC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) in ima raznolike in učinkoviteFarmakološkeDejavnosti, kot so imunska ureditev, anti-oksidacija inOsteoporoza(Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). Prejšnje študije o zdravilnih učinkovinah CD o zdravljenju osteoporoze so bilefenilethanoidGlikozidi(Li, Jiang, & Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, & Ma, 2017). Vendar cd vsebuje tudi druge učinkovite sestavine, kot so iridoidi,polisaharidi(Wang, Zhang, & Xie, 2012). Klinična uporaba tradicionalne kitajske medicine (TCM) je predvsem dekokiranje vode.Polysaccharidesso vodotopne sestavine in so najverjetneje glavne farmakodinamične sestavine TCM. Polysaccharides, ki so bili izvlečeni iz TCM, so podivjano poročali oOsteoporozaneželenih učinkov, ki so se na splošno uporabljali v ambulantah (npr. Polysaccharides extracted from Epimedium brevicornum (Zheng, He, Wu, Cai, & Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang, & Yan, 2018), i Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Zato smo predpostavkali, daCistanche deserticolapolisaharid(CDP), izvleček iz CD-ja je lahko potencialno varno zdravilo za zdravljenje osteoporoze.

Značilno je, da resorpcija kosti in tvorba kosti ohranjata dinamično ravnovesje med preurejanjem kosti v koordinaciji z več vrstami celic, vključno z osteoklasti, osteoblasti, celicami iz kostne obloge in osteociti (Kular, Tickner, Chim, & Xu, 2012). Prekinitev tega ravnovesja lahko povzroči različne bolezni kostne presnove, kot soOsteoporoza(Zhu et al., 2018) in osteoskleroza (Ihde et al., 2011). Osteoblasti, kot končne- razlikovanje celic, ki izhajajo iz mononuklearne/makrofažne linije, so edina celica s funkcijo resorpcije kosti (Teitelbaum, 2000). Obstajata dva ključna citokina, ki sodelujeta pri osteolastnem razlikovanju in zorenju (Koga et al., 2004): makrofažni faktor za spodbujanje kolonij (M-CSF) in receptorski aktivator jedrskih faktorjev κB (NF-κB) ligand (RANKL). M-CSF mediatira razlikovanje hematopoetičnih matičnih celic v osteoklasta progenitorje in spodbuja razlikovanje osteoklasta z upregulatingom izražanja RANK receptorja (Takayanagi, 2007). Vezava RANKL in RANK na površino osteolastnih celic ima naslednje rezultate: (1) novačenje molekul signalnega adapterja, kot je faktor 6 (TRAF6), povezanih s TNF receptorji; (2) aktiviranje več ciljev na koncu poti, vključno z NF- κB in proteinsko kinaze, aktivirane z mitogenom (MAPK); in (3) upregulacija izraženih ravni jedrskih faktorjev aktiviranih T-celic, citoplazma 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). Aktiviranje teh signalnih poti neposredno ureja izražanje osteolastnih genov, Vključno s fosfatazo 5 (Acp5) [kodiranje fosfataze od tartrata (TRAcP)], matriks metaloproteinaze 9 (MMP9) i katepsina K (CTSK) (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). Zato je inhibicija signalnih poti, povezanih z difereciacijo, ki jo povzroči RANKL, potencialna terapevtska metoda za osteoporozo.

V tej študiji smo si prizadevali ugotoviti učinke zdravljenja s CDP na ovariektomizirano (OVX)Osteoporozamišji model in vivo in na osteolastno aktivnost, ki jo in vitro povzroči RANKL, s poudarkom na izražanju genov specifičnih za osteolast in aktivaciji NFATc1 ter signalnih poti NF-κB in MAPKS. Naše ugotovitve lahko zagotovijo nove vpoglede v potencial CDP kot varnega in učinkovitega zdravila za zdravljenje osteoporoze.

