1. DEL Ehinakozid povzroči vazorelaksacijo pljučne arterije podgan z odpiranjem kanalov NO-cGMP-PKG-BKCa in zmanjšanjem znotrajcelične ravni Ca2 plus

Kako ehinakozid povzroča vensko sprostitev?

Xiang-Yun GAI1, 2, 3, Yu-hai WEI4, Wei ZHANG2, Ta-na WUREN2, Ya-ping WANG2, Zhan-Qiang LI2, Shou LIU2, Lan MA2, Dian-Xiang LU2, Yi ZHOU1, 2, Ri- li GE1, 2, * 1 Department of Pharmacology, School of Life Science and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, Kitajska; 2 Raziskovalni center za visokogorsko medicino, Medical College of Qinghai University, Xining 810001, Kitajska; 3 School of Pharmacy, Qinghai University for Nationalities, Xining 810007, Kitajska; 4 Qinghai Entry-Exit Inspection and Carantene Bureau, Xining 810001, Kitajska

Meriti:Dolgotrajna pljučna vazokonstrikcija, kot jo opazimo na visoki nadmorski višini, lahko povzroči pljučno hipertenzijo (PH). Glavni namen te študije je raziskati vazorelaksacijski učinekehinakozid(ECH), feniletanoidni glikozid iz tibetanske rastline Lagotis brevituba Maxim inCistanche tubulosa, na pljučno arterijo in njen možni mehanizem.

Metode:Pljučne arterijske obroče, pridobljene iz podganjih samcev Wistar, smo suspendirali v organskih komorah, napolnjenih z raztopino Krebs-Henseleit, in izometrično napetost izmerili s pretvornikom sile. Intracelularne ravni Ca2 plus so bile izmerjene v gojenih gladkih mišičnih celicah pljučne arterije podgan (PASMC) z uporabo Fluo 4-AM.

Rezultati: ECH(30–300 µmol/L) sproščene pljučne arterije podgan, ki jih je predkontraktiral noradrenalin (NE) na način, ki je odvisen od koncentracije, in ta učinek je bilo mogoče opaziti tako pri nepoškodovanem endoteliju kot pri obročkih, ogoljenih z endotelijem, vendar z znatno nižjim največjim odzivom in višji EC50 v endotelijsko razgaljenih obročih. Ta učinek so znatno blokirali L-NAME, TEA in BaCl2. Vendar IMT, 4-AP in Gli niso zaviraliECH-inducirana sprostitev. V pogojih brez ekstracelularnega Ca2 plus se je največja kontrakcija zmanjšala na 24,54 odstotka ±2,97 odstotka in 10,60 odstotka ±2,07 odstotka v obročkih, obdelanih s 100 oziroma 300 μmol/L ECH. V pogojih zunajceličnega dotoka kalcija se je največja kontrakcija zmanjšala na 112,42 odstotka ±7,30 odstotka, 100,29 odstotka ±8,66 odstotka in 74,74 odstotka ±4,95 odstotka v obročkih, obdelanih s 30, 100 oziroma 300 μmol/L ECH. Po naložitvi celic s Fluo 4-AM je bila povprečna intenzivnost fluorescence nižja v celicah, zdravljenih zECH(100 μmol/L) kot pri NE.

Zaključek: ECHzavira NE-inducirano kontrakcijo pljučne arterije podgan z zmanjšanjem intracelularnih ravni Ca2 plus in inducira njeno sprostitev prek poti NO-cGMP in odpiranja kanalov K plus (BKCa in KIR).

Ključne besede:tibetanska zel;ehinakozid; pljučna hipertenzija; visoka nadmorska višina; vazorelaksacija; NE; BKCa; KIR; arterijski obroč; gladke mišične celice pljučne arterije.

Za več informacij se obrnite na:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola ima številne učinke, kliknite tukaj za več informacij

