Galektin-3 ima antinekroptotične in antiapoptotične učinke pri akutni tubularni nekrozi, ki jo povzroči cisplatin

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Suhail Al-Salama et al

Cistanche tubulosa odmerjanje za ledvično bolezen, kliknite tukaj za vzorec

Povzetek

Ozadje/cilji:Akutnaledvicapoškodba (AKI) je breme javnega zdravja s povečano obolevnostjo, umrljivostjo in stroški zdravstvene oskrbe. Je povezana s povečanim tveganjem za nastanek kroničneledvicabolezen in smrt. Akutna tubularna nekroza (ATN) je najpogostejši vzrok AKI. Apoptoza in nekroza tkiva imata pomembno vlogo pri ATN. Znano je, da ima galektin 3 (GAL-3), lektin, ki veže beta galaktozid, vlogo pri vnetju, apoptozi in oksidativnem stresu, vendar njegova vloga pri akutni tubularni nekrozi, ki jo povzroči cisplatin, ni jasno pojasnjena.

Metode:Samci miši C57B6-J in C57BL-6 –GAL-3 so bili uporabljeni za induciranje ATN z uporabo cisplatinskega mišjega modela akutne tubularne nekroze. Ekspresija GAL-3, apoptotični, nekrotični in nekroptotični proteini vledvicemerili s standardnimi tehnikami histološkega, imunohistokemičnega in encimsko imunskega testa. Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SE Statistično pomembne razlike (str<0.05) were="" calculated="" between="" experimental="" groups="" and="" corresponding="" control="" groups="" by="" one-way="" analysis="" of="">

Rezultati:Prišlo je do znatnega povečanja GAL-3 vledvicedivjih miši GAL-3, zdravljenih s cisplatinom, v primerjavi s kontrolnimi mišmi. Poleg tega so bili vledvicemiši GAL-3 KO, zdravljenih s cisplatinom, kot pri divjih miših GAL-3, zdravljenih s cisplatinom. Podobno so bile znatno višje ravni proteinov nekroptoze RIPK1, RIPK3 in MLKL vledvicemiši GAL-3 KO, zdravljenih s cisplatinom, kot pri divjih miših GAL-3, zdravljenih s cisplatinom. Poleg tega so bile znatno višje ravniledvicapro-apoptotične beljakovine; cepljene kaspaze-3, cepljene PARP, TRAIL in FAS pri miših GAL-3 KO, zdravljenih s cisplatinom, v primerjavi z divjimi mišmi GAL-3, zdravljenimi s cisplatinom.

Zaključek:GAL-3 lahko vpliva na celično preživetje in smrt s svojo interakcijo z nekroptotičnimi, apoptotičnimi in pro-preživetnimi proteini v ledvičnih tubulih med akutno tubulno nekrozo, ki jo povzroči cisplatin.

Ključne besede: Ledvica• Akutna tubularna nekroza • Cisplatin • Galektin-3 • Nekroptoza • Apoptoza

Uvod

Akutnaledvicaza poškodbo (AKI) je značilno nenadno zmanjšanjeledvicadelovanje, ki temelji na zvišanju ravni serumskega kreatinina, zmanjšanem izločanju urina, potrebi po nadomestnem zdravljenju ledvic ali kombinaciji teh dejavnikov [1].

TheLedvicaSmernice za klinično prakso KDIGO (Disease Improving Global Outcome) za AKI opredeljujejo AKI bodisi kot povečanje serumskega kreatinina za več kot ali enako 0,3 mg/dl (več ali enako 26,5 µmol/l) znotraj 48 ur; ali zvišanje serumskega kreatinina na več kot ali enako 1,5-kratniku izhodiščne vrednosti, za katerega je znano ali se domneva, da se je zgodilo v zadnjih 7 dneh; ali količino urina<0.5 ml/kg/h="" for="" 6="" hours="">

Akutna tubularna nekroza (ATN) je pogost vzrok AKI [3]. Ishemični in nefrotoksični napadi so glavni vzroki za ATN [3]. Kljub obsežnim študijam o ATN, ki vključujejo celično poškodbo, celično smrt in regeneracijo, osnovni mehanizmi niso jasno opredeljeni.

Apoptoza je oblika programirane celične smrti, ki jo posredujejo kaspaze. Pomembna poročila so pokazala, da ima apoptoza pomembno vlogo pri ATN [3, 4]. Po drugi strani pa je nekroza oblika celične smrti, za katero je značilna zgodnja permeabilizacija plazemske membrane, otekanje organelov in razpad celične vsebine [5]. Nekroza se pogosto pojavi, ko so celice izpostavljene prekomernemu zunanjemu stresu. Nekroza je bila tradicionalno obravnavana kot pasivna in neprogramirana; zato je bilo zelo malo truda vloženega v raziskovanje mehanizma nekroze, kljub njeni razširjenosti pri človeških boleznih [5]. Dobro poznana vrsta nekroze je nekroptoza [5]. Nekroptoza je programirana neapoptotična celična smrt, ki jo povzročijo številni zunajcelični dražljaji, kot je faktor tumorske nekroze (TNF) [5]. Prvotno je bil opredeljen kot celična smrt, za katero je značilna morfologija nekrotične celične smrti s sočasno aktivacijo serin/treonin-protein kinaze 1 (RIPK1), ki deluje z receptorji. RIPK1 aktivira serin/treonin-protein kinazo 3 (RIPK3), ki deluje z receptorjem, da tvori kompleks, ki se imenuje nekrosom [6]. Kasneje aktivirani RIPK3 pridobi sposobnost fosforilacije in aktiviranja domene podobne kinaze mešane linije (MLKL) [6]. Fosforilirane molekule MLKL so sposobne tvoriti oligomere za olajšanje njihove translokacije na celično membrano z vezavo na fosfatidilinozitolne lipide in kardiolipin. Translocirani oligomeri MLKL delujejo kot kanali v celični membrani, da inducirajo dotok natrija in iztok kalijevih ionov [7] ali alternativno dotok kalcijevih ionov [8]. Na oba načina bo to povzročilo nekrotično celično smrt zaradi permeabilizacije in razpoke plazemske membrane, kar bo povzročilo razlitje znotrajcelične vsebine v organ.

V tem projektu smo uporabili cisplatin (Cis) za induciranje akutne tubularne nekroze. Cis ima širok spekter protitumorskih učinkov in se uporablja za zdravljenje različnih malignih tumorjev [9]. Kljub temu je nefrotoksičnost glavni stranski učinek in je značilna nekroza ledvičnih tubulnih celic, poškodba tkiva, ledvična disfunkcija in akutnaledvicaokvara [10]. Kljub različnim ukrepom, ki so bili sprejeti za premagovanje poškodbe ledvic, skoraj 4–23 odstotkov bolnikov prizadene AKI [11]. Znani mehanizmi s cisplatinom povzročene ledvične poškodbe vključujejo apoptozo, oksidativni stres in vnetni odziv zaradi neposredne poškodbe epitelijskih celic ledvičnih tubulov in ledvičnih žil [12].

