1. del: Ehinakozid ščiti pred nevronsko apoptozo, ki jo povzroči MPP plus, prek regulacije poti ROS/ATF3/CHOP

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Kliknite tukaj za 2. del

vrste (ROS) prav tako prispevajo k njegovemu razvoju [3]. Značilnosti, podobne PD, lahko povzroči več okoljskih toksinov, vključno z 1-metil-4-fenil- 1,2,3,6-tetrahidropiridinom (MPTP), cianidom, ogljikovim sulfidom, in toluen. MPTP se pogosto uporablja za induciranje živalskih modelov PD, njegov aktivni metabolit, 1-metil-4- fenilpiridinijev ion (MPP?), pa se uporablja v celičnih modelih PD [4, 5]. MPP? selektivno zavira transportno verigo elektronov in povzroči čezmerno proizvodnjo ROS, s čimer povzroči nevronsko smrt in sindrom, ki spominja na PD [6]. Nedavne študije so pokazale, da MPP? inducira več poti v modelu PD in vitro, vključno s povečano fosforilacijo GSK3B (pY206) in akumulacijo a-sinukleina [5], uravnavanje osi hem oksigenaza-1/ni-nikotinamid adenin dinukleotid fosfat oksidaza/ROS [7, 8], povečana ekspresija aktivnega transkripcijskega faktorja 3 (ATF3) in zaustavitev rasti preko 153 (GADD153)/C/EBP-homolognega proteina (CHOP), inducibilnega za poškodbe DNA [9]. V kliničnem zdravljenju je supresija produktov ROS ena najpomembnejših strategij za preživetje nevronov in zdravljenje PD [1].

Ehinakozid(ECH, slika 1A), naravnafeniletanoidki ga najdemo v številnih zdravilnih rastlinah, je glavna sestavinafeniletanoidglikozidiizoliran iz tradicionalnega kitajskega zelišča,Cistanchesalsa [10]. Zanimivo je, da so nedavne študije to pokazaleECHima zaščitne učinke pri mišjem modelu PD, ki ga povzroča MPTP [10, 11].ECHprav tako oslabi apoptozo nevroblastomskih celic, ki jo inducira faktor tumorske nekroze-a ali 6-hidroksidopamin in vitro [12, 13]. Vendar pa mehanizmi, s katerimiECHspodbuja preživetje nevronov v celičnem modelu PD, ki ga povzroči MPP, ostajajo nejasni.

To smo pokazaliECHobčutno zmanjšal produkte ROS, ki jih povzroča MPP? v celicah SH-SY5Y.ECHprav tako zavirajo izražanje ATF3, CHOP in a-sinukleina, ki ga povzroča MPP?, ter zavirajo aktivacijo proapoptoznih proteinov kaspaze-3 in poli (ADP-riboza) polimeraze (PARP).

Cistancheehinakozidimanevroprotektivnoučinki

Materiali in metode

Reagenti

Dulbeccov minimalni esencialni medij (DMEM), fetalni goveji serum, 0.25 odstotkov tripsina, 1 odstotek penicilina/streptomicina in reagent TRIzol so bili iz Life Technologies (Grand Island, NY). Kromatinsko barvilo bisbenzimid (Hoechst 33342), poli-L-lizin, MPP? jodid in MPTP sta bila iz Sigme (St. Louis, MO). Komplet za analizo lipidne peroksidacije malondialdehida (MDA) in diklorofluorescein diacetata (DCFH-DA) sta bila podjetja Beyotime Biotech (Haimen, Kitajska). ECH čistosti C98 je bil iz Push Biotechnology (Chengdu, Kitajska).

Živali in zdravljenje

Vzdrževanje in zdravljenje živali je bilo, kot je opisano prej [14]. Uporabili smo samce miši C57BL/6 (Shanghai Laboratory Animal Co., Šanghaj, Kitajska), ki so tehtali 24–26 g pri starosti 10 tednov. Živali so vzdrževali pri standardnih pogojih (12:12 h svetloba: temni cikel, 21 ± 2 C in relativna vlažnost 40 odstotkov) in dovoljen dostop do hrane in vode ad libitum. Vse postopke je odobril Odbor za etiko živali bolnišnice Zhongshan, Univerza Fudan, in so bili izvedeni v skladu z navodili Nacionalnega inštituta za zdravje za nego in uporabo

Laboratorijske živali.

