Povzetek

Regenerativna medicina je zaradi pomanjkanja zdravil za bolezni ledvic deležna vse večje pozornosti kot nov terapevtski pristop. Nedavni napredek pri regeneraciji ledvic z uporabo človeških induciranih pluripotentnih matičnih celic (hiPSC) je omembe vreden. Na podlagi znanja o razvoju ledvic se hiPSC usmerjeno diferencirajo v dve vrsti embrionalnih matičnih celic ledvic, nefronske presnovne matične celice (NPC) in ureteralne popke (UB), ki so sposobne generirati nefrone in zbirati kanalom podobne organe. Poleg tega se lahko človeško ledvično tkivo ustvari iz teh matičnih celic, pridobljenih iz hiPSC, v katerih so glomeruli in tubuli, pridobljeni iz NPC, in zbiralni kanali, pridobljeni iz UB, med seboj povezani. Inducirano ledvično tkivo se po presaditvi v imunsko pomanjkljive miši dodatno vaskularizira. Poleg rekonstrukcije ledvic za presaditev se je pokazalo, da celična terapija z NPC, pridobljenim iz hiPSC, izboljša akutno ledvično poškodbo (AKI) pri miših. Študije modeliranja bolezni in odkrivanja zdravil z uporabo za bolezen specifičnih hiPSC so se močno uporabljale tudi pri neodzivnih boleznih ledvic, kot je avtosomno dominantna policistična bolezen ledvic (ADPKD). Za obravnavo zapletov, povezanih z ledvičnimi boleznimi, so bile celice, ki proizvajajo eritropoetin (EPO), pridobljene iz hiPSC, uspešno ustvarjene za odkrivanje zdravil in razvoj celičnih terapij za ledvično anemijo. Ta članek pregleduje trenutne in prihodnje perspektive ledvične razvojne biologije in regenerativne medicine za ledvične bolezni, ki temelji na tehnologiji iPSC.

Ključne besede

iPSC ;Regeneracija ledvic ;Nephron progenitor celice;Ureteric brsti;Celična terapija ; Modeliranje bolezni;Cistanche tubulosa

Uvod

Bolezni ledvic predstavljajo velik zdravstveni problem in gospodarsko breme po vsem svetu, vendar je zaradi hudega pomanjkanja organov darovalcev na voljo le malo možnosti zdravljenja razen presaditve ledvice. Ena od rešitev je razviti strategije regenerativne medicine z uporabo človeških pluripotentnih matičnih celic (hPSC), kot so embrionalne matične celice (hESC) in inducirane pluripotentne matične celice (hiPSC). Ker imajo hPSC potencial za neomejeno razmnoževanje in diferenciacijo v kateri koli tip celice, vključno z ledvičnimi celicami, se pričakuje, da bodo služili kot vir celic za regenerativno medicino, kot sta rekonstrukcija ledvic in celična terapija. Poleg tega se lahko za bolezen specifične hPSC z genetsko dovzetnostjo za povzročanje specifičnih bolezni uporabijo za razvoj patoloških analiz in modelov odkrivanja zdravil, v katerih poškodovani tipi celic, diferencirani od hPSC, posnemajo fenotipe bolezni in vitro. V tem članku povzemam nedavni napredek v raziskavah regeneracije ledvic, ki temeljijo na razvojni biologiji, in opisujem prihodnje obete za regenerativno medicino in modeliranje bolezni pri boleznih ledvic.

Za nakup kliknite tukajIzvleček Cistanche tubulosa

Razvoj ledvic

Ledvica izhaja iz zgodnjega embrionalnega blastoderma, intermediarnega mezoderma (IM) (slika 1a). Pri vretenčarjih iz IM nastanejo tri ledvice v zaporedju, primarna, vmesna in zadnja ledvica (slika 1b). Srednja ledvica je odrasla ledvica rib in dvoživk, zadnja ledvica pa je odrasla ledvica plazilcev, ptic in sesalcev. Čeprav so si te tri ledvice podobne, ker so sestavljene iz nefronov, ki so funkcionalne enote ledvic, imajo različno število nefronov. Ledvični postnefron pri odraslih sesalcih je sestavljen iz dveh embrionalnih tkiv, postnefričnega mezenhima (MM) in popka sečnice (UB; slika 1 c). MM tvori nefron in mezenhim odrasle ledvice, UB pa se diferencira in tvori spodnji urinarni trakt od zbirnega kanala do dela mehurja.

Slika 1: Usmerjena diferenciacija celic ledvične linije. ac Shematične risbe, ki prikazujejo specifikacijo mezoderma (a), nastanek treh ledvic (b) razvoj metanefrosa (c). IM: vmesni mezoderm; MM: metanefrični mezenhim; UB: ureterični popek.

