1. del Cistanches ublaži kognitivno disfunkcijo, ki jo povzroča sevofluran, z uravnavanjem PPAR- -odvisnega antioksidanta in protivnetnega delovanja pri podganah

Za več informacij se obrnite na:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola ima številne učinke, kliknite tukaj za več informacij

Povzetek

Namen te študije je bil raziskati zaščitne učinke in osnovne mehanizmecistanchena modelu podgan s starajočo kognitivno disfunkcijo, ki jo povzroča sevofluran. Stare (24 mesecev) podganje samce SD so naključno razporedili v štiri skupine: kontrolno skupino, skupino s sevofluranom, kontrolo plus cistanche in sevofluran pluscistancheskupina. Nato so bile ravni vnetnih citokinov izmerjene z ELISA, kognitivna disfunkcija podgan pa je bila ovrednotena s testom vodnega labirinta, testom odprtega polja in testom kondicioniranja strahu. Tri dni po anesteziji so podgane ubili in hipokampus pobrali za analizo relativnih biomolekul. Raven oksidativnega stresa je bila navedena kot koncentracija nitrita in MDA, skupaj z aktivnostjo SOD in CAT. Končno je bil uporabljen antagonist PPAR za raziskovanje mehanizmacistanchein vivo. Rezultati so pokazali, da so po vdihavanju sevoflurana 24-, vendar ne 3-mesečni samci podgan SD razvile očitne kognitivne motnje v vedenjskem testu 3 dni po anesteziji. Intraperitonealno injiciranjecistanchev odmerku 50 mg/kg 3 zaporedne dni pred anestezijo ublažil s sevofluranom povzročeno zvišanje ravni nevrovnetja in znatno oslabil od hipokampusa odvisne motnje spomina pri 24-mesečnih podganah.Cistanchetudi zmanjšal oksidativni stres z zmanjšanjem nitritov in MDA, medtem ko je povečal aktivnost SOD in CAT. Poleg tega je takšno zdravljenje zaviralo tudi aktivacijo mikroglije. Poleg tega smo dokazali, da inhibicija PPAR nasprotno ublažicistanche-induciran zaščitni učinek. Skupaj smo dokazali, da lahko cistanche izvaja antioksidativne, protivnetne, anti-apoptozne in anti-aktivacijske učinke mikroglije na razvoj s sevofluranom povzročene kognitivne disfunkcije z aktiviranjem signalizacije PPAR.

KLJUČNE BESEDE

cistanche, pooperativna kognitivna disfunkcija (POCD), PPAR- , sevofluran

Cistancheprehranska dopolnila krepijo imunost

1|UVOD

Pooperativna kognitivna disfunkcija (POCD) je uničujoč zaplet z dolgotrajnimi posledicami in je opredeljena kot okvara spomina, pozornosti, koncentracije in ravnanja z informacijami, ki se pojavi po operaciji in anesteziji. Raziskave so pokazale, da bo približno 10 odstotkov kirurških bolnikov in skoraj 40 odstotkov starejših bolnikov, starih 65 let ali celo več, doživelo POCD.1 Bolniki s POCD kažejo presenetljivo višjo umrljivost, zmanjšano kakovost življenja in večjo odvisnost od socialne varnosti v primerjavi z tisti brez POCD.2,3 Čeprav so bila v zadnjih desetletjih opravljena številna raziskovalna prizadevanja, ostaja patogeneza POCD večinoma neznana.

Dobro je znano, da imata nevrovnetje in oksidativni stres v možganih ključno vlogo pri nastanku in napredovanju POCD. 4,5 Čeprav lahko z operacijo povzročeno vnetje ali oksidativni stres povzroči nevrovnetje in poškodbe v možganih ter na koncu prispeva h kognitivnim motnjam nedavna poročila kažejo, da lahko anestetiki, uporabljeni med operacijo, sprožijo tudi kognitivno okvaro.3,6,7