Za več informacij se obrnite na:Joanna.jia@wecistanche.com

Polysaccharide Cistanche deserticola ima veliko učinkov v osteoporozi, kliknite tukaj, da veste več

2. Materiali in metode

2.1 Kemikalije in zbiranje vzorcev

CD (št. 180801) je bil kupljen od Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co, Ltd. (Anhui, Kitajska) in identificiral profesor Haibo Huang iz Šole farmacevtskih znanosti, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, Kitajska. Tablete estradiola valerat so kupili pri zdravilu Bayer (Leverkusen, Severno-Porenje- Vestfalija, Nemčija). Alfa spremenjen minimalni bistveni medij

(α-MEM) in fetalnega govejega seruma (FBS) sta bila pridobljena iz gibca (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA). Penicilin/streptomicin in komplet za obojanje TRAcP sta bila pridobljena iz solarbio (Peking, Kitajska). Rekombinantna miška M-CSF in rekombinantna miška RANKL sta bili pro-ozdravljene za R&D sisteme (Minneapolis, MN, ZDA). Plošče, obložene s hidroksiapatiti, so bile kupljene pri Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, ZDA). Primarna protitelesa za NFATc1 in CTSK (Biotehnologija Santa Cruz, CA, ZDA); IκB-α, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK in P-JNK (Cell Signaling Technology, Dan- vers, MA, USA); in β -actin (CWBIO, Peking, Kitajska) je bila pridobljena. Drugi reagenti, uporabljeni v tej študiji, so bili analitičnega razreda, vodo pa je očistil milli-Q sistem za čiščenje vode (Millipore, Bedford, MA, ZDA).

2.2 Ekstrakcija CDP

Zgoščenka je bila zmleta do finega prahu in pomešana z naftnim eterom, da bi ga premagala. Trdni ostanki so bili zbrani s filtracijo in nato posušeni pri sobni temperaturi. Vpolisaharidiso bili ekstrahirani iz predhodno obdelanih vzorcev s 2 h vode, koncentrirani, obsedeni z dodajanje brezvodnega etanola v končno koncentracijo 80 % (v/ v), in shranjeni pri 4 h 24 h. Padavine so zbirali s centrifugacijo na 3000 vrt/min 20 min, raztopljeni v destilirano vodo in prečiščeni (odstranjevanje prostih beljakovin) z metodo Sevag (Zhao et al., 2019). Izterjanipolisaharidiso bili dializiran, posušen in shranjen do nadaljnje uporabe. Poleg tega so rezultati kemijske sestave pokazali, da je bila skupna vsebnost sladkorja, uronske kisline, sulfata in beljakovin v CDP 67,63 0,98 %, 21,05 0,49 %, 1,90 0,24 %, in 8,81 0,36 %.

Monosaharidne sestave in Fourier transformirajo infrardečo analizo CDP so bile prikazane v dopolnilni sl. 1 in 2.

2.3 Model osteoporoze, ki ga je povzročevala OVX

Vse poskuse na živalih je odobril Odbor za etiko živali univerze Guangzhou za kitajsko medicino (odobren SYXK 2019-0202). 36-tedensko žensko miška C57BL/6 je dobavljal Center za poskusne živali Univerze Kitajske medicine Guangzhou. Po alimatizaciji 1 teden je ena skupina miši dobila sham operacijo (skupina Sham), preostale miši pa so bile izpostavljene operaciji ovariektomije (skupina OVX). Po operaciji so si miši dovolili okrevanje 1-tedensko. Nato so bile miši uspešno po vzoru naključno razdeljene v 5 skupin, s 6 mišmi na skupino:

(1) Skupina sham: obdelana z destilirano vodo, (2) skupina OVX: obdelana z destilirano vodo, (3) OVX E2 skupina (E2): treated with 0,13 mg/kg estradiol valerate tableta, (4) OVX CDP niska doza skupine (CDP-L): treated with 300 mg/kg CDP, (5) OVX CDP high dose group (CDP- H): treated with 600 mg/kg CDP. Destilirano vodo, E2 ali CDP so dajali s gavažo enkrat na dan. Vse miši so bile po 12-tedenskem obdobju zdravljenja žrtvovale (slika 1A). Zbrane in tehtane so bile tudi uteruses, leve tibije pa za nadaljnje preglede. Vzorci celotne krvi so bili zbrani in centrifugirana na 5000 vrt/min za

15 min ob 4 .C. Supernanati v serumu so bili aspirati in shranjeni v

—80 .C do nadaljnje analize.