Uvod

Trajna pljučna vazokonstrikcija, kot jo doživimo na visoki nadmorski višini, lahko povzroči pljučno hipertenzijo (PH) in medialno hipertrofijo [1], ki sta bili opredeljeni kot glavni vzrok za hipertrofijo desnega prekata in srčno popuščanje [2]. Posamezniki, ki živijo na visoki nadmorski višini, bodisi začasno ali trajno, imajo lahko blago do zmerno pljučno hipertenzijo, tisti z večjo dovzetnostjo za hipoksijo pa imajo lahko pretirano pljučno vazokonstrikcijo, kar vodi do različnih bolezni na visoki nadmorski višini, ki so povezane s pomembno obolevnostjo in umrljivostjo, kot je npr. višinski pljučni edem in bolezni srca [3].Ehinakozid(ECH) (slika 1) je afeniletanoidni glikozidnajdemo v različnih kitajskih zeliščih, kot sta tibetanska rastlina Lagotis brevituba Maxim inCistanche tubulosa[4, 5]. Lagos brevituba Maxim je vrsta Lagotis spp, ki pripada Scrophulariaceae in raste na nadmorski višini nad 3000 metrov na planoti Qinghai-Tibet.ECHima različne zaželene farmakološke lastnosti, kot so antioksidativne, protivnetne, nevroprotektivne, hepatoprotektivne in lastnosti lovljenja radikalov dušikovega oksida (NO) [6]. Prav tako lahko izzove od endotelija odvisno sprostitev v torakalnih aortnih obročih podgan in ozdravi kardiovaskularne bolezni [7]. Vendar pa, kolikor nam je znano, ni bilo študije, ki bi raziskovala njegove učinke na vaskularni tonus v pljučnih arterijah. Nameni te študije so naslednji: (1) raziskati, ali ECH povzroči vazorelaksacijo in vitro v pljučnih arterijah podgan, predhodno skrčenih z noradrenalinom (NE), in ali je ta učinek, če sploh, odvisen od endotelija ali deluje neposredno na gladke mišice žil ; (2) raziskati učinek ECH na zunajcelični dotok kalcija in intracelularno sproščanje kalcija v gladkih mišičnih celicah pljučne arterije podgan (PASMC); in (3) identificirati možne poti in kanale K plus, ki sodelujejo pri sprostitvi, ki jo povzroči ECH.

Materiali in metode

Reagenti

ECH je prijazno zagotovil dr. Peng-fei TU z Univerze v Pekingu (Peking, Kitajska), s čistostjo več kot 98 odstotkov, kot je bilo ugotovljeno s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti. Dimetil sulfoksid (DMSO) je bil kupljen pri Solar Science & Technology Co, Ltd (Peking, Kitajska); NE, acetilholin (ACh, večji ali enak 99 odstotkov), indometacin (IMT), Nω -nitro-L-arginin metil ester hidroklorid (L-NAME), tetraetilamonijev klorid (TEA), barijev klorid (BaCl2), {{ 9}}aminopiridin ({{10}}AP) in glibenklamid (Gli) podjetja Sigma Chemical Co (St Louis, MO, ZDA); visoko glukozni Dulbeccov modificirani Eagleov medij (DMEM), fetalni goveji serum (FBS) in tripsin podjetja Gibco BRL Co, Ltd (Gaithersburg, MD, ZDA); mišje protitelo proti primarnim gladkim mišičnim aktinom (-SMA) in kozje protitelo proti mišjim sekundarnim protitelesom podjetja Boshide Biotech Co, Ltd (Wuhan, Kitajska); Indikatorji kalcija Fluo (Fluo 4-AM) podjetja Invitrogen Corp (Carlsbad, CA, ZDA); in vse anorganske soli podjetja Beijing Chemical Reagent Co, Ltd (Peking, Kitajska). IMT smo raztopili v DMSO in 5 odstotkov NaH2PO4, Gli, Fluo 4-AM in ECH smo raztopili v DMSO, vse druge reagente pa smo raztopili v raztopini Krebs-Henseleit (KH) ali PBS. Preliminarni poskusi so pokazali, da DMSO pri manj kot 0,1 odstotka (v/v) ni vplival na razvoj napetosti izoliranih pljučnih arterijskih obročev.

Poskusne živali

Vse postopke in protokole je odobril Odbor za nego in uporabo živali Medicinske fakultete Univerze Qinghai. Samci podgan Wistar, stari 6–8 tednov, s telesno težo 250–300 g, so bili kupljeni pri Centru za živali Univerze Lanzhou (Lanzhou, Kitajska) in vzdrževani na standardni laboratorijski dieti in vodi iz pipe ad libitum pri sobni temperaturi 22± 2 stopinji in relativni vlažnosti 45-55 odstotkov med poskusi.