Sevofluran se pogosto uporablja v klinični anesteziji za bolnike vseh starosti zaradi njegovega nizkega porazdelitvenega koeficienta krvnih plinov in nizke presnovne razgradnje.8 Vendar pa je več vrst dokazov pokazalo, da bi sevofluran lahko povzročil nevrovnetje in poslabšal kognitivno funkcijo. Makaryus je na primer poročal, da ima sevofluran nevrotoksične učinke na razvoj možganov.9 Pokazalo se je, da je zmanjšana povezljivost med ekscitatornimi nevroni v prefrontalnem korteksu povezana s kognitivnimi okvarami, ki jih povzroča sevofluran.10 Homoplastično sevofluran olajša kognitivni upad s poslabšanjem mikroglije -reguliranega nevrovnetja pri podganjem modelu prek znižanja aktivnosti PPAR- v hipokampusu.1 Ko je kirurška metoda določena, stopnje travme in vnetnega odziva ni mogoče spremeniti. Zato lahko zmanjšanje kognitivnih motenj z vidika anestezije postane izvedljiv pristop. Thecistanchevrste ('Rou Cong Rong' v kitajščini) se na Kitajskem že vrsto let uporablja kot tonik. Sodobne farmakološke študije so pokazale, da imajo cistanhe široke zdravilne funkcije, zlasti na centralnem živčnem sistemu (CNS), vključno z zaviranjem apoptoze, zaviranjem oksidacije, zaviranjem staranja, zaviranjem utrujenosti, imunomodulatornim protivnetnim delovanjem in nevroprotekcijo.{{5 }} Deng in drugi so ugotovili, da ima ehinakozid, ena glavnih aktivnih spojin cistanke, zaščitne učinke na apoptozo celic SH-SY5Y, ki jo povzroča TNF- -. fenolni hidroksil, lahko služi kot donor vodika reduktivnim radikalom in jih tako očisti. Obstajata dva glavna toka, po katerih secistancheslovijo proste radikale, in sicer neposredno sodelujejo pri odstranjevanju prostih radikalov ali blokirajo njihovo nastajanje in uravnavajo antioksidativne encime, povezane s presnovo prostih radikalov in vivo, kot so SOD, CAT in GPX.15 Dajanje Cistanches prispeva k upočasnitvi staranja fenotipov in lajšanje kognitivnega upada pri muhah z zmanjšanjem oksidativnega stresa.16 Zhang in drugi so na primer raziskali eno od ekstrakcij cistanč in potrdili njeno funkcijo podaljševanja življenjske dobe.17 Vendar do danes nobena študija ni preučila učinkov cistanč na kognitivne disfunkcijo na živalskih modelih ali ljudeh v pogojih sevoflurana.

Na podlagi zgornjih ugotovitev smo predlagali, dacistancheslahko zmanjša kognitivno okvaro, ki jo povzroči sevofluran. Da bi preverili to hipotezo, smo uporabili 24-mesečne SD podgane, da bi dobili model kognitivne okvare z vdihavanjem sevoflurana. Kasneje smo raziskali farmakološko funkcijocistanchesizvleček za protivnetno, antioksidacijsko in nevroprotekcijo. Raziskovali so tudi mehanizem delovanja cistančev na kognitivno okvaro, ki jo povzroča sevofluran.

2|MATERIALI IN METODE

2.1|Priprava izvlečka Cistanches Herba in standardizacija

Pridobivanjecistanchesje bilo v skladu s prejšnjimi deli.18,19 Na kratko,CistanchesIzvleček Herba smo ekstrahirali s 95-odstotnim etanolom v vodi in liofilizirali v prah. Ekstrakt pri 10 mg/ml smo uporabili pri kvantitativni kemijski analizi ehinakozida s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) z reverzno fazo. Standardna spojina, ehinakozid, je bila pridobljena iz Haoxuanbio (Xi'an, Shaanxi, Kitajska).

