Del 1: Integrirana mrežna farmakologija in zebrafish model za preiskavo dvojnih učinkov Komponente Cistanche Tubulosa za zdravljenje tako osteoporoze kot Alzheimerjeve bolezni
Mar 30, 2022
Stik:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Ying-Qi Li 1, Yi Chen 1, Jia-Yi Fang 1, Si-Qi Jiang 1, Ping Li 1, * in Fei Li 1, 2, *
ABSTRAKTEN
Etnofarmakološki pomen:Osteoporoza (OP) in Alzheimerjeva bolezen (AD) sta pogosti gerijatrični sočasni bolezni, številne študije pa kažejo na povezavo njihove patogeneze. Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) je splošno uporabljano tradicionalno kitajsko zdravilo in se je obsežno uporabljalo za zdravljenje OP oziroma AD. Vendar pa so aktivne sestavine za sočasne bolezni hkrati in zanje mehanizmi omejeni.
Cilj študije:To delo je bilo namenjeno vzpostavitvi učinkovite in zanesljive metode presejalnega pregleda omrežja za iskanje spojin z dvojnimi učinki v CT, ki lahko sočasno ščitijo AD in OP. Zagotovila bo nove poglede na povezavo med OP in AD o molekularnih mehanizmih.
Material in metode:Dvojni učinki CT so bili sistematično analizirani z integracijo več podatkovnih baz in obsežno analizo na ravni omrežne farmakologije. Izdelana je bila zaupna mreža interakcij z drogami, ki razkriva razlike v učinkih med različnimi vrstami spojin. Da bi dokazali učinkovitost tega omrežja, so bile izbrane nekatere spojine, ki so bile izbrane za preverjanje v predindikalnem op modelu in modelu Zebrafish zebrafish, ki ga je povzdigoval AlCl3, v skladu s topološkimi parametri.
Ključne besede:Mrežna farmakologija; Osteoporoza;Alzheimerjeva bolezen; Cistanche tubulosa; Zebrafish.
Cistanche ima anti-Alzheimer funkcijo.
1. Uvod
Stara tendenca prebivalstva ima za rezultat večjo razširjenost osteoporoze (OP) in Alzheimerjeve bolezni (AD) v preteklih letih (Parnetti et al., 2019; Rizzoli, 2018). Danes sta op in AD priznana kot glavna grožnja javnemu zdravju, saj lahko napredujeta brez simptomov in prinašata velika socialna bremena (Erkkinen et al., 2018; Jonsson et al., 2018). Kot bolezni, povezane s starostjo, se pogosto vidi, da soodločajo v klinični praksi z visoko stopnjo invalidnosti in smrtnosti (Dengler-Crish in Elefteriou, 2019). OP je sistemska skeletna bolezen, za kar je značilna nizka kostna masa in okvarjen mikro-arhitektura kostnega tkivo, z okrepljeno krhkost kosti in povečano tveganje za zlome (Rizzoli, 2018). AD je najbolj pogosta degeneracija možganov, za kar je značilno progresivno izgubo spomina in drugih kognitivnih funkcij (Bondi et al., 2017). Do zdaj še vedno ni dovolj močnih možnosti za preprečevanje ali ozdravitev dveh bolezni njihove kompleksne etiologije in patogeneze. In še huje je, da je bolnik pogosteje imeti stranske učinke (Brown, 2017; Huang in Mucke, 2012).
Na teoretični osnovi sindroma razlikovanja (Sucher, 2013), tradicionalna kitajska zdravila (TCMs) z več komponentami, usmerjene več kot en patofiziološki mehanizem imajo edinstveno superiornost pri zdravljenju nekaterih znanih kompleksnih bolezni. Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) se kot ledvično tonsko bilje pogosto uporablja proti izgubi spomina in atrofični debilnosti kosti tradicionalnih kitajskih zdravnikov (Fu et al., 2018). Poleg tradicionalne učinkovitosti so precejšnje raziskave pokazale, da ima različne farmakološke dejavnosti, kot so amelioriranje kognitivnih in vedenjskih primanjkljajev (Wu et al., 2014), protivnetno (Fu et al., 2018), spodbujanje oblikovanja kosti in zatiranje resorpcije kosti (Li et al., 2013; Li et al., 2012), kot tudi antioksidativnega delovanja (Zhang et al.,2016). Toda komplikacijo njenih aktivnih sestavin in presnovnega procesa so se težave pri raziskovanju ciljev v človeških tkivih in izpostavljanju mehanizma delovanja.
