1. del: Učinek akteozida kot zaščitnika celic za proizvodnjo kloniranega psa

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1, Eun Young Kim1, Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1, Kil Woo Han1, Kang-Sun Park1, Kyung-Bon Lee2, Min Kyu Kim1*

1 Division of Animal & Dairy Science, College of Agriculture and Life Science, Chungnam National University, Daejeon, Republika Koreja,

2 Oddelek za biološko izobraževanje, Pedagoška šola,Državna univerza Chonnam, Gwangju, Republika Koreja

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Kliknite tukaj za 2. del

Povzetek

Prenos jedra somatskih celic (SCNT) je dobro znana laboratorijska tehnika. Načelo SCNT vključuje reprogramiranje somatskega jedra z injiciranjem somatske celice v prejemno jajčno celico, katere jedro je bilo odstranjeno. Zato se celice darovalci jedra štejejo za ključni dejavnik pri SCNT. Sinhronizacijo celičnega cikla celic darovalcev jedra na stopnji G0/G1 je mogoče inducirati s kontaktno inhibicijo ali stradanjem seruma. V tej študiji,akteozid, fenilpropanoidno glikozidno spojino, so raziskali, da bi ugotovili, ali je uporabna za indukcijo sinhronizacije celičnega cikla, citoprotekcijo in izboljšanje učinkovitosti SCNT v fibroblastih pasjega ploda. Primarni pasji fetalni fibroblasti so bili zdravljeni zakteozid(10, 30, 50 μM) za različna časovna obdobja (24, 48 in 72 ur). Sinhronizacija celičnega cikla na stopnji G0/G1 se ni bistveno razlikovala glede na metodo indukcije:akteozidzdravljenje, inhibicija stika ali stradanje seruma. Vendar pa je od teh treh zdravljenj serumsko stradanje povzročilo znatno povečano raven reaktivnih kisikovih vrst (ROS) (99,5 ± 0,3 odstotka) in apoptozo. To so pokazali tudi rezultatiakteozidzmanjšana ROS in procesi apoptoze, vključno z nekrozo v fibroblastih pasjega ploda, in izboljšano preživetje celic. Fibroblasti pasjega ploda, zdravljeni zakteozidso bili uspešno aretirani na stopnji G0/G1. Poleg tega so rekonstruirani zarodki z uporabo celic darovalcev jedra, zdravljenih z akteozidom, proizvedli zdravega kloniranega psa, ne pa tudi zarodki, proizvedeni z uporabo celic darovalcev jedra, izpostavljenih kontaktni inhibiciji. V zaključku,akteozidinducirana sinhronizacija celičnega cikla celic darovalca jedra bi bila alternativna metoda za izboljšanje učinkovitosti pasjega SCNT zaradi njegovih citoprotektivnih učinkov.

Cistanche acteoside lahko poveča imuniteto

Uvod

Tehnika SCNT je bila uporabljena za proizvodnjo genetsko boljših ali manipuliranih živali za kmetijske namene in kot biomedicinske vire. Z naraščajočo potrebo po živalskih modelih bolezni, reševanju živali, ki jim grozi izumrtje, matičnih celicah za regenerativno medicino, presaditvah organov itd., se zanimanje za kloniranje živali z uporabo SCNT v zadnjem času povečuje [1–5]. Čeprav je bila proizvodnja kloniranih živali uspešna, je učinkovitost SCNT še vedno zelo nizka [6]. Vzroki za nizko razvojno sposobnost zarodka SCNT vključujejo številne dejavnike, ki so povezani s kakovostjo prejemnih jajčnih celic, kakovostjo celic darovalca jedra in stanjem nadomestne matere [7–10].

Znano je, da so reaktivne kisikove vrste (ROS) in apoptoza vključene v reproduktivne procese pri ženskah, vključno z razvojem oocitov in vivo in in vitro [11–14]. ROS prekinejo razvoj zarodka z induciranjem citoplazemske kondenzacije, poškodbe DNA in apoptoze v zarodkih. Podporne študije so poročale, da zmanjšanje ROS izboljša sposobnost razvoja zarodka SCNT med kulturo in vitro [15–17]. Apoptoza je fiziološki proces, ki se pojavi spontano med normalnim predimplantacijskim razvojem zarodka za vzdrževanje celične homeostaze z odstranjevanjem poškodovanih/nedelujočih celic DNK. ROS povzroča fragmentacijo DNK in poveča apoptotične blastomere, ki motijo ​​razvoj zarodka. Dogodek ROS in apoptoze opazimo pogosteje po SCNT kot po in vitro oploditvi [18, 19]. Številne študije so poročale, da se sposobnost SCNT za razvoj zarodkov reši z zmanjšanjem ravni ROS in apoptoze z uporabo antioksidantov, kot so selen [20], insulin-transferin-selen [17, 21], melatonin [22] in glutation [23].