2.4 Analiza mikro-izračunane tomografije (mikro-CT) in histomorfometrija kosti

Leve tibije so bile 4% paraformaldehida fiksne 48 h in nato dane v centrifugne cevi, ki vsebujejo normalno raztopine. Fiksni vzorci so bili skenirani z instrumentom Skyscan 1172 micro-CT (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgija) z uporabo naslednjih nastavitev: napetost, 80 kV; vira, 100 μA; Al, 0,5 mm filter; piksel

velikost, 9,76 μm; in korak vrtenja, 0.6... Več parametrov

trabekularna kost, vključno z mineralno gostoto kosti (BMD), prostorninsko frakcijo kosti (BV/TV), površino kosti na skupno prostornino (BS/TV), trabekularno številko (Tb. N) in trabekularni razmik (Tb. Sp) so merili s programsko opremo CT- Analizator® (Bruker micro-CT, Skyscan). Tridimenzionalne slike so bile ustvarjene z uporabo programske opreme CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan).

Po mikro-CT analizi so leve tibije dekalcificirane v 14% raztopini EDTA in vdelane v parafin za rezanje. Vzorci so bili narezani na 5 μm odsekov z mikrotomom pred hematoksilinom in eozinom (H&E) in trAcP preskusi oblivanja. Ojgani oddelki so bili pregledani in dokumentirani z uporabo mikroobmočja Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokio, Japonska).

Cistanchelahko poveča gostoto kosti in lajša osteoporozo

2.5 Analiza seruma

Koncentracije kalcija (Ca) in fosforja (P) so bile določene v skladu z navodili za komplet, ki ga je zasnoval Biotehnični inštitut Nanjing Jiancheng (Nanjing, Kitajska). Ravni TRAcP-5b in RANKL v serumu so bile analizirane s kompletom TRAcP-5b ELISA (CUSABIO, Wuhan, Kitajska) in RANKL ELISA kompletom (Cloud-CloneCorp., Wuhan, Kitajska).

2.6 In vitro osteoklastogeneza

BMM so bile izolirane od tibije in stegnenice 6-tedenskih samic C57BL/6 miši. Izolirane celice so bile kultivirane v mediju α-MEM, ki je vseboval 25 ng/ml M-CSF, 10% FBS in 1% penicilin/streptomicin. Po prihodu v sotočje so bili BMMs (1 104 celic/dobro) zasejani v 96-dobro ploščo in obdelani s CDP v prisotnosti 50 ng/mL RANKL. Medij in CDP sta bila nadomeščena vsake 2 dni. Po 7 dneh so bile celice fiksne s 4% paraformaldehidom in maženim za prisotnost TRAcP. Število osteoklastov, opredeljenih kot TRAcP- pozitivne celice s tremi ali več jedmi, je bilo prešteto in dokumentirani s pomočjo svetlobnega mikroskopa.

2.7. Proliferacija celic

BMM (1 × 104 celic/no) so bili sejani v plošči z 96 dobro in inkubatorji čez noč. Po tem so celice za 48 h zdravili z različnimi koncentracijami CDP (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 in 40 μg/ml). Sotočje celic je bilo odkrito in analizirano z uporabo IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, ZDA), dolgoročnega dinamičnega dinamičnega sistema slikanja celic v realnem času.

2.8. Hidroxyapatite resorption assay

BMM (1 104 celic/vodnjaki) so bili sesani v hidroksiapatitsko obloženi plošči, obdelani s CDP v indiciranih koncentracijah (0, 5 in 10 μg/ml) in so bili obdelani v celoti α-MEM, ki vsebuje 25 ng/mL M-CSF in 50 ng/ml RANKL. Po 7 dneh so celice umili z 10% raztopino belila, da so odstranili komponente celic. Slike območij resorpcije hidroksiapatita so bile posnete z uporabo incuCyte ZOOM® in analizirane z uporabo imageJ programske opreme (NIH, Bethesda, MD, USA) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003).