Galektin-3 (GAL-3), 35 kDa protein, je edinstvena himera, ki ima eno C-terminalno domeno za prepoznavanje ogljikovih hidratov (CRD), povezano z dolgo N-terminalno domeno (ND) [13 ].GAL-3 najdemo na celični površini, citoplazmi in jedru celic ter v zunajceličnem matriksu [13].

Znotrajcelični GAL-3 je bil vključen v celično proliferacijo in anti-apoptotične mehanizme [14, 15]. Vpliva na proteine ​​K-Ras in Akt in tako uravnava tudi preživetje diferenciacije in smrt [14, 15]. Medtem ko zunajcelični GAL-3 posreduje medcelično adhezijo, interakcijo celica-matriks in signalizacijo, vnetje in apoptozo [16].

Pokazalo se je, da se GAL-3 po izpostavitvi apoptotičnim dražljajem translocira iz citosola ali iz jedra v mitohondrije in blokira spremembe v potencialu mitohondrijske membrane, s čimer preprečuje apoptozo [17]. Študije so tudi pokazale, da lahko GAL-3 zavira apoptozo, ki jo povzroči TNF, z aktivacijo AKT [18]. Druge študije so pokazale, da sta GAL-3 in Beclin1 vključena v dve usklajeni poti programirane celične smrti, apoptozo in avtofagijo [18]. V tem projektu domnevamo, da ima GAL-3 zaščitno vlogo na epiteliju ledvičnih tubulov pri akutni tubularni poškodbi. Uporabili smo mišji model akutne tubularne poškodbe, da bi raziskali zaščitno vlogo GAL-3 pri akutni tubularni poškodbi, povzročeni s cisplatinom, z merjenjem ledvičnih funkcij (plazemska sečnina in kreatinin),ledvicaproteini nekroptoze (RIP-1, RIP-3 in MLKL), proteini nekroze (katepsin D in katepsin B), proteini apoptoze (razcepljena kaspaza-3, razcepljeni PARP, TRAIL in FAS) in označevalci preživetja celic (p-NF-κB, beta-katenin in Wnt), z uporabo standardnega encimsko vezanega imunskega testa, biokemičnega analizatorja, histoloških in imunohistokemičnih postopkov.

Materiali in metode

Uporabili smo mišji eksperimentalni model akutnegaledvicapoškodba, ki je bila obširno opisana v literaturi in uporabljena za preučevanje akutnegaledvicapoškodbe v laboratorijih po vsem svetu [19].

Mišji model akutne tubularne nekroze

Uporabljene so bile miši C57BL/6 in C57BL/6 –GAL-3 knock-out (KO), ki tehtajo 25-30 g. Miši so vzdrževali na standardni dieti. Miši so bile vsaj 1 teden pred dajanjem cisplatina nastanjene po pet miši na kletko pod razporedom 12-h svetlobe in teme.

Cisplatin (EBEWE Pharma GmbH Nfg. KG, Unterach, AVSTRIJA) je bil sveže uporabljen na dan dajanja v koncentraciji 0,5 mg/ml. Miši so dobile bodisi 30 mg/kg telesne teže cisplatina [11] bodisi vehikel (normalna fiziološka raztopina) intraperitonealno (IP), po katerem so miši ponovno imele prost dostop do hrane in vode. Metoda evtanazije se je začela z intraperitonealno injekcijo anestetikov, ki je vključevala kombinacijo ketamina (100 mg/kg) in ksilazina (10 mg/kg), nato so odstranili ledvice in 96 ur po dajanju cisplatina odvzeli vzorce krvi. Kri je bila zbrana v EDTA vacutainers.Ledvicenato resecirali, sprali v ledeno mrzli fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (PBS), ena polovica vsake ledvice je bila takoj zamrznjena v tekočem dušiku in kasneje shranjena v zamrzovalniku pri -80 stopinjah. Drugo polovico smo takoj 24 ur fiksirali v 10-odstotno pufrsko formalno fiziološko raztopino. Zbrano kri smo centrifugirali pri 3000 RPM 15 minut. Plazmo smo zbrali, alikvotirali in shranili pri -80 stopinjah do nadaljnje analize.

Obdelava vzorcev za ekstrakcijo beljakovin

Celotne beljakovine so bile ekstrahirane izledvicavzorce s homogenizacijo z liznim pufrom in zbiranjem supernatanta po centrifugiranju. Za skupni celični lizat so vzorce ledvic odmrznili, stehtali in dali v hladen pufer za lizo, ki je vseboval 5{{20}} mM Tris, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 3 mM EDTA, 20 mM -glicerofosfat, 25 mM NaF, 1 odstotek Triton X-100, 10 odstotek m/v glicerola in tableta inhibitorja proteaze (Roche Complete inhibitor protease koktajl tablete). Ledvice smo homogenizirali na ledu s homogenizatorjem (IKA T25 Ultra Turrax). Vzorce smo nato centrifugirali pri 14000 RPM 15 minut pri 4 stopinjah, zbrali supernatant, alikvotirali in shranili pri -80 stopinjah do nadaljnje analize. Ekstrakcija jedrskih in citoplazemskih beljakovin je bila izvedena po protokolu, opisanem drugje [19]. Na kratko, vzorce ledvic smo odmrznili na ledu, stehtali in homogenizirali na ledu s pufrom, ki je vseboval Tris HCl 10 mmol/l, CaCl2 3 mmol/l, MgCl2 2 mmol/l, EDTA 0,1 mmol/l , Fenilmetansulfonil fluorid (PMSF) 0,5 mmol/l, saharoza 0,32 mmol/l, ditiotreitol (DTT) 1 mmol/l, nonidet P-40 (NP-40) 0,5 odstotka in koktajl zaviralcev proteaz 1 odstotek. Homogenate centrifugiramo pri 800 RPM 10 minut. Supernatant smo odstranili in hranili kot citoplazemske frakcije. Pelet smo dvakrat sprali s homogenizacijskim pufrom brez NP-40 in resuspendirali s pufrom z nizko vsebnostjo soli, ki je vseboval HEPES 20 mmol/l, MgCl2 1.5 mmol/l, KCl 20 mmol/l, EDTA 0,2 mmol /l. Glicerol 25 odstotkov, PMSF 0,5 mmol/l in DTT 0,5 mmol/l. Po inkubaciji na ledu 5 minut, enako količino pufra z visoko vsebnostjo soli, ki vsebuje HEPES 20 mmol/l, MgCl2 1.5 mmol/l, KCl 800 mmol/l, EDTA 0,2 mmol/l. Dodali smo 25 odstotkov glicerola, 0,5 mmol/l PMSF, 0,5 mmol/l DTT, NP-40 1 odstotkov in 1 odstotek koktajla zaviralca proteaz, zmes inkubirali na ledu 30 minut, centrifugirali 15 minut pri 14000 obratih na minuto. minutah pri 4 stopinjah, supernatante pa smo shranili kot jedrno frakcijo. Skupno koncentracijo beljakovin smo določili z metodo BCA beljakovinskega testa (Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit).