Predvsem je potrebna zanesljiva razprava o terapevtskih ciljih OP/AD. Še posebej na podlagi misli na "isto zdravljenje za različne bolezni" v TCMs, I metodologije "multi-komponentne terapije, biološke mreže" u farmakologiji u mreži, poskusi da se u cilju iskanja znatnih skupnih ciljeva izmedu obeju bolezni ima posebno praktičan pomen u dajanju smernica za preventiva i kontrola OP i AD. Zebrafiši u svojim skeletnim fiziologijama sa sisara i visoko homolognih gena za ljude. To je na voljo in privlačen živalski model in vivo za OP in AD raziskave (Bergen et al., 2019; Newman et al., 2014). Tako je bila ta raziskava farmakološke mreže usmerjena v presejanje aktivnih sestavin CT z dvojnimi učinki, raziskovanje skupnih potencialnih ciljev op in AD ter razkrivanje možnosti uporabe CT za sočasno zdravljenje dveh bolezni. V tej študiji so bili podatki o aktivnih sestavinah CT, genomih in proteomiki op in AD zbrani iz različnih podatkovnih baz za vzpostavitev interaktivnega omrežja, izdelana pa je bila tudi analiza obogatitve za odkrivanje sinergističnih mehanizmov CT za zdravljenje OP in AD. Poleg tega smo modele OP in AD zebrafish in zajeli ključne spojine v omrežju, da bi preverili njihovo učinkovitost in cilje za dve bolezni.
Cistanche povečuje rast skleroze.
2. Materiali in metode
2.1 Reagenti
Kemični standardi genisteina (GE), quercetina (QU), abietične kisline (AA), β-sitosterola (BSS) (čistost ≥ 98 %) so bili kupljeni pri Chroma Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Kitajska). Kulturne plošče so bile pridobljene iz Wuxi NEST Biotechnology Co, Ltd. (Wuxi, Kitajska). Prednizolon (Pre), etidronat dinatrij (Ed), Donepezil HCL (DPZ), AlCl3·6H2O so kupili pri zdravilu Aladdin Reagent Inc. Zebrafish alkalna fosfataza (ALP), kislina, odporna na tartrate 3 Komplet za imunosorbent (ELISA) (AChE) sa kolin-acetiltransferazom (ChAT) vezanim za imunosorbent (ELISA) komplet je nabavio Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., d.o.o. (Šangaj, Kina). Trizol so dobili iz Nanjing KeyGen Biotech. Co., Ltd. (Nanjing, Kitajska). Transtar Top Green qPCR SuperMix je bil kupljen pri TransGen Biotech. Co., Ltd. (Peking, Kitajska).
izvleček cistanche
2.2 Živali
Odrasli zebrafish (AB sev, star 4 mesece) so vzdrževali pri 28 °C v svetlobnem/temnem ciklu 14/10 h v akvariju, ki je bil dobavljen s sladkovodno izmenjavo. Hranili so jih dvakrat dnevno z na novo izvalino prehrano za koke (Chen et al., 2018). Običajno oplodljeni zarodek je bil izbran in kulturiziran do 3 dni po oploditve (dpf) v lahkem rastnem inkubatorju. Vsi poskusi na živalih so bili v skladu s smernicami institucije in vlade za poskuse na živalih.
2.3 Mrežni farmakološki proces
2.3.1 Izračun kemijskega prostora in presejalne snovi za kandidate
Vsi podatki o kemijskih sestavinah CT so bili zbrani iz platforme za farmakološko bazo in analizo tradicionalnih kitajskih sistemov medicine. TCMSP je sistemska farmakološko platforma kitajskih zeliščnih zdravil, ki zajema odnose med zdravili, cilji in boleznimi (Ru et al., 2014). Medtem so bili v TCMSP pridobljeni štirje bistveni parametri, povezani s farmakologijo, za analizo glavnih komponent (PCA), vključno z molekulsko maso (MW), koeficientom predelitve med oktanolom in vodo (AlogP), številom darovalcev vodika (Hdon) in številom sprejemnika vodika (Hacc). Kemična porazdelitev CT je bila zgrajena z zgornjimi parametri z uporabo programske opreme SIMCA (različica 14.1, Umetrics). In majhna molekula zdravila odobrena za AD / OP iz DrugBank so bili obdelani v istem tečaju. Sestavine iz CT so bile filtrirane po podobnosti z zdravili (DL). DL je kvalitativni koncept, ki se uporablja pri oblikovanju drog za oceno, kako »drogam podobna« je perspektivna spojin. Ta vitalna lastnost se uporablja kot izbirno merilo za "droge podobne" spojine v tradicionalnih kitajskih zeliščih in pomaga optimizirati farmakokinetiko in farmacevtske lastnosti (Tao et al., 2013). Na podlagi predlogov iz literature in TCMSP smo za pogoje filtra izbrali DL ≥ 0,18. Sestavine, ki so bile v skladu s pogojem, so bile izvožene za naslednje analize. Njihove 2-dimenzionalne (2D) in 3D strukture je naslikala programska oprema ChemDraw Professional 16.0. In 3D strukture so optimizirane s funkcijo minimiziranja energije v Chem3D 16.0.
