1. del: Cistanozid Cistanche Herba blaži s hipoksijo povzročeno reproduktivno škodo pri moških z zaviranjem oksidativnega stresa
Mar 26, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, HeWang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1
Povzetek:Vse več dokazov kaže, da je hipoksija vzrok za moško neplodnost, hipoksija pa je lahko povezana z oksidativnim stresom (OS). Cistanosid (Cis) je feniletanoidna glikozidna spojina, ki jo je mogoče ekstrahirati iz CistanchesHerba in ima različne biološke funkcije. Namen te študije je bil raziskati zaščitne učinke Cis na reproduktivne poškodbe, ki jih povzroči hipoksija, in raziskati specifične mehanizme, ki so v ozadju. Konstruirali so eksperimentalne modele celične in živalske hipoksije ter ocenili zaščitne učinke različnih podtipov Cis na moški reproduktivni sistem in vitro in in vivo. Rezultati so pokazali, da je hipoksija znatno zmanjšala sposobnost preživetja celic GC-1 z zaustavitvijo celičnega cikla in aktivacijo apoptoze, kar je bilo povezano s povečanim OS. Poleg tega je Cis pokazal močne antioksidativne učinke in vitro in in vivo, kar je znatno obnovilo aktivnosti antioksidativnih encimov in znižanje ravni reaktivnih kisikovih vrst (ROS), hkrati pa povečuje viabilnost celic in zmanjšuje apoptozo. Pomembno je, da so vsi podtipi Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C in Cis-H), ki so jih preučevali, pokazali določene antioksidativne učinke, med katerimi so bili učinki Cis-B najpomembnejši. Ta študija dokazuje, da Cis izrazito zmanjša škodljive učinke OS, ki ga povzroči hipoksija, tako da vpliva na aktivnosti antioksidantnih encimov v testisih in GC-1celicah.
Ključne besede: cistanozid, hipobarična hipoksija, moška neplodnost, oksidativni stres, reproduktivna zaščita
sveža rastlina cistanča
Uvod
Trenutno približno 48,5 milijona (15 odstotkov) parov v rodni dobi po vsem svetu trpi zaradi neplodnosti [1], med katerimi je 40-50 odstotkov primerov pripisanih moški neplodnosti [2], stanju, ki je močno povezano z okoljem in življenjskim slogom. dejavniki. Dokazi kažejo, da je dovzetnost mammaliantestisa za nizek pritisk kisika vzročni dejavnik nekaterih oblik moške neplodnosti [3]. Kot so pokazale prejšnje študije, je spermatogeneza oslabljena in zmanjšana ob izpostavljenosti hipobarični hipoksiji [4-7].
Da bi raziskali osnovni mehanizem, so študije pokazale, da izpostavljenost hipobarični hipoksiji poveča proizvodnjo reaktivnih kisikovih vrst (ROS) [8, 9]. ROS ima pomembno vlogo v moškem reproduktivnem sistemu. Pri nizkih ravneh so potrebni za kapacitacijo sperme, akrosomsko reakcijo in fuzijo semenčic in oocitov[10]. Vendar pa lahko čezmerni ROS povzroči poškodbe spermijevega jedra/mitohondrijske DNA in peroksidativne poškodbe plazemske membrane, ki so glavni etiološki dejavniki za povečano tveganje za moško neplodnost [11, 12]. Tako je lahko kopičenje ROS, ki ga povzroča hipoksija, eden od vzrokov za moško neplodnost.
Cistanches Herba, trajna parazitska zdravilna rastlina, je zelo razširjena v sušnih območjih [13] in se pogosto uporablja zaradi svojih farmakoloških dejavnosti [14-17]. Med vsemi učinkovitimi vsebinami Cistanches Herba so PhG veljali za glavno aktivno sestavino. Do danes je bilo iz rastlin Cistanches izoliranih 34 PhG [13]. Cistanosid (Cis), neaktivni PhG, izoliran iz Cistanches Herba, je bil deležen pozornosti zaradi svojih antioksidativnih učinkov.
Glede na antioksidativne učinke Cis in vlogo ROS pri moški neplodnosti, povzročeni s hipoksijo, Cis velja za možnega kandidata za zdravilo za zdravljenje moške neplodnosti, povzročene s hipoksijo. Vendar je nekaj poročil obravnavalo antioksidativne učinke Cis, ekstrahiranega iz Cistanches Herba, pri zdravljenju s hipoksijo povzročene moške neplodnosti ali vključenih signalnih poti. V tej študiji so bili izdelani eksperimentalni modeli hipoksije in vitro in in vivo ter ocenjeni učinki različnih učinkovin Cis.