Obdelava vzorcev za histologijo

Ledvice so bile izrezane, sprane z ledeno mrzlim PBS in stehtane. Vsakledvicaje bil razdeljen na dve polovici in vsaka polovica je bila kaseta in fiksirana neposredno v 10-odstotnem puferskem formalinu. Odseke smo dehidrirali v naraščajočih koncentracijah etanola, očistili s ksilenom in vlili v parafin. Tri µm rezine smo pripravili iz parafinskih blokov in jih po standardnih postopkih obarvali s hematoksilinom in eozinom ter periodično kislino Schiff (PAS) [20]. Obarvane dele je ovrednotil histopatolog, ki je sodeloval pri tem projektu.

Imunohistokemija

Pet µm rezine smo deparafinizirali s ksilenom in rehidrirali z razvrščenim alkoholom. Sekcije so bile nato postavljene v Retrieval Solution z visokim pH (pH 9) v vodni kopeli pri 95 °C za 20 minut. Odseke smo nato 5 minut izpirali z destilirano vodo, nato pa 5 minut s pufrom TBST. Sekcije so bile nato 10 minut obdelane z blokom peroksidaze, čemur je sledil blok proteinov 10 minut. Odseke smo nato eno uro inkubirali pri sobni temperaturi s protitelesom proti razcepljeni kaspazi-3 (Rabbit Polyclonal, 1:300, Cell signaling technology, Danvers, MA ZDA), protitelesom proti razcepljenemu PARP (Rabbit Polyclonal, 1: 100, Cell signaling technology, Danvers, MA, ZDA), protitelo proti beta-kateninu (Rabbit Polyclonal, 1:100, Abcam, Cambridge, MA, ZDA), protitelo proti fosfo-NF-κB (Rabbit Polyclonal, 1: 100, Abcam, Cambridge, MA, ZDA), anti-Wnt-3 (Rabbit Polyclonal, 1:100, Abcam, Cambridge, MA, ZDA), anti-RIPK1 (Rabbit polyclonal, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA), anti-RIPK3 (Rabbit polyclonal, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA) in anti-MLKL 1 (Rabbit monoclonal, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA) . Po konjugaciji s primarnimi protitelesi smo rezine inkubirali s sekundarnim protitelesom (EnVisionTM Detection System, DAKO, Agilent, ZDA) 20 minut pri sobni temperaturi, čemur je sledil dodatek DAB kromogena (EnVisionTM Detection System, DAKO, Agilent, Santa Clara, CA, ZDA) in protibarvanje s hematoksilinom. Uporabljene so bile ustrezne pozitivne kontrole. Pri negativni kontroli primarno protitelo ni bilo dodano rezinam. Pozitivne in negativne kontrole so bile uporabljene v vsaki seriji obarvanih preparatov (ni prikazano na slikah).

Imunofluorescentno označevanje

Odseki s petimi μm so bili deparafinizirani s ksilenom in rehidrirani z razvrščenim alkoholom. Sekcije so bile postavljene v Retrieval Solution z visokim pH (pH 9) v vodni kopeli pri 95 stopinjah za 20 minut. Odseke smo nato 5 minut izpirali z destilirano vodo, nato pa 5 minut s pufrom TBST. Odseke smo nato inkubirali s protitelesom proti GAL-3 (Rabbit Polyclonal, 1:50, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Teksas, ZDA), anti-RIPK1 (Rabbit polyclonal, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA), anti-RIPK3 1 (Rabbit polyclonal, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA) in anti-MLKL 1 (Rabbit monoclonal, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA) čez noč pri sobni temperaturi. Odseke smo nato inkubirali z oslovskim protitelesom proti zajcem Alexa Fluor 488 (Jackson Immune Research Laboratories, Bar Harbor, Maine, ZDA, 1:100). Nazadnje so bili odseki nameščeni v DAPI-vodotopnem pritrdilnem mediju (Abcam, Cambridge, MA, ZDA) in opazovani z Olympusovim fluorescentnim mikroskopom. Uporabljeni so bili ustrezni odseki pozitivne kontrole. Za negativno kontrolo primarno protitelo ni bilo dodano rezinam in celoten postopek je bil izveden na enak način, kot je navedeno zgoraj. Pozitivne in negativne kontrole so bile uporabljene v vsaki seriji obarvanih preparatov (ni prikazano na slikah).

Morfometrična analiza

Morfometrično analizo akutne tubularne nekroze sta opravila dva raziskovalca, ki sta sodelovala v tej študiji. Morfometrična analiza razcepljene kaspaze-3, razcepljene PARP, RIPK1, RIPK3, MLKL, fosfo-NFK-B, Wnt-3, beta-katenina, izražanja v ledvičnih tubularnih celicah je bila opravljena s programsko opremo ImageJ (http: //rsbweb.nih.gov/ij/). Razcepljena kaspaza-3, razcepljeni PARP, RIPK1, RIPK3, MLKL, fosfo-NFK-B, Wnt-3, beta-katenin, označevanje je bilo določeno s štetjem števila pozitivnih celic v naključno izbrani visoki moči polja (HPF) v ledvicah. Povprečno število pozitivnih celic bo pretvorjeno iz na HPF v na mm2 (vsak mm2= 4HPF). Za označevanje cepljene kaspaze-3, cepljene PARP, RIPK1, RIPK3 in Wnt-3 so bile upoštevane celice

pozitiven, ko je bil vzorec obarvanja citoplazme. Za označevanje MLKL so celice veljale za pozitivne, če je obstajal membranski in citoplazemski vzorec obarvanja. Pri označevanju fosfo-NFK-B in beta-katenina so celice veljale za pozitivne, ko je obstajal vzorec obarvanja jedra.

Encimsko vezan imunosorbentni test

Ledvicakoncentracije GAL-3, katepsina D, katepsina B, razcepljene kaspaze-3, TRAIL in FAS so bile določene z razvojnim kompletom DuoSet encimsko vezanega imunskega testa (ELISA) (R&D Systems, Minneapolis, MN, ZDA). ) za sendvič ELISA po standardnem postopku v skladu z navodili proizvajalca. Koncentracije PARP, razcepljene z ledvicami, so bile določene s kompletom Cell signaling Technology Elisa (Danvers, MA, ZDA) za sendvič Elisa, po standardnem postopku v skladu z navodili proizvajalca. Koncentracije RIPK1, RIPK3 in MLKL v ledvicah so bile določene s kompleti MyBioSource (San Diego, CA, ZDA) Elisa za sendvič Elisa po standardnem postopku v skladu z navodili proizvajalca. Odčitki absorpcije so bili opravljeni pri 450 nm z uporabo 96- spektrofotometra na plošči z vdolbinicami (bralnik mikroplošč BioTek ELx800 Elisa, Winooski, VT, ZDA). Koncentracije GAL-3, katepsina D, katepsina B, razcepljene kaspaze-3, TRAIL, RIPK1, RIPK3, MLKL, razcepljenega PARP in FAS v vzorcih ledvic so bile določene z interpolacijo iz standardne krivulje. Ravni so bile normalizirane na skupne koncentracije beljakovin.