2.2|Podganji model kognitivne disfunkcije, ki jo povzroča sevofluran, in zdravljenje s cistanche

Samci podgan Sprague Dawley (SD), stari 3 in 24 mesecev, so bili kupljeni pri Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Podgane so bile vzrejene v čistih akrilnih kletkah s prostim dostopom do vode in hrane pod 12-urno svetlobo /temni cikel pri konstantni temperaturi 21 stopinj ± 1 stopinja in vlažnosti (45 odstotkov -65 odstotkov) 1 teden pred poskusom za namestitev. Postopke poskusov na živalih je odobril Odbor za nego živali Sedme ljudske bolnišnice Šanghajske univerze TCM. Vsi vedenjski testi so bili izvedeni v prostoru z nadzorovano temperaturo (21 stopinj ± 1 stopinja) in vlažnostjo (45 odstotkov -65 odstotkov).

V prvem nizu poskusov in vivo so bili uporabljeni 3- in 24-mesečni samci podgan SD. Šestnajst 3-mesečnih podgan, težkih 200- 250 g, in šestnajst 24-mesečnih podgan, težkih 240-300 g, je bilo naključno razporejenih v sevofluran (Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. , Lianyungang, Kitajska) ali nosilni plin (n=8 za vsako skupino). Živali v anestezijskih skupinah (SEVO) so bile podvržene 2,6-odstotni koncentraciji sevoflurana, dobavljenega z navlaženim 30-odstotnim nosilnim plinom O2, 4 ure pri pretoku 2 L/min z uporabo anestetičnega aparata z večplinskim monitorjem (Prisma SP Alpa, Oxon, Združeno kraljestvo). Podgane v kontrolni skupini so bile enak čas izpostavljene nosilnemu plinu brez sevoflurana.

za 4 ure (n=8 za vsako skupino). Vedenjski testi so bili izvedeni 1. in 3. dan po anesteziji. Nato so živali takoj po oceni vedenja tretji dan usmrtili, hipokampus v možganih pa uporabili za molekularne analize. V tretjem nizu poskusov so bile vse anestezirane podgane naključno razdeljene v štiri skupine (n=8 za vsako skupino): (a) skupina SEVO; (b) skupina SEVO plus GW9662 (antagonist PPAR-, 30 ng vsakič);

(c) SEVO pluscistancheskupina; in (d) SEVO pluscistancheplus skupina GW9662. Naslednji poskusi so bili podobni opisu v drugem nizu poskusov.

2,3|Vedenjsko testiranje

Morrisov test z vodnim labirintom je bil izveden, kot je opisano prej, z rahlo spremembo, da bi ocenili prostorski spomin in učne sposobnosti podgan v tej študiji. z dodajanjem nestrupene bele tempera barve. Temperaturo vode smo vzdrževali pri 22 ± 1 stopinji, da preprečimo lebdenje miške. Krožna ploščad za pobeg (polmer 11 cm) je bila postavljena 0.5-1 cm pod vodno gladino v enem od štirih kvadrantov. V treh časovnih točkah so podgane testirali na referenčni spomin po 5-dnevnem treningu in vsak preskusni del treninga je bil sestavljen iz štirih poskusov z intervalom 15 minut. Na drugi in tretji časovni točki je bila ploščad odstranjena iz bazena, nato pa je bila izvedena meritev prostorskega in delovnega spomina. Čas, ki ga je vsaka podgana porabila za iskanje platforme, je bil zabeležen kot zakasnitev pobega. Po poskusih so podgane dali v ogrevane kletke, preden so se vrnili v svojo kletko.

Preskus na odprtem polju je bil izveden 1. in 3. dan po anesteziji, kot so opisali Fricano et al21. Na kratko, podgane so testirali v kvadratni areni 27,5 cm × 27,5 cm. Sredina, 66 odstotkov dvorane, je bila označena kot "središče". Čas, porabljen v centru, je bil zabeležen kot parameter za oceno anksiolitičnega vedenja.

Test kondicioniranja strahu je bil izveden, kot je opisano prej, z rahlo spremembo, da bi raziskali prostorski spomin in učne sposobnosti podgan v tej študiji. 22, 23 Usposabljanje je bilo izvedeno en dan po anesteziji. Vsako podgano so pustili, da se je prilagodila komori 120 s, čemur je sledila izpostavljenost zvočnemu dražljaju (20 s, 80 dB) in nato električni šok noge (2 s, 0,75 mA) 25 s po zvoku dražljaj se je končal. Izpostavljenosti so bile ponovljene dvakrat, z intervali 60-s med drugo in tretjo osvetlitvijo. Kontekstni test je bil izveden drugi in tretji dan po operaciji. Vsako miško smo dali v isto komoro, ki je bila uporabljena za treniranje, čemur ni sledil noben dražljaj in šok za noge v istem intervalu, uporabljenem za treniranje živali. Rezultati so bili zabeleženi in zbran je bil odstotek časa zamrzovanja (brez premikanja).