Prejšnje študije so poročale, da je uporaba donorskih celic, aretiranih na stopnji G{{0}}/G1, izboljšala učinkovitost SCNT [7, 9, 24–28]. Kromatin v donorskih celicah na stopnji G0/G1 velja za najučinkovitejšega za sposobnost SCNT za razvoj zarodka. Za sinhronizacijo donorskega celičnega cikla so pogosto uporabljali inhibicijo stika, serumsko stradanje in kemično zdravljenje [7, 25, 29, 30]. Vendar pa stradanje v serumu zmanjša preživetje celic in poveča fragmentacijo DNA, kar vodi do apoptoze [31]. Kemična inhibicija je še ena strategija za zaustavitev celičnega cikla na stopnji G0/G1 z uporabo inhibitorjev, kot so roskovitin [29, 32], dimetil sulfoksid (DMSO) [33] in cikloheksimid (CHX) [34]. Na učinkovitost metode, uporabljene za sinhronizacijo, vplivajo vrste in vrste celic darovalcev. Za optimalno sinhronizacijo donorskih celic je treba skrbno ovrednotiti različne vidike uporabljenih metod.

Akteozid(znan tudi kot verbaskozid) [{{0}}(3, 4-dihidroksi fenil etil)-1-OaL-ramnopiranozil-(1 / 3)-bD-({{13} }O-caffeoyl)-glucopyranoside] je izoliran iz vijoličnih cvetov Syringa vulgaris. Znano je, da imajo rastline, ki vsebujejo akteozid, protimikrobno in protiglivično delovanje [35–37] ter preprečujejo vnetja. Dejansko ima akteozid različne biološke aktivnosti in vitro in in vivo, kot so antioksidativna aktivnost, anti-apoptotična aktivnost, citotoksičnost proti različnim tumorskim celicam in sinhronizacija celičnega cikla na stopnji G0/G1 kot od ciklina odvisna zaviralec kinaze (CDK) [38]. Na primer Lee et al.[38] poročali, da lahko zdravljenje z akteozidom zavre proliferacijo celic človeške promielocitne HL-60 levkemije z induciranjem zaustavitve celičnega cikla na stopnji G0/G1. Vendar je treba učinek z akteozidom obdelanih donorskih celic na učinkovitost pasjega SCNT še raziskati.

V tej študiji so učinkiakteozido sinhronizaciji celičnega cikla, ROS inapoptozana pasjih fetalnih fibroblastih. Analiza sinhronizacije celičnega cikla, ROS in apoptoze je bila izvedena z uporabo fluorescenčno aktiviranega razvrščanja celic (FACS). Da bi dokazali učinkovitost donorskih celic, zdravljenih z akteozidom, so zarodke SCNT gojili in prenesli v psa prejemnika ter uspešno proizvedli zdravega kloniranega psa.

cistanchelahko zdraviledvicabolezen se izboljšaledvičnafunkcijo

Materiali in metode

Etična izjava

V tej študiji je bilo 44 samic mešančkov (starih od 1 do 6 let) uporabljenih kot darovalci jajčnih celic in nadomestki za prenos zarodkov, samica beagla (stara 2 leti) pa je bila uporabljena za vzpostavitev fetalnih celičnih linij fibroblastov. Vse poskuse na živalih je odobril Institucionalni odbor za nego in uporabo živali (IACUC) Nacionalne univerze Chungnam (številka odobritve: CNU-00487) in izvedeni v skladu z "Vodnikom za nego in uporabo laboratorijskih živali", ki ga je objavil IACUC nacionalne univerze Chungnam. Pse so gojili v zaprtih prostorih v ločenih kletkah s sistemom za nadzor temperature in prezračevanja. Pse so enkrat na dan hranili s komercialno hrano in jim zagotavljali vodo ad libitum. V vseh poskusih na živalih so bili psi na začetku anestezirani s 6 mg/kg ketamina in ksilazina in vzdrževani v stanju anestezije z 2-odstotnim izofluranom. Na koncu operacije so dajali antibiotike (prokain penicilin G, benzatin penicilin G in dihidrostreptomicin sulfat), da bi preprečili morebitno okužbo. Po operaciji so bili psi premeščeni v njihove lastne kletke s sladko vodo, nadzorovani in zagotovljena posebna oskrba s strani odgovornega veterinarja, tako da so živalim lahko dali potrebna zdravljenja, če so jih potrebovale.