Statistična analiza

Vse statistične analize so bile opravljene s programsko opremo Graph Pad Prism, različica 5. Večkratne primerjave med različnimi skupinami so bile dosežene z enosmerno analizo variance (ANOVA), ki so ji sledili post hoc testi več razponov Newman Keuls. Primerjave med dvema skupinama so bile dosežene s Studentovim t-testom. Podatki so predstavljeni v povprečju ± standardna napaka (SE). Vrednosti P < 0.05="" veljajo="" za="">

Rezultati

S cisplatinom povzročena akutna tubularna nekroza

Divja skupina GAL-3, zdravljena s cisplatinom, kaže ATN, ki vključuje (67,29 odstotka ± 2,392) ledvični parenhim (slika 1) z izgubo krtačastih robov, otekanjem tubularnih celic, intratubularnimi padajočimi celicami, intratubularnimi izločki in mitozo ( Sliki 2B in 3B).

Skupina GAL-3 KO, zdravljena s cisplatinom, kaže ATN, ki vključuje (78,54 odstotka ± 0.8120) ledvični parenhim (slika 1) z izgubo krtačastih robov, otekanjem tubularnih celic, intratubularnimi padajočimi celicami, intratubularne sekrecije in mitoze (sl. 2D in 3D).

V odstotkih ATN je bistveno večjiledvicepri miših GAL-3 KO, zdravljenih s cisplatinom, kot pri divjih miših GAL-3, zdravljenih s cisplatinom (P<0.002) (fig.="">

GAL-3 se izraža v akutni tubularni nekrozi

Obstaja znatno povečanje koncentracije citoplazemske frakcije GAL-3 vledvicev divji skupini GAL-3, zdravljeni s cisplatinom (6084 ± 587,3 pg/mg), v primerjavi z divjo kontrolno skupino GAL-3 (1620 ± 62,3 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 4e).="" there="" is="" a="" significant="" increase="" in="" the="" nuclear="" fraction="" concentration="" of="" gal-3="" in="">ledvicev divjem GAL-3, zdravljenem s cisplatinom

(841,8 ± 41,11 pg/mg) v primerjavi z divjo kontrolno skupino GAL-3 (429,2 ± 39,56 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 4e).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Imunofluorescentno barvanje reprezentativnegaledvicaodsekih je pokazala znatno večjo ekspresijo GAL-3 v ledvičnih tubulih, ki jih je prizadela akutna tubularna nekroza (sl. 4B-D), v primerjavi z GAL-3 divjimi kontrolnimi mišmi (sl. 4A).

GAL-3 je anti-nekroptotični mediator

Serin/treonin-protein kinaza 1 (RIPK1) v interakciji z receptorjem. Prišlo je do pomembnega povečanja koncentracije RIPK-1 (55,33 ± 3,766 pg/mg) vledvicedivjih miši GAL-3, zdravljenih s cisplatinom, v primerjavi z divjimi kontrolnimi mišmi GAL-3 (14,22 ± 1,687 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-1="" concentration="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (39.59="" ±="" 1.808="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-1="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.33="" ±="" 3.766="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Večkratne primerjave med štirimi poskusnimi skupinami z uporabo enosmerne ANOVA, ki ji je sledil Newman-Keulsov post hoc test, so bile statistično pomembne (P<>

Imunohistokemično barvanje za RIPK-1 je pokazalo znatno večje število celic, ki izražajo RIPK-1 vledvices cisplatinom zdravljenih GAL-3 KO miši kot s cisplatinom zdravljenih GAL-3 divjih miši (P<0.001), (fig.="">

Receptorsko interakcijska serin/treonin-protein kinaza 3 (RIPK3). Prišlo je do pomembnega povečanja koncentracije RIPK-3 (616,4 ± 27,07 pg/mg) v ledvicah divjih miši GAL-3, zdravljenih s cisplatinom, v primerjavi z divjimi kontrolnimi mišmi GAL-3 (17,46 ± ± 7,002 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-3="" concentration="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (203.1="" ±="" 6.443="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-3="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="">ledvicemiši GAL-3 KO, zdravljenih s cisplatinom, kot pri divjih miših GAL-3, zdravljenih s cisplatinom (616,4 ± 27,07 pg/mg), (P<0.001), (fig.="">

Imunohistokemično barvanje za RIPK-3 je pokazalo znatno večje število celic, ki izražajo RIPK-3 v ledvicah miši GAL-3 KO, zdravljenih s cisplatinom, kot pri divjih miših GAL-3, zdravljenih s cisplatinom ( p<0.001), (fig.="" 7).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Podobna domeni kinaze mešane linije (MLKL). Prišlo je do znatnega povečanja koncentracije MLKL (71,46 ± 1,757 pg/mg) vledvicedivjih miši GAL-3, zdravljenih s cisplatinom, v primerjavi z divjimi kontrolnimi mišmi GAL-3 (23,30 ± 0,5897 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" mlkl="" concentration="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (40.30="" ±="" 1.090="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" mlkl="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (71.46="" ±="" 1.757="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" immunohistochemical="" staining="" for="" mlkl="" showed="" a="" significantly="" higher="" number="" of="" cells="" expressing="" mlkl="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice=""><0.001), (fig.="" 8).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Katepsin B. Prišlo je do znatnega povečanja koncentracije katepsina B vledvicedivjih miši GAL-3, zdravljenih s cisplatinom (55,79 ± 4,141 pg/mg), v primerjavi z divjimi kontrolnimi mišmi GAL-3 (37,99 ± 1,206 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-b="" concentration="" in="">ledvicemiši GAL-3 KO, zdravljenih s cisplatinom (85,87 ± 9,220 pg/mg v primerjavi z divjimi kontrolnimi mišmi GAL-3 (32,81 ± 1,570 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-b="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (85.87="" ±="" 9.220="" pg/mg="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.79="" ±="" 4.141="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Večkratne primerjave med štirimi poskusnimi skupinami z uporabo enosmerne ANOVA, ki ji je sledil Newman-Keulsov post hoc test, so bile statistično pomembne (P<>

Katepsin-D. Prišlo je do znatnega povečanja koncentracije katepsina-D vledvicedivjih miši GAL-3, zdravljenih s cisplatinom (5145 ± 286,1 pg/mg), v primerjavi z divjimi kontrolnimi mišmi GAL-3 (4066 ± 107,7 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-d="" concentration="" in="">ledvicemiši GAL-3 KO, zdravljenih s cisplatinom (6695 ± 587,7 pg/mg), v primerjavi z divjimi kontrolnimi mišmi GAL-3 (3914 ± 87,51 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-d="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (6695="" ±="" 587.7="" pg/mg)="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4066="" ±="" 107.7="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="">