2,4|Zbiranje tkiv

Po vedenjski analizi 3. dan po anesteziji so poskusne podgane usmrtili; nato so bila možganska tkiva takoj odstranjena in hipokampus je bil skrbno razrezan. Za analizo beljakovin, RNA in citokinov je bil hipokampus takoj zamrznjen v tekočem dušiku in shranjen pri –80 stopinjah. Za imunohistokemijsko analizo so bila tkiva fiksirana s 4 odstotki paraformaldehida za 72 ur in nato prenesena v 20 odstotkov saharoze za nadaljnjih 72 ur.

2,5|Encimsko vezan imunosorbentni test

Vse podgane so bile ubite po vedenjskem testu 3. dan. Hipokampalna tkiva so bila takoj razrezana na ledu in homogenizirana v fiziološki raztopini z ultrazvokom. Nato smo izvedli centrifugiranje pri 10 000 × g pri 4 stopinjah 15 minut. Ravni IL-1, TNF- in IL-6 so bile določene s kompleti za encimski imunosorbentni test (ELISA) (eBioscience, San Diego, CA, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Meje detekcije so bile 8.0 pg/mL za IL{{10}}, 8.0 pg/mL za TNF- in 4,0 pg/mL za IL{{16} }. Koncentracije IL-1, TNF- in IL-6 v plazmi 1. in 3. dan so bile prav tako izmerjene s testom ELISA.

2,6|Določanje nitritov/nitratov in oksidativne poškodbe lipidov in beljakovin

Koncentracijo nitrita/nitrata (NO2−) v zbranem supernatantu smo izmerili z Griessovo reakcijo (Sigma, St. Louis, MO, ZDA), ki se je pokazala kot indikator proizvodnje dušikovega oksida (NO). Na kratko, 100 μL Griessovega reagenta smo dodali 100 μL supernatanta. Celotno vsebnost beljakovin v supernatantu smo izmerili s kompletom reagentov za analizo beljakovin BCA (KeyGEN, Kitajska) po enourni inkubaciji pri sobni temperaturi, absorbanco pa smo izmerili s spektrofotometrom pri 550 nm. Rezultati so nmol NO − na mg beljakovin.

Raven malondialdehida (MDA) v hipokampusu je bila določena s kompletom za testiranje MDA (Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kitajska) po zbiranju s homogenatom in centrifugiranjem. Oksidativna poškodba lipidov je bila določena s testom reaktivnih snovi s tiobarbiturno kislino (TBARS). Na kratko, vzorce supernatanta smo oborili z 10 odstotno trikloroocetno kislino. Nato smo dodali tiobarbiturno kislino (0,67 odstotka) in testirali absorbanco pri 535 nm. 1,1,3,3-tetra metoksi propan kot zunanji standard in podatki so bili izraženi kot nmol ekvivalentov malondialdehida na mg beljakovine.

2,7|Zaznavanje aktivnosti antioksidantnih encimov

Za merjenje aktivnosti superoksid dismutaze (SOD) smo 1{{10}} μL supernatantov, dobljenih s homogenizacijo tkiva in centrifugiranjem (10 000 × g, 15 minut) pri 4 stopinjah, dodali 2 00 μL reakcijske raztopine (50 μL tetrazolija in 19,95 mL testnega pufra, vključno s 50 mM Tris-HCl, 0,1 mmol/L hipoksantinov in 0,1 mmol/L dietilen triamin perocetne kisline, pH 8,0). Nato smo mešanicam dodali 20 μL ksantin oksida, da sprožimo reakcijo. Po stresanju in inkubaciji 20 minut smo s spektrofotometrom zabeležili spremembe absorbance pri 450 nm. Aktivnosti SOD so bile izračunane z uporabo formule, ki je priložena kompletu za odkrivanje (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, ZDA).