Z ustvarjanjem novega klonogenega testa smo prvič dokazali, da MM vsebuje multipotentne progenitorne celice, ki se lahko diferencirajo v več vrst epitelijskih celic, ki sestavljajo nefron, kot so glomerularne stopalne celice in tubularne epitelne celice. Kasneje so poskusi genealoškega sledenja pokazali, da so te matične celice označene s transkripcijskim faktorjem Six2. Te matične celice se zdaj imenujejo ledvične presnovne matične celice (NPC). Taguchi et al. dokazali, da je IM razdeljen na sprednjo in posteriorno domeno, kar povzroča UB oziroma MM. na podlagi teh ugotovitev pri razvoju ledvic so se začela prizadevanja za regeneracijo ledvičnih genealoških celic iz hPSC.

Usmerjena diferenciacija hPSC v ledvične linije

Kot predhodni ukrep za razlikovanje hiPSC neposredno v ledvičnih linijah s posnemanjem razvoja ledvic se je naša skupina osredotočila na generiranje celic IM in ustvarila reporterske linije hiPSC z genom OSR1, specifičnim markerjem za IM, z urejanjem genov. Z uporabo sistema kvantitativnega ocenjevanja in reporterskih linij hiPSC smo razvili učinkovito shemo diferenciacije za induciranje hiPSC v celice IM, ki izražajo osr1. Te inducirane celice IM so pokazale razvojni potencial za nadaljnjo diferenciacijo v tipe odraslih ledvičnih celic, kot so glomerularni podociti in tubularne celice, in oblikovale tridimenzionalne (3D) cevaste strukture s sokulturo z mišjimi posteriornimi ledvičnimi celicami.

Koristi izvlečka Cistanche

Taguchi et al. razvili prvo metodo za selektivno diferenciacijo mišjih ESC (mESC) in hiPSC preko posteriornega IM za induciranje NPC in ustvarili organe, podobne ledvičnim enotam, ki vsebujejo glomerule in tubule iz induciranih NPC in vitro. Takasato idr. poročali o nastanku organov, podobnih ledvicam, ki vsebujejo več tipov ledvičnih celic, kot so glomeruli, tubuli, zbiralni kanali, intersticijske celice in vaskularne celice. Z razvojem 2D sistema kulture so Morizane et al. učinkovito ustvarjen NPC iz hiPSC in nato ustvarjen ledvični presnovni organoid iz NPC. Pred kratkim je naša skupina razvila metodo postopnega diferenciiranja, ki učinkovito inducira hiPSC v NPC, ki ima diferenciacijski potencial za oblikovanje organov, podobnih ledvični enoti (slika 2 d, e). Naša metoda diferenciacije je sestavljena iz šestih korakov in bolje povzema naravni razvojni proces NPC kot metode, o katerih so poročali Takasato et al. in Morizane et al. in generira NPC v formatu 2D diferenciacije učinkoviteje kot metoda, ki uporablja 3D kulturo Taguchi et al.

V zvezi z usmerjeno diferenciacijo linije UB sta Taguchi in Nishinakamura diferencirala mESC in hiPSC v UB podobne strukture skozi sprednji IM in ledvične tubule (ND). Vendar pa so bile epitelne celice ND inducirane z nizko učinkovitostjo, poznejša analiza pa je zahtevala čiščenje celic ND s pretočno citometrijo. Razvili smo učinkovitejšo metodo 2D diferenciacije, ki generira ND epitelne celice iz hiPSC s pred-IM in vključuje kasnejši korak diferenciacije brez čiščenja (slika 2 f, g). V 3D kulturi so inducirane ND celice oblikovale UB podobne strukture z RET(plus) konicami in CK8(plus) matičnimi strukturnimi domenami. Vendar pa so ustvarjene UB podobne strukture iz obeh skupin pokazale omejen potencial razvejanja.

Slika 2: d: Imunsko barvanje nefronskih progenitorskih celic (NPC), pridobljenih iz hiPSC, za OSR1, SIX2 in HOXD11.e: Imunsko barvanje organoida nefrona, ki nastane iz NPC-jev, pridobljenih iz hiPSC, po 10 dneh kulture vmesnika zrak-tekočina. PODXL: Podocalyxin (podocitni marker; bel); LTL: Lotus tetragonolobus lektin (označevalec proksimalnih tubulov; rdeč); CDH1: CADHERIN 1 (označevalec distalnega tubula; zelen).f, g: Imunsko obarvanje sprednjih celic IM za OSR1 (zeleno) in GATA3 (rdeče; f) in celičnega agregata nefričnega kanala za E-CADHERIN (zeleno), GATA3 (rdeče) in jedra (modro; g).h: Morfološka sprememba med rekonstrukcijo razvejanih organoidov iUB za 7 dni.

Pred kratkim smo s spremembo naše metode diferenciacije UB uspešno ustvarili inducirane UB (iUB) podobne organe z epitelno polarnostjo, tubularnim lumnom in ponavljajočo se morfogenezo razvejanja (slika 2, 3 hj). Poleg tega smo uspešno inducirali diferenciacijo teh organov, podobnih iUB, v njihove primerke in vivo z zbiranjem kanalom podobnih organov v človeških zarodkih v 7. tednu gestacije (slika 3k).