Kemikalije

Vse kemikalije so bile kupljene pri Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, ZDA), razen če je navedeno drugače. Acteoside je bil pridobljen iz Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd. na Kitajskem.

Izolacija fibroblastov pasjega ploda

Fibroblasti pasjega ploda so bili pridobljeni iz {{0}} dni starih fetusov. Na kratko, samica beagla je bila umetno oplojena s spermo samca beagla. Po 28 dneh smo pri samici beagla potrdili brejost in s celiohisterektomijo pridobili 5 plodov. Fetuse smo trikrat izprali v fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (PBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, ZDA). Glava, notranji organi in okončine fetusov so bili odstranjeni s kirurškim rezilom, preostali deli telesa pa so bili zmleti v PBS. Kose fetusov smo dvakrat sprali s centrifugiranjem pri 400 × 5 minut in gojili v Dulbeccovem modificiranem Eagleovem mediju (DMEM; Gibco), dopolnjenem z 1 odstotkom penicilin-streptomicina (št. izdelka P4458) in 20 odstotki fetalnega govejega seruma (FBS; Gibco). pri 39 stopinjah v vlažnem ozračju 5 odstotkov CO2 in 95 odstotkov zraka. Ko so celice po 5–7 dneh dosegle sotočje, so bile 2 minuti obdelane z 0,25-odstotnim tripsinom-EDTA (Gibco) in pobrane. Dve celični liniji fibroblastov pasjega ploda sta bili vzpostavljeni iz dveh posameznih plodov. Celice smo zamrznili v 10-odstotnem DMSO v FBS in shranili v tekočem dušiku pri -196 stopinjah, dokler jih nismo uporabili.

Zdravljenje celic

Zamrznjene pasje fibroblaste smo odmrznili in gojili do 80-odstotne konfluence. Celice so bile pobrane in pasirane 4- do 7-krat za nadaljnje poskuse. Celice smo zasejali pri koncentraciji 106/mL v 60 mm posodice za kulture. Celice smo pet dni gojili v (1) DMEM, dopolnjenem z 10 odstotki FBS in 1 odstotkom penicilin-streptomicina (kontaktna inhibicija), (2) DMEM, dopolnjenem z 0,5 odstotka FBS in 1 odstotkom penicilin-streptomicina (serumsko stradanje). , ali (3) DMEM, dopolnjen z 10 odstotki FBS in 1 odstotkom penicilin-streptomicina, ki vsebuje akteozid pri 10 μM, 30 μM ali 50 μM za 24 ur, 48 ur in 72 ur (zdravljenje z akteozidom).

Analiza celičnega cikla s pretočno citometrijo

Za analizo stopenj celičnega cikla smo celice pobrali z uporabo {{0}}.25 odstotkov tripsina-EDTA in 3-krat sprali s PBS s centrifugiranjem. Po zadnjem izpiranju smo supernatante zavrgli in celice resuspendirali v 0.3 ml PBS. Za fiksacijo smo celični suspenziji po kapljicah dodali {{10}}.7 ml hladnega absolutnega etanola, premešali z nežnim vrtinčenjem in shranili čez noč pri 4 stopinjah. Fiksirane celice smo centrifugirali in dvakrat sprali s hladnim PBS. Celice smo resuspendirali v 0,25 mL PBS, dopolnjenem s 5 μL 10 mg/mL RNaze in inkubirali 1 uro pri 37 stopinjah. Nato smo dodali 10 μl 1 mg/ml propidijevega jodida (PI). Celični cikel smo analizirali s kvantitacijo vsebnosti DNA v celičnih populacijah v fazah G0/G1 (2n), S (med 2n in 4n) in G2/M (4n) z uporabo pretočnega citometra FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA). , ZDA).

Odkrivanje ROS s pretočno citometrijo

ROS v živih celicah je bil ocenjen z uporabo kompleta Image-iT™ Live Green Reactive Oxygen Species Detection Kit (Molecular Probes, Eugene, OR, ZDA). Na kratko, celice smo po odstranitvi gojišča sprali v PBS in dodali 2 mL 100 μM terc-butil hidroperoksida (TBHP) delovne raztopine. Po 1-urni inkubaciji pri 37 stopinjah smo delovno raztopino TBHP odstranili in celice 3-krat nežno sprali v topli Dulbeccovi fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (DPBS; Gibco). Celice smo nato inkubirali v delovni raztopini 25 μM 5-(in-6)-karboksi-2,7-diklorodihidrofluorescein diacetata (karboksi-H2DCFDA) pri 37 stopinjah 30 minut v temi. . Ko je oksidiran, karboksi-H2DCFDA oddaja zeleno fluorescenco, kar olajša oceno ROS s pretočno citometrijo. Kot pozitivno kontrolo smo uporabili TBHP, ki je induktor proizvodnje ROS. Jedra celic so bila obarvana s Hoechst 33342. Po 3-kratnem izpiranju s PBS so bile celice pobrane s tripsinizacijo, suspendirane v PBS in uporabljene za odkrivanje ROS z uporabo pretočnega citometra FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, ZDA). ). Hitrost tvorbe ROS smo izračunali tako, da smo število ROS pozitivnih celic delili s skupnim številom celic in vrednosti pretvorili v odstotke.