Aktivnost CAT v supernatantu tkiva hipokampusa smo določili spektrofotometrično z izračunom hitrosti razgradnje vodikovega peroksida (H2O2) pri 240 nm. Na kratko, alikvot 100 μL supernatanta (20 μL) je bil dodan mešanici substrata (1000 μL), ki je vsebovala 0,3 ml H2O2 v 50 mL 0,05 mol/L PBS (pH 7.0). Absorbance so zabeležili 1 minuto po začetku reakcije. Rezultati so bili izračunani z uporabo zunanjih standardov in izraženi kot U na mg beljakovin.

2,8|Izolacija RNA in kvantitativna PCR

Tkiva hipokampusa smo homogenizirali, da smo pridobili skupne RNA z uporabo TRIzol (Invitrogen), nato pa je bilo pomnoževanje transkripta izvedeno z uporabo iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). Nastala cDNA je bila pomnožena s qPCR z uporabo iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) z gensko specifičnimi primerji začetnikov, relativna ekspresija vsakega gena pa je bila izračunana z uporabo metode 2−ΔΔCt in normalizirana na kontrolo GAPDH. Sekvence primerjev so predstavljene v tabeli S1.

2,9|Western blot

Tkiva hipokampusa smo homogenizirali v pufru za celično lizo (50 mmol/L Tris, pH 7,5, 1 mmol/L EDTA, 150 mmol/L NaCl, 0,5 % Triton X-100 , 0,5 odstotka NP-40, 1 mmol/L fenilmetilsulfonil fluorida, 5 mmol/L natrijevega vanadata, 1 mmol/L natrijevega fluorida, 1 ug/mL aprotinina, pepstatina in leveptina). Proteine ​​smo ločili z geli SDS-PAGE, nato pa proteine ​​v gelih prenesli na PVDF membrane (Millipore). Membrane so bile blokirane s 5 odstotki mleka in nato inkubirane s specifičnimi primarnimi protitelesi, vključno z anti- -APP (ab76763, razredčitev 1:1000), anti-BDNF (ab108319, razredčitev 1:1000), anti-GFAP (ab68428 , razredčitev 1:1000), anti-Iba-1 (ab178847, razredčitev 1:1000), anti-PPAR- (ab209350, redčenje 1:1000), anti-NF-κB (ab32360, razredčitev 1:1000) in anti-GAPDH (ab181602, razredčitev 1:1000). Nato smo TBST uporabili za pranje membran in ga nato inkubirali s sekundarnimi protitelesi, konjugiranimi s HRP (Santa Cruz, CA, ZDA). Nazadnje je ustrezni protein opazoval sistem ECL (PerkinElmer) v luči proizvajalčeve razlage. In ImageJ je bil uporabljen za kvantitativno analizo relativne ekspresije beljakovin.

2.10|Analiza razvrščanja celic, aktiviranega s fluorescenco (FACS).

Za analizo FACS smo celice hipokampusa zbrali takoj po izolaciji. Nato smo celice sprali z ledeno mrzlo fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS) in resuspendirali v PBS, ki je vseboval 2 odstotka FBS. Za vsak test smo 1 × 105 celic v 100 µL PBS-FBS obarvali s fluorescentno konjugiranimi protitelesi CD11b (BD PharMingen, katalog #554982, 1:250) in CD45 (BD PharMingen, katalog #554878, 1:250) na ledu za 2 uri pri 4 stopinjah v temi. Po izpiranju s hladnim PBS smo celice resuspendirali v 300 µL PBS-FBS. Analiza pretočne citometrije je bila izvedena na pretočnem citometru FACSAria I (BD Biosciences). Rezultati so bili analizirani s programom FlowJo (različica 7.6.1).