Miši so bile naključno razdeljene v štiri skupine (10 miši/skupino): skupina A, kontrolna skupina z nosilcem, ki je prejela enak volumen (500 l) normalne fiziološke raztopine (NS); skupina B, ECH kontrolna skupina, dana 20 mg/kg ECH; skupina C, modelna skupina MPTP, predhodno obdelana z enakim volumnom NS; in skupina D, skupina, zdravljena z ECH, predhodno obdelana z 20 mg/kgECH. ECHje bil raztopljen v NS in dostavljen z intragastričnim dajanjem vsakih 24 ur 15 zaporednih dni. Mišji model PD za skupini C in D je bil ustvarjen s petimi zaporednimi intraperitonealnimi injekcijami 30 mg/kg MPTP vsakih 24 ur od 11. do 15. dneva. Miši so ubili z dislokacijo materničnega vratu ali perfuzijo, ki so jo narkotizirali z 10-odstotnim kloralhidratom (3,6 mg/ kg) intraperitonealno 24 ur po končnem zdravljenju.

Perfuzija in obdelava tkiva sta bila, kot je opisano prej [14]. Po intrakardialni perfuziji so bili zbrani vzorci možganov in fiksirani v 4-odstotnem paraformaldehidu 24 ur pri 4C, vdelani v parafin in koronarni odseki, ki so obsegali celoten SNc (stereotaksične koordinate anteroposterior -3.64 do -2).92 mm glede na bregmo) ​​so bili odrezani na 5 lm.

Nadaljnjih 5 živali iz vsake skupine je bilo ubitih zaradi izpaha materničnega vratu, ventralni srednji možgani pa so bili hitro lizirani v 1-odstotnem liznem pufru SDS na ledu. Nivo CHOP in ATF3 proteina v lizatu smo analizirali z Western blottingom.

Cistancheehinakozidima učinek poživljanjaledvica

Kultura podganjih ventralnih srednjih možganov (VM)

Dopaminergični nevroni

Breje podgane Wistar so bile kupljene pri Shanghai Laboratory Animal Co. (Šanghaj, Kitajska). DA nevroni v VM so bili izolirani na embrionalni dan 14. VM je bil seciran in obdelan za vzpostavitev primarnih VM DA nevronskih kultur, kot je opisano prej [15, 16]. Na kratko, koščke tkiva smo zbrali v ledeno mrzli Hanksovi uravnoteženi solni raztopini (HBSS) in centrifugirali pri 1000 obratih na minuto pri 4C 5 minut. Tkivno peleto smo inkubirali v 750 l 0,1-odstotnega tripsina-HBSS 15 minut pri 37 °C s 5-odstotnim CO2. Za inaktivacijo tripsina smo uporabili fetalni telečji serum (FCS; 750 l) in tkiva smo ločili z nežnim trituriranjem

z uporabo sterilizirane Pasteurjeve pipete. Celične suspenzije smo centrifugirali pri 1000 obratih na minuto 4 minute pri 4 °C in ponovno suspendirali v diferenciacijskem mediju (Dulbeccojev modificiran Eagleov medij/F12, 33 mmol/L D-glukoze, 1 odstotek L-glutamina in 1 odstotek FCS, dopolnjen z 2 odstotkoma B27). Celice so bile posejane na s poli-D-lizinom (Sigma) prevlečene 24-plošče za tkivne kulture pri 5 9 104 celic/jamico v 500 l diferenciacijskega medija pri 37 °C s 5 odstotki CO2 10 dni, da so se razvile v

zrelih DA nevronov. Za nevrone VM DA je bila značilna imunofluorescenca s protitelesom proti b-tubulinu izotipa III in protitelesom proti tirozin hidroksilazi (TH) (slika S1). Celice smo obdelali z 1 mmol/L MPP?, 40 LG/mL ECH, kombinacijo MPP? in ECH ali sam PBS kot kontrola. Viabilnost celic smo analizirali z reagentom CCK-8 po 96 urah zdravljenja.

in so predstavljeni kot povprečje ± SD (n {{0}}; **P \0.01 v primerjavi s kontrolo, #P \ 0,05, ##P \0,01 v primerjavi z MPP ? zdravljenje). C Svetlobno mikroskopske slike morfoloških sprememb, ki jih povzroča MPP? ali MPP? in ECH. a, kontrola PBS; b, 40 lg/mL ECH; c, 1 mmol/L MPP?; d, 1 mmol/L MPP? in 10 lg/mL ECH; e, 1 mmol/L MPP? in 20 lg/mL ECH; f, 1 mmol/L MPP? in 40 lg/mL ECH (lestvica, 200 lm).