2.3.2 Zbiranje povezanih ciljev za OP in AD
Vse genske zveze za OP in AD so bile neodvisno zbrane od disGeNET in GeneCards. DisGeNET baza podatkov je ena največjih javno dostopnih platform za odkrivanje genov in variant, povezanih s človeškimi boleznimi (Pinero et al., 2017). GeneCards je integrirana baza človeških genov, ki vključuje genomske, trankriptomske, proteomske, genetske, klinične in funkcionalne informacije (Safran et al., 2010).
2.3.3 Zbiranje sestavljenih ciljev in napoved inverzno pritrjevanje
GeneCards baza podatkov in švicarska baza podatkov TargetPrediction sta bili združeni za predvidevanje ustreznih ciljev aktivnih sestavin v CT. GeneCards označuje znane aktivne cilje spojin, švicarska baza podatkov TargetPrediction pa lahko oceni najverjetnejše makromolekularne cilje majhnih molekul (Daina et al., 2019). Pred napovedjo so bile strukture molekul kandidatov pretvorjene iz formata MOL2 v format SMILES z uporabo Open Babel (različica 2.4.1).
2.3.4 Analiza interakcije beljakovinskih beljakovin
Zbirka podatkov STRING je bila uporabljena za odkrivanje interakcij med skupino ciljev v skupni rabi CT-OP-AD. Po iskanju pod vzorcem "Homo sapiens" je omrežje interakcije beljakovin in beljakovin (PPI) vizualizirala programska oprema Cytoscape (Različica 3.7.2). STRING je baza znanih in napovedanih PPI, ki izhaja iz genomskih kontekstnih napovedi, visoko-skoziputnih laboratorijskih poskusov, (ohranjenega) so-izražanja, avtomatiziranega rudarjenja besedil in prejšnjih znanj v bazah podatkov (Szklarczyk et al., 2017).
Cistanche je dober za Alzheimerjevo bolezen.
2.3.5 ANALIZA OBOGATITVE POTI GO in KEGG
Analiza obogatitve gena Ontology (GO) je bila izvedena na programski opremi Funrich. FunRich (različica 3.1.3) je funkcionalna programska oprema, ki se uporablja predvsem za analizo obogatitve genov in beljakovin (Pathan et al., 2015). Za izvajanje analize obogatitve poti je bila zaposlena baza podatkov ConsensusPathDB-human. Pridobljeni genski seznam je bil predložen v zbirko podatkov z nastavitvijo "odklop p-vrednosti" kot 0.01. Po rezultatih so bile izbrane le te poti, povezane z OP in/ali AD, in razdeljene v skupine po kategorijah funkcij KEGG. CPDB je brezhibno interakcijsko omrežje, ki vsebuje binarne in kompleksne beljakovinske beljakovine, genetske, metabolične, signalizirane, genske regulativne in interakcije ciljnih drog, kot tudi biokemične poti v Homo sapiens (Kamburov et al., 2013).
2.4 Poskusni postopki za op zebrafish model
2.4.1 Združevanje modelov
Ličinke zebrafish so bile razdeljene v več skupin: kontrolna skupina, skupina modelov, model + Ed skupina, skupine model + spojine, od katerih je vsaka vsebovala 30 ličink. Kontrolna skupina je bila vzdrževati v mediju z 0,2 % DMSO. Skupino modelov so zdravili s pre (25 μM) od 3 dpf do 8 dpf. Model + Ed skupina je bila soobdelana s pre in Ed (30 μg/ml).
2.4.2 Rdeči madež Alizarin
Po 5 dneh kulture z različnimi spojinami so bile ličinke anestestizirane, fiksne in beljene po vrsti. Alizarin rdeča je bila uporabljena za madež glave kosti zebrafish. 1% KOH in glicerol (razmerja 3:1, 1:1 in 1:3) so uporabili za odstranitev odvečne. Za konec je bil zaposlen stereomikroskop (Olympus SZX16) za zajemanje slik za oboje zebrafish pod podložnim položajem. Območje za obojevanje in integrirano optično gostoto (IOD) so izračunali z Image-Pro Plus 6.0.