Večkratne primerjave med štirimi poskusnimi skupinami z uporabo enosmerne ANOVA, ki ji je sledil Newman-Keulsov post hoc test, so bile statistično pomembne (P<>

GAL-3 je anti-apoptotični mediator

Razcepljena kaspaza-3. Vledvicedivjih miši GAL-3, zdravljenih s cisplatinom, v primerjavi z divjimi kontrolnimi mišmi GAL-3 (3193 ± 75,30 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" caspase-3="" concentration="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (3022="" ±="" 78.57="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" caspase-3="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4665="" ±="" 330.9="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="" 10a).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Imunohistokemično barvanje za razcepljeno kaspazo-3 je pokazalo znatno večje število apoptotičnih celic v ledvicah s cisplatinom zdravljenih GAL-3 KO miši kot s cisplatinom zdravljenih GAL-3 divjih miši (P<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="" i).cleaved="">

Razcepljeni PARP. Koncentracija razcepljenega PARP (1446 ± 56,97 pg/mg) se je znatno povečala vledvicedivjih miši GAL-3, zdravljenih s cisplatinom, v primerjavi z divjimi kontrolnimi mišmi GAL-3 (171,5 ± 3,926 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (236.1="" ±="" 11.86="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Imunohistokemično barvanje za razcepljeni PARP je pokazalo znatno večje število pozitivnih celic v ledvicah miši GAL-3 KO, zdravljenih s cisplatinom, kot pri divjih miših GAL-3, zdravljenih s cisplatinom (P<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

S TNF povezan ligand, ki inducira apoptozo (TRAIL). Prišlo je do pomembnega povečanja koncentracije TRAIL (120,9 ± 4,748 pg/mg) vledvicedivjih miši GAL-3, zdravljenih s cisplatinom, v primerjavi z divjimi kontrolnimi mišmi GAL-3 (86.14 ± 2,879 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (120.9="" ±="" 4.748="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Imunohistokemično barvanje za razcepljeno kaspazo-3 je pokazalo znatno večje število apoptotičnih celic vledvices cisplatinom zdravljenih GAL-3 KO miši kot s cisplatinom zdravljenih GAL-3 divjih miši (P<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="">

Razcepljeni PARP. Koncentracija Cleaved PARP (1446 ± 56,97 pg/mg) se je znatno povečala v ledvicah divjih miši GAL-3, zdravljenih s cisplatinom, v primerjavi z divjimi kontrolnimi mišmi GAL-3 (171,5 ± 3,926 pg/ mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="">ledvicemiši GAL-3 KO, zdravljenih s cisplatinom, v primerjavi s kontrolnimi mišmi GAL-3 KO (236,1 ± 11.86 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Imunohistokemično barvanje za razcepljeni PARP je pokazalo znatno večje število pozitivnih celic vledvices cisplatinom zdravljenih GAL-3 KO miši kot s cisplatinom zdravljenih GAL-3 divjih miši (P<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

S TNF povezan ligand, ki inducira apoptozo (TRAIL). Prišlo je do pomembnega povečanja koncentracije TRAIL (120,9 ± 4,748 pg/mg) v ledvicah divjih miši GAL-3, zdravljenih s cisplatinom, v primerjavi z divjimi kontrolnimi mišmi GAL-3 (86).14 ± 2,879 pg/mg), (str<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="">ledvicemiši GAL-3 KO, zdravljenih s cisplatinom, kot pri divjih miših GAL-3, zdravljenih s cisplatinom (120,9 ± 4,748 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Legenda FAS.Prišlo je do pomembnega povečanja koncentracije FAS (332,5 ± 6,395 pg/mg) vledvicedivjih miši GAL-3, zdravljenih s cisplatinom, v primerjavi z divjimi kontrolnimi mišmi GAL-3 (77,72 ± 2,805 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" fas="" concentration="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="">ledvicemiši GAL-3 KO, zdravljenih s cisplatinom, v primerjavi s kontrolnimi mišmi GAL-3 KO (134,1 ± 3,597 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" fas="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (332.5="" ±="" 6.395="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Večkratne primerjave med štirimi poskusnimi skupinami z uporabo enosmerne ANOVA, ki ji je sledil Newman-Keulsov post hoc test, so bile statistično pomembne (P<>

GAL-3 in signali prosurvival

NF-κB.Imunohistokemično barvanje za fosfor-NF-κB je pokazalo znatno večje število celic, obarvanih s fosfor-NF-κB vledvicedivjih miši GAL-3, zdravljenih s cisplatinom, kot miši GAL-3 KO, zdravljenih s cisplatinom (P<0.001), (fig.="" 12="">

Beta Katenin.Imunohistokemično barvanje na beta-katenin je pokazalo znatno večje število celic, obarvanih z beta-kateninom vledvicedivjih miši GAL-3, zdravljenih s cisplatinom, kot miši GAL-3 KO, zdravljenih s cisplatinom (P<0.001), (fig.="" 12="">

No-3a.Imunohistokemično barvanje za Wnt-3a je pokazalo bistveno večje število celic, obarvanih z Wnt-3a v ledvicah divjih miši GAL-3, zdravljenih s cisplatinom, kot pri GAL-3, zdravljenih s cisplatinom KO miši (P<0.001), (fig.="" 12="">

Plazemska sečninaPri divjih miših GAL-3, zdravljenih s cisplatinom, je prišlo do pomembnega povečanja koncentracije sečnine v plazmi (23,88 ± 6,715 mmol/L) v primerjavi z divjimi kontrolnimi mišmi GAL-3 (6,688 ± 0). 6066 mmol/L), (P<0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (8.331="" ±="" 0.5194="" mmol/l),=""><0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (23.88="" ±="" 6.715mmol/l),=""><0.001), (fig.="">

Večkratne primerjave med štirimi poskusnimi skupinami z uporabo enosmerne ANOVA, ki ji je sledil Newman-Keulsov post hoc test, so bile statistično pomembne (P<>

Kreatinin v plazmi

Pri divjih miših GAL-3, zdravljenih s cisplatinom, je prišlo do pomembnega povečanja koncentracije kreatinina v plazmi (48,42 ± 3,992 umol/L) v primerjavi z divjimi kontrolnimi mišmi GAL-3 (13,27 ± 0). 3106 umol/L), (P<0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (13.88="" ±="" 0.4183="" umol/l),=""><0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (48.42="" ±="" 3.992="" umol/l),=""><0.01), (fig.="" 13b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Diskusija

AkutnaledvicaPoškodbe so pogost zdravstveni problem po vsem svetu. Vsako leto je približno 13,3 milijona primerov akutnegaledvicapoškodba (AKI). Breme, ki postaja še posebej veliko v državah v vzponu [21]. Po vsem svetu vsako leto umre 1,7 milijona smrti zaradi AKI. Od tega jih je približno 1,4 milijona v državah z nizkim in srednjim dohodkom [21]. AKI je pogosto mogoče preprečiti in zdraviti z le nekaj, če sploh, dolgoročnimi posledicami za zdravje. Identifikacija glavnih mehanizmov in akterjev, ki sodelujejo pri razvoju AKI, se bo odrazila v izboljšanju oskrbe bolnikov in zmanjšanju umrljivosti in obolevnosti.