In vitro perfuzija pljučne arterije

Priprava pljučnih arterijskih obročev podgan

Podgane, ki so tehtale 250–300 g, smo anestezirali z intraperitonealno injekcijo natrijevega pentobarbitala (40 mg/kg), nato pa smo jim odstranili srce in pljuča ter jih takoj potopili v ledeno mrzlo raztopino KH, ki je vsebovala (v mmol/L) : 118 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4·7H2O, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3 in 11,1 glukoze (pH 7,4). Intrapulmonalne arterije (premera 0,7–1,5 mm) so izrezali brez okoliškega vezivnega tkiva in adventitije ter jih nato razrezali na obroče dolžine približno 2–3 mm. Obroči so bili suspendirani v komorah organov, napolnjenih z 10 mL raztopine KH pri 37 stopinjah in uplinjeni s 95 odstotki O2–5 odstotki CO2 [8], izometrična napetost pa je bila izmerjena s pretvornikom sile (JH-2, Space Medico -Inženirski inštitut, Peking, Kitajska)

Ocena aktivnosti žilnega obroča in ocena endotelne funkcije

Obroči posod so pustili, da so se uravnotežili 2 uri pod bazalno napetostjo 400 mg, v tem času pa smo raztopino KH zamenjali vsakih 15 minut; nato je bil v komoro dodan 1 μmol/L NE, da se oceni aktivnost vsakega obroča z zaznavanjem odstotka kontrakcije. Pred in po eksperimentalnem protokolu je bil izmerjen odstotek kontrakcije (sliki 2A in 2B). Endotelij smo v nekaterih obročkih odstranili z nežnim drgnjenjem površine intime s fino jekleno žico, celovitost pa smo kvalitativno ocenili s stopnjo relaksacije, ki jo je povzročil ACh (10 μmol/L) v odstotku kontraktilnega tonusa, ki ga povzroči NE (1 μmol/l). Če je bila sprostitev z ACh večja od 80 odstotkov, je endotelij ostal v dobrem stanju; če je bila sprostitev manjša od 30 odstotkov, je bil endotelij uničen (Sliki 2A in 2B)[9].

Izolacija in kultura podganjih PASMC

Distalne pljučne arterije smo izolirali iz pljučnih režnjev podgan in previdno odstranili endotelij in adventicijo. Ko so bila tkiva zmleta na {{0}} mm koščke, so bila takoj dodana v bučke, vzdrževana pri 37 stopinjah in 5 odstotkih CO2 v vlažnem inkubatorju približno štiri ure, nato pa kultivirana z DMEM z visoko vsebnostjo glukoze dopolnjen z 20 odstotki FBS, 100 U/mL penicilina in 100 U/mL streptomicina približno pet dni. Polovica gojišča je bila zamenjana s svežim gojiščem, ko so se pojavile celice. Ko so celice dosegle 80-odstotno sotočje, so bile pobrane z 0,125-odstotnim tripsinom in zasejane v bučke (razmerje 1:2), ki so vsebovale DMEM z visoko vsebnostjo glukoze, dopolnjen z 10 odstotki FBS, 100 U/mL penicilina in 100 U/mL streptomicina . Za vse poskuse so bile uporabljene celice s tremi do osmimi prehodi.

Identifikacija PASMC z imunohistokemijo

PASMC so bili pozitivni na imunokemično barvanje, ko so opazili tipične značilnosti "hribov in dolin". Celice so bile zasejane v 6-plošče z vdolbinicami s steklenimi pokrovnimi stekelci. Ko so celice dosegle 80-odstotno sotočje, so bile fiksirane v 4-odstotnem paraformaldehidu, blokirane s 3-odstotnim vodikovim peroksidom za 15 minut in nato inkubirane z mišjim protipodganjim primarnim -SMA protitelesom čez noč pri 4 stopinjah. Po trikratnem izpiranju v PBS 10 minut smo celice inkubirali s kozjim protimišjim sekundarnim protitelesom pri sobni temperaturi 45 minut, ponovno trikrat spirali v PBS 10 minut in vizualizirali z diaminobenzidinom.

Odkrivanje znotrajcelične koncentracije kalcija v PASMC podgan

PASMC so bile zasejane v {{0}}plošče z vdolbinicami s steklenimi pokrovnimi stekelci. Ko so celice dosegle 80-odstotno sotočje, so gojišča zamenjali z DMEM brez seruma. Štiriindvajset ur kasneje so celice naložili s 7 μmol/L Fluo 4-AM pri 37 stopinjah 30 min v vlažnem ozračju s 5 odstotki CO2. Preostalo barvilo smo sprali z raztopino Hanksove uravnotežene solne raztopine (HBSS), ki je vsebovala naslednje (v mmol/L): 1,26 CaCl2, 0.49 MgCl2·6H2O, 0.41 MgSO4·7H2O, 5,33 KCl, 0,44 KH2PO4, 4,17 NaHCO3, 137,93 NaCl, 0,34 Na2HPO4 in 5,56 D-glukoze, brez fenol rdečega. Celice, obremenjene s Fluo 4-AM, so bile izpostavljene enemu od treh pogojev zdravljenja: (1) kontrolni skupini (con group), v kateri so bile celice inkubirane z DMEM brez seruma; (2) skupina NE, v kateri so bile celice 10 minut inkubirane z DMEM brez seruma, dopolnjenim z 1 μmol/L NE; in (3) skupina NE plus ECH (100 μmol/L) (skupina NE plus ECH100), v kateri so bile celice inkubirane z DMEM brez seruma, dopolnjenim z 1 μmol/L NE 10 minut in 100 μmol/L ECH za 20 min. Intenzivnost fluorescence je bila opažena in fotografirana s fluorescenčno mikroskopijo (IX71, Olympus, Tokio, Japonska) [11]. Za vsak vzorec smo zbrali šest vidnih polj (200 ×). Znotrajcelična koncentracija kalcija je bila kvantificirana z merjenjem srednje intenzivnosti fluorescence s programsko opremo Image Pro-Plus 6.0.