2.9 Analiza PCR (RT-qPCR) v realnem času

BMMs (1 105 celic/no) so bili sesani v 6-dobro ploščo in stimulirani z RANKL in M-CSF v prisotnosti CDP pri različnih koncentracijah (0, 5 in 10 μg/ml) 5 dni. Skupna RNK je bila izolirana iz celic ali kostnega tkivo miši z reagentom TRIzol (Sigma- Aldrich). Komplementarna DNK je bila sintetiizirana iz 2 μg skupne RNK z uporabo kompleta za povratno transkriptazo (TransGen Biotech, Peking, Kitajska). Reakcije RT-qPCR so bile pripravljene z uporabo PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) in jih je odkril sistem ABI 7500 (

Biosistemi, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, ZDA). Kolesarski parametri za PCR so bili določeni na naslednji način: 95 -C za 5 min, nato pa 40 ciklov po 95 -C za 15 s in 60 č za 30 s. Posebni primeri, ki se uporabljajo, so prikazani v tabeli 1, količina vsakega ciljnega gena pa je bila normalizirana na GAPDH (notranji nadzor).

2.10 Analiza zahodnega blota

BMMs (5 105 celic/no) so bili sejani v 6-dobro ploščo. Za kratke časovne poskuse so bile celice predhodno inkubirane z različnimi koncentracijami CDP (0, 5 in 10 μg/ml) za 1 h, nato pa so jih zdravili s 50 ng/ml RANKL 30 min. Dolgo časa so bile celice stimulirane s 50 ng/ml RANKL 3, 5 in 7 dni v prisotnosti CDP (0, 5 in 10 μg/ml). Skupne beljakovine so bile ekstrahljene z uporabo puferja za lyzo RIPA (CWBIO). Proteini so bili ločeni z 10% SDS-PAGE in preneseni na PVDF membrane. Membrane so bile blokirane s 5% posnetim mlekom pri sobni temperaturi 2 h, inkubatorno s primarno

protiteles čez noč pri 4 .C, nato pa z ustreznimi sekundarnimi

protitelesa za 1,5 h. Membrane so bile razvite z reagenti ECL (Millipore Corp., Billerica, MA, ZDA), slike pa so bile posnete z uporabo Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Shanghai, Kitajska).

Cistanchelahko poveča gostoto kosti

2.11. Odkrivanje translokacije NFATc1 z imunofluorescenčni preskus

BMM so bili sejani na odeje 12-dobro, stimulirani z RANKL in M-CSF, in zdravljeni z 10 μg/ml CDP 5 dni. Celice so bile 15 min fiksne s 4% paraformaldehidom, s PBS izpihanim trimeabiliziranim tritonom X-100 in permeabilizirane z 0,1% Triton X-100. Celice so zmešali z 10 % kozjega seruma (CWBIO) in inkubatorji 2 h. Nato so bile celice inkubatorne s primarnim protitelesom čez noč pri 4 .C in nato z Alexa Fluor 488 kozje proti mišjo sekundarno protitelo (Abcam, Cambridge, MA, ZDA) v temi za 1 h. Pokrovi so bili prani s PBS, nameščeni v Prolong Gold Antifade Reagent s 4′, 6-diamidino-2-fenil in-dole (DAPI) (Solar) in

z uporabo Zeiss LSM 800 z airyscan konfokalnim mikroskopom (Carl Zeiss, Oberkochen, Nemčija).

2.12 Statistična analiza

Vsi eksperimentalni podatki so bili analizirani s statistično programsko opremo SPSS 25.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, ZDA). Podatki za študije na živalih in celicah so izraženi kot ± SEM in ± SD. Rezultati so z enos smer analizo variance ali Študentov t-test. Vrednosti p< 0.05="" were="" considered="" statistically="">

Cistanchelahko zmanjšajoapoptozain povečati kostgostota