Pokazali smo znatno povečanje koncentracije GAL-3 vledvicepodvržen AKI. Pokazali smo tudi znatno večjo izraženost GAL-3 v ledvičnih tubulih, ki jih je prizadela akutna tubularna nekroza, pri divjih miših GAL-3, zdravljenih s cisplatinom, kot v ledvičnih tubulih v kontrolni skupini, zdravljeni s fiziološko raztopino. Tako citoplazmatske kot jedrske koncentracije GAL-3 so v ledvičnih tubulih po ATN znatno povečane v primerjavi z mišmi, zdravljenimi s fiziološko raztopino. Povišana raven GAL-3 v poškodovanih ledvičnih tubulih nakazuje, da je GAL-3 pomemben igralec v ATN.

Uporabili smo tudi miši GAL-3 KO, da bi raziskali mehanično vlogo GAL-3 v ATN. To nam pomaga natančno preučiti modulacije pro-apoptotičnih, pro-nekroptotičnih in proteinov za preživetje v prisotnosti in odsotnosti GAL-3 in ugotoviti, ali GAL-3 vpliva na te spremembe ali ne .

Pokazali smo znatno višji odstotek tubulov, na katere vpliva ATN, pri miših GAL-3 KO, zdravljenih s cisplatinom, kot pri divjih miših GAL-3, zdravljenih s cisplatinom. Naši rezultati so pokazali tudi znatno povečanje katepsina B in katepsina D v ledvicah, ki jih je prizadel ATN. Poleg tega so bistveno višje ravni katepsina B in katepsina D vledvicemiši GAL-3 KO, zdravljenih s cisplatinom, kot pri divjih miših GAL-3, zdravljenih s cisplatinom. Katepsini igrajo pomembno vlogo v signalnih poteh, ki spodbujajo apoptotično in nekrotično celično smrt, tako da razgrajujejo različne substrate in/ali prispevajo k destabilizaciji mitohondrijev [22]. Lizosomske proteaze, katepsin B in katepsin D so v ledvicah obilno izražene [23].

Katepsin B, cisteinska proteinaza, ki ima optimalno aktivnost v kislem okolju, sodeluje pri številnih fizioloških in patoloških procesih. Prebavlja strukturne proteine ​​in encime v celici, razgrajuje glavne elemente bazalne membrane in aktivira proencime, hormone in rastne faktorje [24]. V človeški proksimalni tubularni epitelijski celični liniji HK-2, ki je podvržena apoptozi, so opazili povečane ravni izražanja in aktivacijo katepsina B [25].

Katepsin D je znatno izražen v proksimalnih tubularnih celicah. Katepsin D je ključna lizosomska asparaginska proteaza, ki je odgovorna za razgradnjo proteinov in organelov z lizosomsko avtofagijo ter med celično nekrozo in rupturo lizosomske membrane [26]. Katepsin D se znatno poveča v poškodovanih tubulih po ledvični ishemiji/reperfuzijski poškodbi, kar podpira našo ugotovitev znatnega povečanja katepsina D vledvicez akutno tubularno nekrozo [27].

Višje ravni katepsina B in D z višjim odstotkom ATN vledvicemiši GAL-3 KO, zdravljenih s cisplatinom, kot divjih miši GAL-3, zdravljenih s cisplatinom, nakazujejo, da je GAL-3 antinekrotični mediator.

Pokazali smo tudi bistveno višje ravni proteinov nekroptoze; RIPK1, RIPK3 in MLKL noterledvicemiši, zdravljenih s cisplatinom. Poleg tega smo odkrili znatno višje koncentracije RIPK1, RIPK3 in MLKL v ledvicah miši GAL-3 KO, zdravljenih s cisplatinom, kot pri divjih miših GAL-3, zdravljenih s cisplatinom.

Študije so pokazale, da je cisplatin povezan s povečanim oksidativnim stresom [28]. Nastajanje reaktivnih kisikovih spojin (ROS), kopičenje produktov lipidne peroksidacije vledvice, in potlačeni antioksidativni sistemi naj bi bili glavni mehanizmi AKI, ki jih povzroča cisplatin [29]. V celici se cisplatin pretvori v visoko reaktivno obliko, ki hitro reagira z antioksidantnimi molekulami, ki vsebujejo tiol, kot je glutation [30]. Cisplatin lahko povzroči tudi mitohondrijsko disfunkcijo in povečano proizvodnjo ROS zaradi okvarjene dihalne verige [31]. ROS olajša avtofosforilacijo RIPK1 in spodbuja rekrutacijo RIPK-3 in tvorbo nekrosoma [32]. Poleg tega je ROS kritičen induktor prepustnosti lizosomske membrane (LMP) [33].

Cai et al. [34] so pokazali, da LMP, posredovan z ROS, sodeluje pri indukciji nekroptoze v celicah medvretenčne ploščice zajca. Podobno RIPK1-inducirani mitohondrijski-ROS produkciji sledi LMP in mitohondrijska disfunkcija kot posledica pozitivne povratne zanke med Ca2 plus in JNK, kar vodi do nekroptoze celic A549 in H1299 [35, 36].

Poleg tega je bilo dokazano, da navzgor reguliran-RIPK3 pri nekroptozi inducira stres endoplazmatskega retikuluma, ki poveča celično koncentracijo Ca2 plus in ekspresijo ksantin oksidaze, kar vodi do povečane generacije ROS [37].

Katepsina B in D sta glavni funkcionalni vsebini, ki se sproščata iz lizosomov s povečano LMP med procesom celične smrti [34]. Aktivacija katepsina B in D lahko poveča nekroptotično pot [38]. Nekroptozo je torej mogoče inducirati na način, neodvisen od receptorjev [39]. Poleg tega so poročila pokazala, da obstajajo dodatni dražljaji, razen ROS, katepsina B in D, za indukcijo nekroptoze in ti vključujejo povečano regulacijo proteinov TRAIL in FAS legend [40]. Tako lahko povečan ROS zaradi cisplatina ali indukcije RIPK1 ali RIPK3 vodi do povečanega LMP in sproščanja katepsina B in D, kar posledično poveča nekroptozo. Podobno lahko povečan ROS aktivira RIPK1, rekrutacijo RIPK3, izboljšanje tvorbe nekrosomov, fosforilacijo MLKL, translokacijo fosforiliranega MLKL na celično membrano, ki vodi do nekrotične celične smrti s permeabilizacijo plazemske membrane in rupturo.

V tej študiji verjamemo, da so povečani ROS, katepsin B, katepsin D, TRAIL in FAS vključeni v indukcijo nekroptoze pri ATN.