Statistična analiza

Podatki so bili izraženi kot povprečje ± SD. Kadar je bila ustrezna pomembna razlika ocenjena z Dunnettovim testom ali Student-Newman-Keulsovim testom za večkratne primerjave po enosmerni analizi variance (ANOVA). Stopnja verjetnosti P<0.05 was="" considered="">

Rezultati Vazorelaksantni učinki ECH na izolirano pljučno arterijo

Na začetku poskusa kumulativni dodatek ECH od 30 do 300 μmol/L ni imel pomembnega vpliva na bazalno napetost pljučne arterije. Potem ko je vazokonstrikcija, ki jo povzroči NE, dosegla plato, smo ECH dodali kumulativno (30–300 μmol/L) nedotaknjenemu endoteliju (E plus, slika 2C) ali obročem, ogoljenim z endotelijem (E–, slika 2C). V nedotaknjenih endotelijskih obročih je kumulativni dodatek ECH razširil žile na način, ki je odvisen od koncentracije, z maksimalnim

odstotek mamine relaksacije 89,22 odstotka ±0,32 odstotka pri 300 μmol/L in EC50 51,60±0,57 μmol/L (sliki 2A in 2C). Podobno je v endotelijsko golih obročih ECH prav tako razširil žile na način, ki je odvisen od koncentracije, vendar z znatno nižjim največjim odzivom 67,72 odstotka ±1,69 odstotka (P<0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings)="" and="" a="" higher="" ec50="" of="" 108.51±2.8="" μmol/l=""><0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings,="" figure="" 2b="" and="" 2c).="" the="" sustained="" plateau="" of="" the="" high-contraction="" percentage="" induced="" by="" ne="" (1="" μmol/l)="" after="" the="" experimental="" protocol="" indicated="" that="" the="" rings="" pretreated="" with="" ech="" (30–300="" μmol/l)="" had="" good="" activity="" (figure="" 2a="" and="">

Učinki ECH na intracelularno sproščanje kalcija in zunajcelični dotok kalcija

Obroči, ogoljeni z endotelijem, so bili izpostavljeni 1 μmol/L NE, dokler ni bila dosežena največja kontrakcija. Pod zunajceličnimi pogoji brez Ca2 plus so bili obroči pred začetkom poskusov uravnoteženi v raztopini KH brez Ca2 plus, ki je vsebovala 0.2 mmol/L EGTA. Po treh izpiranjih z raztopino KH brez Ca2 plus in brez EGTA so bili obroči predhodno inkubirani z ECH (30, 100 in 300 μmol/L) 20 minut in nato ponovno izpostavljeni 1 μmol/L NE. Proizvedeni prstani

nevzdržne kontrakcije, ki so se hitro vrnile na izhodiščno vrednost, v primerjavi z začetnimi kontrakcijami, ki jih je povzročil NE, ki je služil kot referenca. Največja kontrakcija pri kontroli je bila 33,27 odstotka ±2,94 odstotka (sliki 3A in 3E), vendar je bila znatno zmanjšana na 24,54 odstotka ±2,97 odstotka in 10,60 odstotka ±2,07 odstotka v obročkih, predhodno obdelanih s 100 oziroma 300 μmol/L ECH (P<0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3c–3e).="" under="" extracellular="" calcium="" influx="" conditions,="" 2.5="" mmol/l="" cacl2="" was="" added="" to="" the="" chamber="" when="" the="" curve="" reached="" a="" plateau.="" the="" control="" group="" produced="" sustained="" contractions,="" with="" a="" maximum="" contraction="" of="" 139.89%±7.38%="" (figure="" 3a="" and="" 3e);="" but="" the="" maximum="" contraction="" was="" significantly="" reduced="" to="" 112.42%±7.30%,="" 100.29%±8.66%,="" and="" 74.74%±4.95%="" in="" rings="" pretreated="" with="" 30,="" 100,="" and="" 300="" μmol/l="" of="" ech,="" respectively=""><0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3b–3e).="" under="" these="" conditions,="" the="" maximal="" effect="" caused="" by="" ech="" was="" more="" pronounced="" with="" 300="" μmol/l="" than="" with="" 100="" or="" 30="" μmol/l=""><0.01 vs="" 30="" or="" 100="" μmol/l="" ech="" group).="" different="" concentrations="" of="" ech="" all="" shortened="" the="" platform="" of="" sustained="" contraction,="" which="" was="" induced="" by="" extracellular="" calcium="" influx="" at="" different="" levels="" (figure="">