Cistanche ima aučinek reproduktivne proizvodnje.
Materiali in metode
Celična kultura in reagent
Mišja celična linija spermatogonije GC-1spg(GC-1) je bila kupljena pri American TypeCulture Collection (ATCC) in gojena v DMEM (Invitrogen, ZDA) z dodatkom 10 odstotkov fetalbovine seruma, 1 odstotka L- glutamin (100 mM), penicilin (100 U/mL) in streptomicin (100 ug/mL) pri 37 stopinjah v navlaženem inkubatorju s 5 odstotki CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) je bil kupljen pri Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (Kitajska).
Test viabilnosti celic
Viabilnost celic je bila testirana s testom kompleta za štetje celic{{0}}(CCK-8). Na kratko, GC-1 celice so bile posejane v 96-plošče z vdolbinicami po 1,5 × 103 na vdolbinico in 24 h gojene pri 37 stopinjah. Nato smo celice obdelali z različnimi koncentracijami (20 odstotkov, 15 odstotkov, 10 odstotkov, 5 odstotkov) kisika ali različnimi koncentracijami (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C). , Cis-H) za zahtevani čas. Nato smo supernatant zavrgli in viabilnost celic odkrili s kompletom CCK-8 (DojindoJapan). Absorbanco vsake vdolbinice smo izmerili pri 450 nm z uporabo bralnika mikroplošč (BioRad USA). Končno je bila sposobnost preživetja celic izračunana po naslednji formuli:
Viabilnost celic=(ODeksperimentalna skupina - ODprazna skupina)/(ODkontrolna skupina - ODprazna skupina) × 100 odstotkov.
Western blot analiza
Pobrane celice ali tkiva smo homogenizirali v pufru RIPA za ekstrakcijo beljakovin (RIPA BeyotimeKitajska; Koktajl Roche Švica). Supernatante smo zbrali in koncentracijo proteinov testirali z metodo BCA (Beyotime). Približno 40 ug ekstrahiranih proteinov iz vsakega vzorca smo ločili s SDS-PAGE in elektrotransferirali na nitrocelulozno (NC) filtrirno membrano (BeyotimeChina). Membrane NC filtra so bile 1,5 ure blokirane s 5 odstotki nemastnega mleka in inkubirane s specifičnimi protitelesi (anti-PARP 1:1000, anti-Caspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax1: 1000, anti-GAPDH 1:1000; vsa protitelesa so bila kupljena pri Cell Signaling Technology, ZDA) čez noč pri 4 stopinjah. Nato so bile vse NC membrane inkubirane z ustreznim sekundarnim protitelesom, konjugiranim s hrenovo peroksidazo, 1,5 ure pri sobni temperaturi in slikane s sistemom za slikanje (Tannon, Kitajska).
dodatki v prahu izvlečka cistanče
Zaznavanje celičnega cikla
Za analizo celičnega cikla je bil izveden pretočni citometrični test (FCM). Celice smo obdelali pod različnimi pogoji 72 ur in jih pobrali. Celice smo nato sprali s PBS, fiksirali v 75-odstotnem etanolu in obarvali s propidijevim jodidom (PI). Za vsak vzorec smo zbrali 1 × 104 celic in jih analizirali s pretočno citometrijo (FACSCalibur, BD Biosciences). Nato sta bila izračunana delež celic faze G1/S/G2 in proliferacijski indeks [faza(S plus G2)/faza(G1 plus S plus G2) × 100 odstotkov].
Ki-67 obarvanje
Celice smo gojili v konfokalni posodi in 72 ur zdravili s hipoksijo ali različnimi podtipi Cis. Po fiksaciji vseh celic s 4 odstotki paraformaldehida so bile inkubirane s protitelesom proti Ki-67 (1:200, Cell Signaling Technology). Nato so bile vse celice inkubirane z ustreznim CY-3-konjugiranim protitelesom proti kunčjemu IgG (1:200, Boster, Kitajska) in raztopino DAPI (1,0 ug/mL, Beyotime). Fluorescenco smo opazovali s konfokalnim mikroskopom Fluoview FV1000 (Olympus, Japonska).
Odkrivanje ROS
FCM je bil uveden za merjenje znotrajceličnih ravni ROS z uporabo DCFH-DA. Suspendirane celice so bile posejane v 6-plošče z vdolbinicami in izpostavljene različnim obdelavam. Po 72 urah zdravljenja smo celice suspendirali v DMEM brez seruma z 10 μM DCFH-DA (Beyotime). Vsebnost ROS je bila nato določena s fluorescenčno aktiviranim razvrščanjem celic na sistemu Beckman Coulter Flow CytometrySystem z valovno dolžino vzbujanja 488 nm in valovno dolžino emisije 525 nm [18].