2.4.3 DOLOČANJE AKTIVNOSTI ALP IN TRAP
Ličinke zebrafov pri 3 dpf so bile subkulturne v 6-dobro plošči in inkubirati s pre v prisotnosti ali odsotnosti spojin 5 dni. Nato so jih zbirali za merjenje aktivnosti ALP. Aktivnost ALP je bila določena z uporabo kompleta zebrafish ALP ELISA na podlagi protokola proizvajalca. Metoda za oceno aktivnosti TRAP je bila enaka kot ALP.
2.5 Poskusni postopki za model AD Zebrafish
2.5.1 Združevanje modelov
Ličinke zebrafish so bile razdeljene v več skupin: kontrolna skupina, skupina modelov, model + DPZ skupina, skupine model + spojine, od katerih je vsaka vsebovala 30 ličink. Kontrolna skupina je bila vzdrževati v mediju z 0,2 % DMSO. Skupino modelov so zdravili z alCl3 (150 μM, pH 5.8) od 3 dpf do 6 dpf. Skupina model + DPZ je bila soobdelana z alCl3 in DPZ (8 μM).
2.5.2 Analiza vedenja
Po 3 dneh dostava drog, ličinke gibanje je bilo zabeleženo s ViewPoint vedenje analizator (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co, Ltd). Vsi poskusi so bili zaključeni v 60 minutah pri 28 °C, ki so vsebovali 3 cikle svetlobne/temne faze (po 10 min za svetlobo in temno). V skladu z metodami v prejšnjem poročilu se povprečna hitrost (AS), sprememba hitrosti (∆S), stopnja okrevanja po disineziji (DRR, enačba a) in učinkovitost odziva (RE, enačba b) v tem modelu izberejo kot indeks ocenjevanja učinkovitosti drog proti AD (Pan et al., 2019; Wenhai et al., 2016).
AS (mm/sec) = D / T, DRR (%) = 100 × (ASDrug - ASModel) / (ASControl - ASModel), a
kjer je D gibalna razdalja zebrafish med 60 min, T je eksperimentalni čas.
RE (%) = 100 × (∆SDrug - ∆SModel) / (∆SControl - ∆SModel), b
kjer ∆S sprememba hitrosti zebrafov v svetlobnih/temnih ciklih.
2.5.3 Merjenje aktivnosti AChE in CHAT
Ličinke zebrafov pri 3 dpf so bile subkulturne v 6-dobro ploščah in inkubatorne z alCl3 v prisotnosti ali odsotnosti spojin 3 dni. Potem so jih zbrali za AChE dejavnost. Dejavnost AChE je bila zaznana z uporabo kompleta Zebrafish AChE ELISA na podlagi protokola proizvajalca. Metoda za ocenjevanje dejavnosti ChAT je bila enaka kot AChE.
2.6 Kvantitativna analiza PCR v realnem času
Ličinke zebrafov so bile razdeljene v skupine OP in AD. Op skupine so sestavljale kontrolne skupine, Skupine Pre in Pre + spojine, kulturene od 3 dpf do 8 dpf. Skupine AD so vključevale kontrolno skupino, skupino AlCl3 in alCl3 + skupine spojin, ki so se kulturale od 3 dpf do 5 dpf. Ena skupina je vsebovala 30 ličink. Trizol je iz teh vzorcev ličink zebrafish izvleček celotne RNK. Vzorci RNK so bili reverzibilni v CDNA v skladu z navodili proizvajalca za komplet cDNA. Stopnjo izražanja mRNA je zaznal fluorescenčni kvantitativni PCR v realnem času (Roche LightCycler96). Rezultati so bili normalizirani β in kvantitativno uporabljeni s primerjalno metodo (2−∆∆Ct). Uporabljene prednje in obratne primere je sintetiznil Sangon Biotech (Šanghaj, Kitajska) in naveden v Dopolnilni preglednici S1.
cistanche in Tongkat ali prašekpomaga izboljšati imuniteto.
Za več informacij kliknite tukaj.
2.7 Statistična analiza
GraphPad Prism različica 8.00 je bila uporabljena za opisne statistične analize. Podatki so bili izraženi kot ± SD in analizirani z metodo ANOVA za preskušanje variabilnosti med posameznim preskušanjem, pri tem pa so upoštevali ≤ 0,05 kot pomembno.