Vloge različnih inhibitorjev pri vazorelaksaciji pljučne arterije podgan, ki jo povzroči ECH

Z ECH inducirano vazorelaksacijo pljučne arterije pri podganah so raziskovali v prisotnosti ali odsotnosti naslednjih zaviralcev: L-NAME (zaviralec eNOS), IMT (zaviralec ciklooksigenaze), TEA (zaviralec kanala K plus z veliko prevodnostjo Ca2 plus), BaCl2 ( notranji usmernik K plus zaviralec kanala), 4-AP (napetostno odvisen zaviralec K plus kanala) in Gli (ATP-občutljiv zaviralec K plus kanala). Obroči so bili maksimalno skrčeni z 1 μmol/L NE, nato pa L-NAME (100 μmol/L), IMT (10 μmol/L), TEA (1 mmol/L) , BaCl2 (1 mmol/L), 4-AP (1 mmol/L) ali Gli (10 μmol/L). Ko je bil dosežen nov plato, smo dodali ECH na kumulativni način od 30 do 300 μmol/L. Krivulje koncentracija-odziv v prisotnosti različnih inhibitorjev so prikazane na sliki 4. Vazorelaksantni učinek ECH na pljučne arterijske obroče, skrčene z 1 μmol/L NE, je bil znatno blokiran z L-NAME (100 μmol/L), TEA ( 1 mmol/L) in BaCl2 (1 mmol/L) z največjimi sprostitvami 64,41 odstotka ±3,20 odstotka, 84,38 odstotka ±0,70 odstotka oziroma 75,27 odstotka ±0,93 odstotka (P<0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 89.22%±0.32%),="" and="" the="" values="" of="" ec50="" were="" increased="" to="" 197.32±2.75="" μmol/l,="" 91.42±2.11="" μmol/l,="" and="" 115.49±1.75="" μmol/l,="" respectively=""><0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 51.60±0.57="" μmol/l)="" (table="" 1).="" however,="" imt="" (10="" μmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l)="" did="" not="" inhibit="" the="" ech-induced="" relaxation="" (figure="" 4="" and="" table="" 1).="" to="" validate="" the="" effects="" of="" these="" inhibitors="" on="" ech-induced="" relaxation,="" the="" rings="" precontracted="" with="" 1="" μmol/l="" of="" ne="" were="" treated="" with="" l-name="" (100="" μmol/l),="" imt="" (10="" μmol/l),="" tea="" (1="" mmol/l),="" bacl2="" (1="" mmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l).="" after="" a="" new="" plateau="" was="" reached,="" ech="" was="" added="" to="" the="" chamber="" at="" a="" single="" concentration="" of="" 300="" μmol/l="" rather="" than="" in="" a="" cumulative="" manner.="" the="" maximum="" relaxation="" was="" reduced="" to="" 56.33%±0.90%,="" 82.21%±0.92%,="" and="" 72.16%±0.76%="" following="" the="" addition="" of="" l-name,="" tea,="" and="" bacl2,="">

Identifikacija podganjih PASMC

At low magnification, spindle cells were densely packed, and almost all the cells were stained positively for PASMCs (the PASMC purity was >95 odstotkov) (slika 6A). Rjavo obarvane miofilamente so jasno opazili v citoplazmi pri veliki povečavi (slika 6B).

Cistancheehinakozidse lahko upreapoptoza

Vpliv ECH na znotrajcelično koncentracijo kalcija v PASMC podgan

NE (1 μmol/L) je pomembno povečal znotrajcelično koncentracijo kalcija (n=6, P<0.01 vs="" the="" control="" group)="" in="" rat="" pasmcs,="" and="" ech="" could="" decrease="" the="" mean="" fluorescence="" intensity="" (n="6,"><0.01 vs="" the="" ne="" group)="" (figure="">