Za določitev vloge GAL-3 pri nekroptozi smo izmerili koncentracije RIPK1, RIPk3 in MLKL v prisotnosti in odsotnosti GAL-3 z uporabo GAL-3 wild in GAL{{5 }} KO miške.

Znatno višje koncentracije RIPK1, RIPK3 in MLKL pri miših GAL-3 KO, zdravljenih s cisplatinom, kot pri miših GAL-3, zdravljenih s cisplatinom, kažejo, da je izločitev GAL-3 povezana z znatno povečanje beljakovin nekroptoze, kar kaže na antinekroptotično vlogo GAL-3.

Poleg tega smo pokazali znatno višje ravni pro-apoptotičnih proteinov; cepljena kaspaza-3, cepljena PARP, TRAIL, FAS in apoptotična telesca vledvicepo ATN.

Med ATN permeabilizacija lizosomske membrane omogoča translokacijo katepsina D in katepsina B iz lizosoma v citosol, kjer lahko izvaja svojo pro-apoptotično funkcijo. Citosolni katepsin D cepi protein Bid v tBid, kar sproži vstavitev proteina Bax v mitohondrijsko membrano. To vodi do sproščanja citokroma c iz mitohondrijev v citosol in aktivacije prokaspaz 9 in 3 [41]. V tej študiji sta tako imunofluorescentno barvanje kot koncentracija beljakovin pokazala znatno večjo ekspresijo intracelularnega GAL-3, tako citoplazemske kot jedrske frakcije, v ATN vledvicedivjih miši GAL-3 v primerjavi s kontrolnimi mišmi.

Torej višje ravni pro-apoptotičnih proteinov; cepljena kaspaza-3, TRAIL, FAS in apoptotična telesca vledvicemiši GAL-3 KO, zdravljenih s cisplatinom, kot pri divjih miših GAL-3, zdravljenih s cisplatinom, kaže na antiapoptotično vlogo GAL-3. Ugotovljeno je bilo, da je GAL-3 kritično vpleten v apoptozo, odvisno od njegove subcelične lokalizacije. Študije so pokazale, da znotrajcelični GAL-3 lahko zavira apoptozo [42-44]. V podporo antiapoptotični vlogi GAL-3 smo odkrili znatno večje število celic, ki izražajo proteine ​​fosfo-NF-κB, beta-katenin in Wnt v ledvicah GAL, zdravljenih s cisplatinom{{15} } divje miši kot miši GAL-3 KO. NF-κB je transkripcijski faktor, ki ima pomembno vlogo pri uravnavanju vnetja, celične proliferacije in celičnega preživetja. Fosforilacija ima ključno vlogo pri aktivaciji NF-κB za vsemi temi dražljaji [45]. NF-κB je zdaj priznan kot pomemben dejavnik, ki prispeva k preživetju celic in zaščiti pred apoptozo [46]. Pokazalo se je, da imajo proteini Wnt zaščitne učinke na poškodovane celice s svojo anti-apoptotično funkcijo prek aktivacije -katenina in c-Myc [47].

Wu et al. so prav tako pokazale znatno povečanje p-NF-κB vledvicez ATN [48]. Wang et al. so tudi pokazale povečano regulacijo signalne poti Wnt/-catenin pri akutni poškodbi ledvic [49]. Študije so pokazale, da je NF-κB vpleten v indukcijo GAL-3 [50], GAL-3 pa je vpleten v aktivacijo NF-κB [51]. Zanimivo je, da je bilo ugotovljeno, da je GAL-3 nov vezni partner -katenina [52].

Te ugotovitve kažejo, da je anti-apoptotična vloga GAL-3 lahko posredovana tudi z aktivacijo poti NF-κB in Wnt/-catenin. Zdi se, da GAL-3 povezuje te poti prenosa signala za preživetje, ki smo jih raziskali v naši študiji. Te poti imajo tudi navzkrižni pogovor med seboj na različnih ravneh. Udeleženci poti Wnt/-catenin modulirajo številne svoje učinke prek interakcije z NF-κB in recipročno NF-κB vpliva tudi na signalno pot Wnt/-catenin [53]. Zato je razumljivo, da ima GAL-3 osrednjo vlogo povezovalca v poteh transdukcije signala za preživetje.

Naša študija dokazuje, da je prisotnost ali odsotnost intracelularnega GAL-3 povezana s pomembnimi spremembami proapoptotičnih, pronekroptotičnih in proteinov za preživetje v ATN, ki ga povzroča cisplatin, in da je visoka raven GAL-3 v ledvičnih tubulih posredovanje antiapoptotičnega, antinekroptotičnega okolja in okolja za preživetje, ki lahko oblikuje prihodnji potek bolezni. To kaže na zaščitno vlogo GAL-3 pri akutnem ATN, povzročenem s cisplatinom, kar podpirajo znatno nižje plazemske ravni sečnine in kreatinina pri GAL-3 divjih miših, zdravljenih s cisplatinom, kot GAL-3 KO miši, zdravljene s cisplatinom (slika 13).

Zaključek

GAL-3 lahko vpliva na celično preživetje in smrt s svojo interakcijo z nekroptotičnimi, apoptotičnimi in pro-preživetnimi proteini v ledvičnih tubulih med akutno tubulno nekrozo, ki jo povzroči cisplatin.

Zahvala

Avtorski prispevki

Vsi avtorji so pregledali in potrdili predloženo različico rokopisa. SA je predstavil koncept, oblikoval študijo, analiziral in interpretiral podatke, oblikoval številke in napisal članek. GJ je izvajal poskuse na živalih in tehniko ELISA, MS je izvajal imunohistokemično in imunofluorescentno barvanje ter s tem povezano obdelavo tkiva. HT je izvajal poskuse na živalih in tehniko ELISA. JY je opravil biokemično analizo delovanja ledvic in predložil pridobljene podatke.

Izjava o razkritju

Avtorji izjavljajo, da nimajo konkurenčnih interesov.

Reference

1 Lameire NH, Bagga A, Cruz D, De Maeseneer J, Endre Z, Kellum JA, Liu KD, Mehta RL, Pannu N, Van Biesen W, Vanholder R: Akutna poškodba ledvic: naraščajoča globalna skrb. Lancet 2013; 382: 170-179.

2 KDIGO: Smernice za klinično prakso pri akutni ledvični poškodbi. Kidney Int 2012; 2: 1–138.

3 Schumer M, Colombel MC, Sawczuk IS, Globe G, Connor J, O'Toole KM, Olsson CA, Wise GJ, Buttyan R: Morfološki, biokemijski in molekularni dokazi o apoptozi med fazo reperfuzije po kratkih obdobjih ledvične ishemije Am J Pathol 1992; 140: 831-838.

4 Schumer AT, Davies DR, McLaren AJ, Cerundolo L, Morris PJ, Fuggle SV: Apoptoza pri ishemiji/reperfuzijski poškodbi človeških ledvičnih alograftov. Transplantation 1998; 66: 872-876.