2.11|Nisslovo barvanje

Zbrani hipokampus je bil vdelan v spojino OCT in nato razrezan na {{0}} μm koronalne sekcije z uporabo zamrzovalnega mikrotoma (Leica). Po odmrznitvi na naelektrenih stekelcih smo rezine sprali s 0.01 mol/L PBS trikrat za skupno 15 minut in nato inkubirali v raztopini krezil vijolice (0,5 odstotka, ki vsebuje nekaj kapljic ledene ocetne kisline). kislino) 10-15 minut pri sobni temperaturi. Po dvakratnem izpiranju z destilirano vodo smo sekcije postopoma dehidrirali v etanolu (70 odstotkov, 85 odstotkov, 95 odstotkov in 100 odstotkov). Po dehidraciji so jih dali v ksilen in prekrili z nosilnim medijem. Na koncu smo opazovali barvanje po Nisslu pod mikroskopom (Leica).

2,12|Analiza podatkov

Podatki so bili analizirani s programsko opremo GraphPad Prism 6.0. Podatki v študijah obnašanja so bili analizirani v različnih časovnih točkah (1. dan ali 3. dan) po anesteziji s sevofluranom z uporabo dvosmerne analize variance (ANOVA) s ponovljenimi meritvami. Drugi podatki so bili analizirani z enosmerno ANOVA pred Bonferronijevim testom. Vsi poskusi so bili izvedeni v treh izvodih, rezultati pa so bili izraženi kot povprečje ± SEM P < 0,05="" je="" veljalo="" za="" statistično="">

3|REZULTATI

3.1|Cistanche je preprečil nenormalno nevroinflamacijo pri starih podganah

Da bi raziskali razlike v kognitivni funkciji med odraslimi in starajočimi se podganami, so uporabili sevofluran za indukcijo anestezije pri 3- in 24-mesečnih podganah. Nato je bilo 1. in 3. dan ocenjeno vedenje, odvisno od hipokampusa (slika S1A). Kot je prikazano na sliki S1B, 1. dan ni bilo nobene razlike v zakasnitvi pobega za štiri poskusne skupine. Poleg tega sta bila čas, porabljen v središču, in odstotek zmrzovanja podobna kot pri podganah, ki so 1. dan prejele nosilec in sevofluran (slika S1C, D). Vendar sta imeli podgani, stari 3- in 24- mesec, znatne razlike v zakasnitvi pobega, času, preživetem v središču, in odstotku

zamrznitev po indukciji sevoflurana 3. dan, kar kaže, da je sevofluran znatno spremenil kognitivno funkcijo starih živali (slika S1B-D). Tako so bile stare podgane uporabljene za nadaljnje poskuse.

Da bi raziskali učinke cistanche na nevrovnetje pri starih podganah, ki so bile izpostavljene sevofluranu, smo ovrednotili ravni provnetnega citokina. Dokazi za nevrovnetje so bili opaženi 24 ur po anesteziji s sevofluranom, kar je razvidno iz visoke koncentracije protivnetnih citokinov IL-1, IL-6 in TNF- v plazmidu 1. in 3. dan (Slika 1A, 1), na nevrovnetje pa so kazale povišane mRNA provnetnih citokinov v hipokampusu do 3 dni (Slika 1C-E). Za vsakega od provnetnih dejavnikov je zdravljenje s cistanho odpravilo razlike v spremembah vnetnih mediatorjev, ki jih povzroča sevofluran. Cistanche je znatno oslabil povišane protivnetne citokine v sevofluranu

3.2|Zdravljenje z izvlečkom Cistanches Herba je zmanjšalo s sevofluranom povzročen oksidativni stres v hipokampusu starih podgan

Nato smo raziskali učinke cistanche na oksidativni stres, ki ga povzroča sevofluran. Kot je prikazano na sliki 2A, smo ugotovili, da je zdravljenje s cistanho preprečilo oksidativni stres, ki ga povzroči sevofluran, kar nakazuje znatno zmanjšana koncentracija nitrita/nitrata v hipokampusu. Opazili smo tudi, da je skupina SEVO plus cistanche pokazala nižje ravni ekvivalentov MDA, indeksa oksidativne poškodbe lipidov, v hipokampusu tri dni po inhalaciji sevoflurana v primerjavi s SEVO

skupino (slika 2B). Poleg tega so podgane, podvržene anesteziji s sevofluranom (skupina SEVO), pokazale znatno zmanjšanje aktivnosti SOD in CAT 3. dan po anesteziji v hipokampusu. Vendar pa je bila hipokampalna aktivnost teh encimov znatno povečana v skupini SEVO plus cistanche v primerjavi s skupino SEVO (slika 2C, D).