Določanje lipidne peroksidacije (LPO)
Za odkrivanje LPO je bil izveden test reaktivnih snovi na tiobarbiturno kislino (TBARS). Vsi delovni koraki so bili izvedeni v skladu z navodili (Sigma USA). Koncentracije so bile izračunane z uporabo koeficienta molske ekstinkcije 1,56×105/(M·cm), ki je bil pridobljen z uporabo malondialdehida kot standarda. Rezultati so izraženi kot nmol ekvivalentov MDA/mg beljakovin.
Določanje aktivnosti encimov
Aktivnosti encimov so testirali z uporabo testnih kompletov, vključno z glutation reduktazo (GR), glutation peroksidazo (GPx) in superoksid dismutazo (SOD). Vsi operativni koraki so bili izvedeni v skladu s priloženimi navodili (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute China).
Živali in eksperimentalni protokol
Zreli samci podgan Wistar (180-220 g, stari 8 tednov) so bili pridobljeni iz centra za živali Četrte vojaške medicinske univerze v Xi'anu na Kitajskem. Dovoljenje za uporabo živali je pridobil univerzitetni odbor za etiko (referenčna številka : 20190506). Poskusi na živalih so bili izvedeni v skladu z univerzitetnimi smernicami za nego in uporabo laboratorijskih živali.
Vsem podganam so pustili, da so se prilagodile približno en teden pred začetkom poskusa. Po aklimatizaciji so podgane naključno razdelili v 6 skupin s 5 živalmi v vsaki skupini. Podgane v kontrolni skupini so bile vzrejene pod normalnim tlakom (PO2: 20 odstotkov; zračni tlak: 101,3 kPa), medtem ko so bile podgane v modelni skupini in skupini, zdravljeni s Cistretom, vzrejene v nizkotlačni kisikovi komori (notranji tlak 61,6 kPa, kar ustreza višina 4000 metrov nad morsko gladino; PO2: 14,55 odstotka ) za simulacijo hipoksičnega okolja na visoki nadmorski višini. Vse podgane so imele prost dostop do hrane in vode v plastičnih kletkah pri 22±2 stopinjah in vlažnosti s samodejnim ciklom 12-h svetloba/tema. Podgane v modelu in skupinah, zdravljenih s Cis, so ostale v hipobaričnih pogojih, vendar so bile vsakih 96 ur premeščene v normobarične pogoje, takrat so jim dali hrano in vodo ter očistili kletke. Trajanje prehoda iz hipobarične v hipobarično je bilo približno 2 uri. Vse tretirane skupine so bile zdravljene z ustreznim Cis (8 mg/kg/dan) preko oralne gavaže 8 tednov, medtem ko so bile kontrolne in modelne podgane zdravljene z enakim volumnom vode.
Po 8 tednih so podgane žrtvovali pod anestezijo. Testise, epididimis in semenske vezikule smo ločili in stehtali, organski indeks pa izračunali po naslednji formuli: (masa organa/teža živali) × 100 odstotkov. Nato so zbrali spermo v epididimisu in testirali njihovo gibljivost in aktivnost akrosomeencimov. Podobno so bila zbrana tkiva testisov za histopatološke študije in detekcijo ROS, LPO in antioksidativne encimske aktivnosti.
Ocena stopnje živih semenčic
Epididimis je bil zarezan s kirurškimi škarjami in suspenzija sperme je bila pripravljena v fiziološki raztopini. Za oceno količine živih semenčic smo 5 μl suspenzije semenčic previdno zmešali z enako količino eozin-Ystain. Nato so spermo prešteli pod svetlobnim mikroskopom. Stopnje žive sperme so bile ocenjene z izračunom obarvane (mrtva sperma) in neobarvane sperme (živa sperma).
Cistanche tubulosa v prahupovečastopnje žive sperme.
Za več informacij kliknite tukaj.
Določanje encimske aktivnosti akrosoma sperme
Za ovrednotenje akrosomskih encimov sperme je bil uporabljen test encimske aktivnosti akrosoma sperme [19]. Rezultati v vsaki skupini so bili izračunani po naslednji formuli: Aktivnost akrosomskega encima (μIU)=(ODExperimentgroup - ODBlank skupina)/(247,5×10) × 106.
Statistična analiza
Vsi kvantitativni podatki so izraženi kot povprečje ± SD in so bili analizirani s programsko opremo SPSS 22.0. Za primerjavo podatkov med dvema skupinama je bil uporabljen neodvisni Studentov t-test. *P< 0.05="" and="" **p="" <="" 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">