Cistanche ehinakozid ima učinek zaviranja apoptoze

SH-SY5Y celična kultura

Celice SH-SY5Y so bile iz Cell Bank Šanghajskega inštituta za celično biologijo (Kitajska akademija znanosti, Šanghaj, Kitajska) in gojene v DMEM, dopolnjenem z 10 odstotki fetalnega govejega seruma, 100 U/mL penicilina in 100 U/mL streptomicina. Celice smo vzdrževali v navlaženem inkubatorju pri 37 °C s 5 odstotki CO2. MPP? raztopimo v sterilni vodi in uporabimo takoj. ECH smo raztopili v PBS. Da bi raziskali z ROS povezano gensko ekspresijo in ravni beljakovin, smo celice zasejali v 6-plošče z vdolbinicami in jih gojili 24 ur. Celice smo nato hranili s svežim medijem, ki je vseboval MPP?, ECH, kombinacijo MPP? in ECH ali sam PBS kot kontrola. Po 24 urah obdelave smo celice lizirali z 1-odstotnim SDS liznim pufrom (1-odstotni SDS, 25 mmol/L EDTA, 45 mmol/L Tris-HCl, pH 6,5) za Western blot analizo in celotno RNA izolirali neposredno z TRIzol reagent.

Za analizo porazdelitve ATF3 in CHOP po zdravljenju so bili uporabljeni kompleti reagentov za jedrsko in citoplazemsko ekstrakcijo (Thermo Fisher, Waltham, MA) za ekstrakcijo citoplazemskih in jedrnih frakcij iz z zdravili obdelanih in kontrolnih celic.

Test viabilnosti celic

Celice SH-SY5Y smo zasejali v 96-plošče z vdolbinicami in jih inkubirali čez noč. Celice smo hranili vsakih 24 ur s svežim popolnim medijem, ki je vseboval različna zdravila, in vzdrževali 3 dni. Nato je bila sposobnost preživetja ocenjena s kompletom števca celic CCK8 (Dojindo, Japonska). Podatki so bili normalizirani na rezultate iz kontrole PBS in so predstavljeni kot povprečje ± SD. Za analizo sposobnosti preživetja v ATF3-knockdown SH-SY5Y (ATF3 shRNA) in kontrolnih (GFP shRNA) celicah smo celice dodali v 96-plošče z jamicami in gojili 14–16 ur. Plazmidi ATF3 shRNA ali GFP shRNA so bili transficirani v celice SH-SY5Y z uporabo Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Celice smo obdelali z 1 mmol/L MPP? ali enako količino PBS po 24 urah transfekcije in jih nato inkubiramo 3 dni. Število celic so šteli vsak dan. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SD.

konstrukti shRNA in oligo primerji

Konstrukti pGV298-ATF3 shRNA (ATF3shRNA) in GFP kontrolni shRNA so bili iz GeneChem Co. (Šanghaj, Kitajska). Ciljno zaporedje ATF3 je bilo 50-GCAAAGT G!CCGAAACAAGA-30 iz predhodno opisanih metod [17, 18]. Za odkrivanje genske ekspresije, ki jo povzroča MPP?, so bili za qRT-PCR izbrani geni ROS, povezani s stresom in PD, GAPDH pa je bil uporabljen kot kontrola. Vse primerje je sintetiziral Sangon Biotech Co. (Šanghaj, Kitajska), sekvence primerjev pa so navedene v tabeli 1.

PCR v realnem času

Celotno RNA smo ekstrahirali z reagentom TRIzol v skladu z navodili proizvajalca. Reverzna transkripcija in kvantitativni PCR v realnem času (qRT-PCR) sta bila izvedena, kot je opisano prej. Reakcija reverzne transkripcije je bila izvedena z uporabo kompleta RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Scientific, Waltham, MA) v skladu z navodili proizvajalca. Komplet SYB Premix Ex Taq II (TaKaRa, Dalian, Kitajska) je bil uporabljen za qRT-PCR: 20-lL reakcijskih sistemov je bilo uporabljenih z ABI (Life Technologies, Carlsbad, CA). Parametri PCR so obsegali naslednje korake: 95°C 3 min, 1 cikel; 95C za 5 s in 60C za 40 s, 40 ciklov. Končni podatki niso bili

moralizirani na GAPDH in so predstavljeni kot razmerje do kontrole. Primerji, uporabljeni za pomnoževanje, so navedeni v tabeli 1.

Western Blotting

Western blot analiza je bila izvedena, kot je opisano prej [19]. Primarna protitelesa so bila anti-razcepljena kaspaza 3 in p53 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-GAPDH (Proteintech Group, Chicago, IL), anti-GADD153/CHOP (Wanlei Bio, Shenyang, Kitajska) in anti- ATF3, anti-PARP, anti-PUMA in anti-histone 3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Sekundarna protitelesa, označena s peroksidazo hrena, so bila iz Jackson Immune Research Laboratories (Western Grove, PA). Membrane PVDF so bile iz EMD Millipore (Billerica, MA), substrat ECL pa iz CWBio (Suzhou, Kitajska). Relativne ravni beljakovin na podlagi ravni sivine na sliki so bile analizirane s programsko opremo Tanon GIS (Tanon Biotech, Šanghaj, Kitajska), podatki pa so predstavljeni kot razmerje med ciljno beljakovino in GAPDH.

Cistancheehinakozidima učinek zaščite jeter