CistanchePrehransko dopolnilo lajša antioksidativni stres

3.3| Zdravljenje z izvlečkom Cistanches Herba je zmanjšalo aktivacijo mikroglije

Med laboratorijsko ali z anestezijo povzročenim vnetjem v hipokampusu se aktivirajo mikroglijske celice, ki nato prispevajo k patološkemu napredovanju. Da bi raziskali, ali bi cistanche lahko preprečil aktivacijo mikroglije, smo izmerili populacijo aktiviranih celic mikroglije in njene relativne markerje. Mirujoča mikroglija je izražala CD11b in nizko izraženost CD45, medtem ko je aktivirana mikroglija izražala CD11b in visoko raven CD45. Kot je prikazano na sliki 3A, so rezultati analize pretočne citometrije potrdili, da je bil odstotek CD45 bistveno nižji pri podganah, zdravljenih s cistanhami, kot pri podganah, induciranih s SEVO (0.495 ± 0.{{15} }51 odstotkov po zdravljenju s cistanche v primerjavi z 1,127 ± 0,032 odstotka v skupini SEVO). Nato smo izmerili glialne markerje s qRT-PCR. Po anesteziji s sevofluranom se mRNA

3,4|Zdravljenje z izvlečkom Cistanches Herba je zmanjšalo nevronsko apoptozo, ki jo povzroča sevofluran

Nevronsko apoptozo delno poganjata aktivirana mikroglija in oksidativni stres, in potrdili smo, da lahko cistanča prepreči aktivacijo mikroglije in oksidativni stres in vivo. Za nadaljnjo raziskavo farmakoloških učinkov cistanche smo testirali nevronsko apoptozo z barvanjem TUNEL in cepljeno kaspazo 3 ter imunoblotom Bax/Bcl-2. Kot je prikazano na sliki 4A, je sevofluran povečal celično apoptozo v regijah hipokampusa. Uporaba zdravila Cistanche je zmanjšala število celic TUNEL plus po anesteziji s sevofluranom. Ponazorili smo tudi izjemno visoke ravni kaspaze 3 in Bax, medtem ko nizke ravni Bcl-2 v hipokampusu anesteziranih starih podgan. Podgane, ki so prejele cistanche pred anestezijo, so pokazale znatno zmanjšanje aktivnosti kaspaze 3 (slika 4B), razcepljene kaspaze 3 in proteina Bax (slika 4C, D), kar je bilo skladno z zmanjšano nevronsko apoptozo, opaženo pri barvanju TUNEL.

3,5|Zdravljenje z izvlečkom Cistanches Herba je ublažilo kognitivno disfunkcijo in okvaro hipokampalnega tkiva po anesteziji, povzročeni s sevofluranom

Za nadaljnjo raziskavo vloge cistanche na kognitivno funkcijo so podgane tri zaporedne dni pred anestezijo izpostavili 50 mg/kg cistanche peroralno. V skupini, ki je prejemala cistanhe (skupina SEVO plus cistanche), je bila latenca pobega znatno skrajšana, čas, porabljen v središču, je bil daljši, odstotek zamrznitve pa se je povečal 3. dan po anesteziji v primerjavi s skupino SEVO (slika 5A- C). Ti rezultati so pokazali, da bi cistanche lahko vsaj delno rešil kognitivne motnje. Nadalje smo ovrednotili obseg smrti nevronov v hipokampusu podgan v štirih skupinah z barvanjem po Nisslu. Slike so pokazale, da celice niso imele očitnih nenormalnosti pri skupinski kontroli in skupinski kontroli plus cistanche. Vendar pa je bilo število nevronov za preživetje v regijah CA1 znatno zmanjšano pri podganah, induciranih s SEVO, v primerjavi s tistimi v kontrolni skupini na 3. dan. Zdravljenje s cistanche je obrnilo ta učinek SEVO in znatno spodbuja preživetje nevronov v primerjavi s samim SEVO induciranim (Slika 5D).