Analiza apoptoze s pretočno citometrijo

Analiza apoptoze je bila izvedena z uporabo Vybran1 Apoptosis Assay Kit #2 (Molecular Probes, Eugene, OR, ZDA). Na kratko, celice smo pobrali s tripsinizacijo in 2-krat sprali s hladnim PBS. Nato smo celicam dodali 100 μL 1× pufra za vezavo aneksina, 5 μL Alexa Fluor 488 aneksina V in 1 μL PI. Po 15-minutni inkubaciji pri sobni temperaturi smo dodali 400 μL 1 × pufra za vezavo aneksina in celično suspenzijo nežno premešali. Aneksin V, ki je od Ca2 plus odvisen protein, ki veže fosfolipide, ima visoko afiniteto za fosfatidilserin (PS). V živih celicah se PS nahaja na notranji citoplazemski membrani in se v apoptotičnih celicah prenese na zunanjo citoplazemsko membrano. Apoptotične celice se razlikujejo po aneksinu V, označenem z Alexa Fluor 488, ki se veže na PS na zunanji membrani. Poleg tega PI, ki je barvilo, ki veže nukleinsko kislino, obarva nekrotične celice z rdečo fluorescenco. Zato so bile apoptotične celice z zeleno fluorescenco, nekrotične celice z rdečo fluorescenco in žive celice z malo ali nič fluorescence v celicah analizirane s pretočnim citometrom FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, ZDA). Stopnje so bile izračunane z deljenjem števila celic živih, nekrotičnih ali apoptotičnih celic s skupnim številom celic in pretvorbo izračunanih vrednosti v odstotke.

Zbiranje in vivo zrelih jajčnih celic

Za odkrivanje ovulacije pri vsakem psu je bila koncentracija progesterona (P4) v serumu izmerjena z uporabo DSL-3900ACTIVE progesterone Coated-tube Radioimmunoassay Kit (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX, ZDA). Kot je bilo že opisano [39, 40], se je dan, ko je koncentracija P4 presegla 4 ng/ml, štel za dan ovulacije. 72 ur po ovulaciji so jajčne celice odvzeli z laparotomijo z uporabo aseptičnih kirurških postopkov. Fimbriji jajcevoda smo pristopili skozi režo burze in kanilirali z obrnjeno prirobljeno jekleno iglo (18 G, 7,5 cm). Intravenozni (IV) kateter velikosti 24 (Angiocath™ Plus, Becton Dickison Korea Inc., Seul, Koreja) je bil vstavljen v prežico jajcevoda blizu uterotubalnega stika in medij 199 (Gibco), dopolnjen z 1 odstotkom penicilin-streptomicin in 5-odstotni FBS je bil uveden v jajcevod skozi IV kateter. Oocite smo takoj prepeljali v laboratorij. Skupno je bilo zbranih 316 jajčnih celic pri 31 psih.

Prenos jedra somatskih celic in prenos zarodkov SCNT sta bila izvedena, kot je opisano prej [39]. Na kratko, za odstranitev kumulusnih celic iz in vivo zrelih jajčnih celic smo komplekse kumulus-oocit (COC) ponavljajoče pipetirali v 0.1-odstotni hialuronidazi. Prvo polarno telo in kromosomi metafaze-II so bili odstranjeni z aspiracijo. Enukleacijo smo potrdili z barvanjem s Hoechst 33342 (bisbenzimid). Fibroblasti pasjega ploda so bili 48 ur obdelani s 30 μM akteozidom in nato pobrani s 0.25 odstotki tripsina-EDTA. Posamezna celica, ki ima gladko celično membrano, je bila prenesena v perivitelinski prostor vsakega enukleiranega oocita. Skupki so bili uravnoteženi infuzijski medij, ki je 0.26 M medij manitola, ki vsebuje 0.1 mM HEPES, 0.5 mM MgSO4 in 0,05 odstotka BSA, in spojen z dvema impulzoma enosmernega toka (69–75 V za 15 μs) iz aparata Electro-Cell Fusion (NEPA gene Co., Chiba, Japonska). Te kuplete smo inkubirali v mediju 199, dopolnjenem z 10 odstotki FBS 1 uro in 30 minut. Spojene SCNT zarodke smo preverili in inducirali kemično aktivacijo z inkubacijo v 10 μM kalcijevem ionoforju (št. produkta C7522, Sigma) 4 minute. Zarodki SCNT so bili oprani in nato za 3 ure in 30 minut dani v modificiran sintetični oviduktalni tekoči medij (mSOF) [41], ki je vseboval 1,9 mM 6-dimetilaminopurina (6-DMAP). Ustvarjeni zarodki so bili kirurško preneseni v jajcevode nadomestkov, sinhroniziranih z estrusom, v 4 urah po SCNT. Nosečnost je bila potrjena z ultrazvokom 26 dni (najprej) po prenosu zarodka.