5 Degterev A, Huang Z, Boyce M, Li Y, Jagtap P, Mizushima N, Cuny GD, Mitchison TJ, Moskowitz MA, Yuan J: Kemični inhibitor nenapoptotične celične smrti s terapevtskim potencialom za ishemično možgansko poškodbo. Nat Chem Biol 2005; 1: 112–119.

6 Vandenabeele P, Galluzzi L, Vanden Berghe T, Kroemer G: Molekularni mehanizmi nekroptoze: urejena celična eksplozija. Nat Rev Mol Cell Biol 2010;11:700–714.

7 Chen X, Li W, Ren J, Huang D, He WT, Song Y, Yang C, Li W, Zheng X, Chen P, Han J: Translokacija beljakovine, podobne domeni kinaze mešane linije, na plazemsko membrano vodi do nekrotične celice smrt. Cell Res 2014; 24: 105–121.

8 Cai Z, Jitkaew S, Zhao J, Chiang HC, Choksi S, Liu J, Ward Y, Wu LG, Liu ZG: Za nekroptozo, ki jo povzroči TNF, je potrebna translokacija trimeriziranega proteina MLKL v plazemsko membrano. Nat Cell Biol 2014; 16: 55–65.

9 Wang Y, Liu Y, Liu Y, Zhou W, Wang H, Wan G, Sun D, ​​Zhang N, Wang Y: Polimerno predzdravilo cisplatina na osnovi pululana za ciljno terapijo proti hepatocelularnemu karcinomu. Int J Pharm 2015; 483: 89–100.

10 Pablo N, Dong Z: Nefrotoksičnost cisplatina: mehanizmi in renoprotektivne strategije. Kidney Int 2008; 73: 994–1007.

11 Mi XJ, Hou JG, Wang Z, Han Y, Ren S, Hu JN, Chen C, Li W: Zaščitni učinki maltola na s cisplatinom povzročeno nefrotoksičnost prek signalnih poti PI3K/Akt in p53, ki jih posreduje AMPK. Sci Rep 2018; 8: 15922.

12 Ozkok A, Edelstein CL: Patofiziologija s cisplatinom povzročene akutne poškodbe ledvic. Biomed Res Int 2014; 2014: 1–17.

13 Hughes RC: Izločanje družine galektinov proteinov, ki vežejo ogljikove hidrate sesalcev. Biochim Biophys Acta 1999;1473:172-185.

14 Liu FT, Patterson RJ, Wang JL: Znotrajcelične funkcije galektinov. Biochim Biophys Acta 2002;1572:263- 273.

15 van den Brûle FA, Waltregny D, Liu FT, Castronovo V: Sprememba vzorca citoplazemskega/jedrskega izražanja galektina -3 je povezana z napredovanjem karcinoma prostate. Int J Cancer 2000; 89: 361-367.

16 Xue J, Gao X, Fu C, Cong Z, Jiang H, Wang W, Chen T, Wei Q, Qin C: Regulacija apoptoze celic Jurkat, ki jo povzroča galektin-3-, tako O-glikani kot N-glikani na CD45. FEBS Lett 2013; 587: 3986-3994.

17 Matarrese P, Fusco O, Tinari N, Natoli C, Liu FT, Semeraro ML, Malorni W, Iacobelli S: Prekomerna ekspresija galektina-3 ščiti pred apoptozo z izboljšanjem lastnosti celične adhezije. Int J Cancer 2000; 85: 545- 554.

18 Oka N, Nakahara S, Takenaka Y, Fukumori T, Hogan V, Kanayama HO, Yanagawa T, Raz A: Galektin-3 zavira apoptozo, povezano s faktorjem tumorske nekroze, inducirano z ligandom, z aktiviranjem Akt v človeškem mehurju karcinomske celice. Cancer Res 2005; 65: 7546-7553.

19 Hashmi S, Al-Salam S: Galektin-3 se izraža v miokardu zelo zgodaj po miokardnem infarktu. Cardiovasc Pathol 2015; 24: 213-223.

20 Zhang S, Li R, Dong W, Yang H, Zhang L, Chen Y, Wang W, Li C, Wu Y, Ye Z, Zhao X, Li Z, Zhang M, Liu S, Liang X: RIPK3 posreduje ledvične tubule apoptoza epitelijskih celic pri z endotoksinom povzročeni akutni poškodbi ledvic. Mol Med Rep 2019;20:1613-1620.

21 Liyanage T, Ninomiya T, Jha V, Neal B, Patrice HM, Okpechi I, Zhao MH, Lv J, Garg AX, Knight J, Rodgers A, Gallagher M, Kotwal S, Cass A, Perkovic V: Svetovni dostop do zdravljenja za končno ledvično bolezen: sistematični pregled. Lancet 2015; 385: 1975-1982.

22 Turk B, Stoka V: Proteazno signaliziranje pri celični smrti: kaspaze proti cisteinskim katepsinom. FEBS Lett 2007; 581: 2761–2767.

23 Pavlock GS, Southard JH, Starling JR, Belzer FO: Sproščanje lizosomskega encima v hipodermično perfundiranih pasjih ledvicah. Cryobiology 1984; 21: 521-528.

24 Werle B, Jülke B, Lah T, Spiess E, Ebert W: Frakcija katepsina B, aktivna pri fiziološkem pH 7,5, je prognostično pomembna pri ploščatoceličnem karcinomu človeških pljuč. Br J Rak 1997; 75: 1137–1143.

25 Wang C, Jiang Z, Yao J, Wu X, Sun L, Liu C, Duan W, Yan M, Sun L, Liu J, Zhang L: Udeležba katepsina B pri apoptozi, ki jo povzroča emodin v HK-2 Celice. Toxicol Lett 2008; 181: 196–204.

26 Suzuki C, Tanida I, Ohmuraya M, Oliva Trejo JA, Kakuta S, Sunabori T, Uchiyama Y: Pomanjkanje katepsina D v ledvičnih proksimalnih tubularnih celicah je povzročilo povečano občutljivost proti ledvični ishemiji/reperfuzijski poškodbi. Int J Mol Sci 2019;20:1711.

27 Lameire N, Van Biesen W, Vanholder R. Akutna odpoved ledvic. Lancet 2005; 365: 417-430.

28 Yu W, Chen Y, Dubrulle J, Stassi F, Putluri V, Sreekumar A, Putluri N, Baluya D, Lai SY, Sandulache VC: Cisplatin ustvarja oksidativni stres, ki ga spremljajo hitri premiki v osrednjem metabolizmu ogljika. Sci Rep 2018; 8: 4306.

29 Aydinoz S, Uzun H, Cermiketal G: Učinki različnih odmerkov hiperbaričnega kisika na s cisplatinom povzročeno nefrotoksičnost. Ledvična odpoved 2007; 29: 257–263.

30 Siddik ZH: Cisplatin: način citotoksičnega delovanja in molekularna osnova odpornosti. Oncogene 2003; 22: 7265–7279.