3,6|Zdravljenje z izvlečkom Cistanches Herba je zmanjšalo s sevofluranom povzročeno proizvodnjo vnetnih citokinov na PPAR- -občutljiv način

Nato smo raziskali, ali je bil učinek cistanche na proizvodnjo citokinov občutljiv na PPAR{0}}. Zdravljenje z GW9662 (skupina SEVO plus GW9662) je povečalo ravni IL-1, IL-6 in TNF- v primerjavi s skupino SEVO. Vendar pa je zdravljenje s cistanho zmanjšalo SEVO-inducirano proizvodnjo protivnetnih citokinov. Opomba,

3,7| Zdravljenje z izvlečkom Cistanches Herba je zaviralo s sevofluranom povzročen oksidativni stres prek PPAR-

Poročali so, da sevofluran poveča kognitivno disfunkcijo pri podganjem modelu s kronično intermitentno hipoksijo z inhibicijo izražanja PPAR v hipokampusu.1 Nato smo se spraševali, ali je učinekcistanchezgodila na način,- -odvisen od PPAR. V ta namen je bil za nadaljnje študije uporabljen GW9662, selektivni in ireverzibilni antagonist PPAR-. Zdravljenje z GW9662 pri 30 ng je spodbudilo oksidativni stres, kar je razvidno iz povečanih ravni nitrita/nitrata in MDA. Vendar sta bila antioksidativna markerja SOD in CAT v hipokampusu 3. dan povečana v primerjavi s podganami, operiranimi s SEVO. Zdravljenje zcistanchezmanjšal prekomerno proizvodnjo označevalcev oksidativnega stresa, ki jo povzroči SEVO, in olajšal aktivnost SOD in CAT (slika 7A-D). Poleg tega ti učinki, ki jih povzročajocistancheGW9662 vrnil, kar je bilo ugotovljeno s povečanjem proizvodnje nitrita/nitrata (slika 7A) in MDA (slika 7B). Poleg tega je

učinke cistanhe na aktivnost SOD in CAT je obrnil tudi GW9662 (slika 7C, D), kar kaže na sodelovanje PPAR-.

3,8|Zdravljenje z izvlečkom Cistanches Herba je zaviralo mikroglialno aktivacijo in apoptozo nevrocitov ter izboljšalo kognitivni upad na PPAR- - občutljiv način

Naslednji korak je bil raziskati, ali so učinkicistanchena aktivacijo mikroglije in apoptozo nevrocitov so bili občutljivi na PPAR- -. Zdravljenje z GW9662 je povečalo ravni mRNA CD68 (slika 8A), GFAP (slika 8B) in Iba-1 (slika 8C). Predvsem so bili ti učinki, ki jih je povzročil GW9662, učinkovito odpravljenicistanche, kot je razvidno iz zmanjšanja teh istih markerjev (slika 8A-C). Poleg tega je ekspresijo beljakovin GFAP in Iba-1, ki jo proizvaja GW9662, prav tako povrnila cistanča, kar kaže, da cistanča zavira aktivacijo mikroglije in je vsaj delno odvisna od PPAR-. Poleg tega je GW9662 zaviral učinek cistanche na ekspresijo beljakovin -APP in BDNF (slika 8D, E). Da bi raziskali, ali bi cistanche lahko zaviral apoptozo nevrocitov na PPAR- -občutljiv način, so odkrili z apoptozo povezane beljakovine. Kot je prikazano na sliki 8F, G, je cistanche pri 50 mg/kg zmanjšal izražanje pro-apoptoznega proteina (razcepljena kaspaza 3 in Bax). Vendar je te učinke v veliki meri rešil GW9662.

Cistancheekstrakt lahko ublaži celično apoptozo

Ker sta bili ravni oksidativnega stresa in vnetja tesno povezani s kognitivno funkcijo pri podganah po anesteziji, smo dodatno ugotovili, ali je učinekcistanchena kognitivno disfunkcijo je bilo odvisno- -od PPAR. Kot je prikazano na sliki 8H-J, v primerjavi s podganami