aktivna sestavinaakteozidvcistanche

In vitro kultura kloniranih zarodkov

Po SCNT so klonirane zarodke gojili v 40 μL mikrokapljicah modificiranega sintetičnega oviduktalnega tekočega medija (mSOF) (10 kloniranih zarodkov na mikrokapljico), prekritega z mineralnim oljem pri 38,5 stopinjah v 5 odstotkih CO2 in 95 odstotkih zraka. Razvoj zarodka SCNT so opazovali od 2. do 8. dne.

Analiza mikrosatelitov in mitohondrijske DNA kloniranega psa

Celotno DNK smo ekstrahirali iz celic darovalcev jedra in kože psov darovalcev jajčnih celic, nadomestnih psov in kloniranega psa s kompletom za ekstrakcijo genomske DNA G-spin™ (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Seongnam, Koreja) v skladu s smernicami proizvajalca, in nato eluiran v 100 μL pufra TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). Količino DNK smo izmerili s spektrofotometrom BioSpec-nano (Shimadzu Corp., Japonska).

Za mikrosatelitno genotipizacijo je bilo izbranih naslednjih 7 specifičnih genov: PEZ1, PEZ3, PEZ8, PEZ12, FH2010, FH2054 in FH2079. PCR smo izvedli z začetno denaturacijo 10 minut pri 95 stopinjah, 20 ciklov, ki jih je sestavljalo denaturacijo 30 sekund pri 95 stopinjah, 30 sekund žarjenja pri 58 stopinjah (-0.1 stopinja/cikel), 1 minuto podaljšanja pri 72 stopinj in še 15 dodatnih ciklov, sestavljenih iz denaturacije za 30 sekund pri 95 stopinjah, 30 sekund žarjenja pri 56 stopinjah, 1 minute podaljšanja pri 72 stopinjah in končnega podaljšanja pri 72 stopinjah za 10 minut.

Za sekvenciranje mitohondrijske DNA z uporabo popolnih nukleotidnih zaporedij pasje mtDNA (pristopna št. GenBank: U96639) so bili sintetizirani naslednji oligonukleotidni primerji: regija citokroma b (L14,252 –L14,631) F: ACTCATTCATTGACCTCCCAGCG,R: AGTTCCGATATAAGGGATGGCAGAG; Podenota citokrom c oksidaze II (L7,054—L7,465) F: ATGGCGTACCCATTTCAACT,R: GGATGGTTATTTCTATTGG; 16S rRNA (L2,033 –L2,472) F: GCAAAGGTAGCATAATCAT,R: AGGACTTTAATCGTTGAAC; Območje D-zanke (L15,622 – L16,030) F: CATAGGACATATTAACTCAATC,R: AAGTCCAGCTACAAGTTATTTG [42]. Cikli PCR za to analizo so vključevali: 95-stopinjske začetne denaturacije za 5 minut, 5 ciklov denaturacije za 30 sekund pri 95 stopinjah, 40 sekund žarjenja pri 60 stopinjah (-1 stopinj/cikel), 1 minuto podaljšanja pri 72 stopinj in naslednjih 30 ciklov denaturacije za 30 sekund pri 95 stopinjah, 40 sekund žarjenja pri 55 stopinjah, 1 minuta podaljšanja pri 72 stopinjah in končno podaljšanje pri 72 stopinjah za 10 minut. Fragmente PCR iz različnih poskusov smo analizirali z uporabo genetskega analizatorja ABI Prism 3100 (Applied Biosystems Inc., ZDA). Sestavljanje zaporedja, več poravnav in obrezovanje poravnave za kontrolne regije so bili izvedeni s programsko opremo BioEdit (v.7.0.5.3).

akteozidvcistanchelahko okrepi imunski sistem