Slika 3:i: Imunsko barvanje organoida iUB za RET (zeleno), CK8 (rdeče) in PAX2 (modro).j Barvanje organoida iUB s toluidinsko modrim, ki prikazuje cevaste lumne.k: slike svetlega polja (levo) in slike imunskega barvanja (srednja in desna) zbiralnih kanalom podobnih cevastih struktur, pridobljenih iz organoida iUB za FOXA1 (bela), AQP2 (rdeča) in GATA3 (zelena). Lestvice, 100 μm. (d) in (e) sta prilagojena iz Tsujimoto et al. [12], (f) in (g)–(k) sta prilagojena iz Mae et al. oz

Razširitev ledvičnih prednikov

Da bi zagotovili veliko število ledvičnih celic za temeljne in klinične raziskave, so raziskali metode za in vitro razmnoževanje embrionalnih ledvičnih matičnih celic v kulturi. Brown et al. in Tanigawa et al. poročali o in vitro ekspanziji NPC v mišjih zarodkih. NPC iz mišjih in človeških zarodkov so razširili in vzdrževali in vitro 17 oziroma 7 mesecev z uporabo 3D celične agregacijske kulture Li et al. Skupina je uporabila tudi isto metodo za razširitev NPC, ki se razlikuje od hiPSC in vitro 2 meseca. Čeprav vse tri metode uporabljajo kostni morfogenetski protein (BMP), ostaja vloga BMP7 pri širjenju NPC neznana. S presejanjem spojin smo identificirali inhibitor JAK3, TCS21311, kot alternativo BMP7 v ekspanzijski kulturi bb0, ki so jo razvili Li et al. in razkril zaviralni učinek BMP7 na širjenje nazofaringealnega karcinoma v signalni poti JAK3- stat3. Poleg tega je dodatek TCS21311 ekspanzijski kulturi izboljšal stopnjo proliferacije mišjih zarodkov in NPC, pridobljenih iz hiPSC.

Pred kratkim smo razvili ekspanzijsko kulturo celic UB, pridobljenih iz hiPSC, v kateri so posamezne celice, izolirane iz organov, podobnih iUB, proliferirale in tvorile kolonije, ki izražajo markerje konice UB. Te konične kolonije lahko rekonstituirajo organe, podobne iUB, v ponavljajočem se potencialu razvejanja in ta postopek rekonstitucije je mogoče ponoviti vsaj trikrat.

standardiziran Cistanche

Rekonstrukcija ledvic

Zgodnje delo pri rekonstrukciji ledvičnih struktur je uporabljalo domnevno ektodermalno regijo oplojenega jajčeca dvoživk, imenovano živalska kapica, ki je pluripotentna celična masa (slika 4 a). Moriya et al. poročali, da je kombinacija zdravljenja z aktivinom A in retinoinsko kislino (RA) povzročila diferenciacijo živalske kapice v prorenalne tubule in vitro. Brennan et al. induciral tudi prorenalne kritosemenke v eksosomih. Pokazali smo, da inducirani eksosomi vsebujejo prerenalne tubule in lahko regenerirajo prerenalno tkivo iz pluripotentnih celic dvoživk in vitro (slika 4 bd). Čeprav in vitro regeneracijskega sistema pre-renalne ni mogoče neposredno prevesti v klinične študije, lahko služi kot preprost in uporaben sistem za preučevanje razvoja ledvic.

Slika 4: Rekonstrukcija ledvičnih struktur. a: Shema, ki prikazuje nastajanje pronefrosnih struktur iz živalske kapice zarodkov Xenopus. b–d: dvojna imunsko obarvana slika celotnega nastavka (b) in odsekov (c, d): eksplantata Xenopus, ekvivalentnega stadiju 42 (b, c) in ličinke stadija 40 (d) z uporabo protitelesa, specifičnega za pronefrične tubule (3G8, rdeče ) in protitelo, specifično za pronefrični kanal (4A6, modro).

V nasprotju z ustvarjanjem organov, podobnih ledvičnim enotam, iz NPC, ki izvirajo iz mESC in hPSC, in zbiranjem organov, podobnih kanalom, iz celic UB, ki izvirajo iz hPSC, Taguchi et al. ustvaril organe, podobne mišjim ledvicam, s kombinacijo NPC in UB, pridobljenih iz mESC, in mezenhimskih matičnih celic, odstranjenih iz mišjih zarodkov, ki vsebujejo glomerule, tubule in zbiralne kanale, kot je opisano zgoraj. Človeškim ledvicam podobne organe smo ustvarili in vitro s sokulturo NPC in UB celic, induciranih s hiPSC, v tem zaporedju, v katerih so bili glomeruli in tubuli, pridobljeni iz NPC, ter zbiralni kanali, pridobljeni iz UB, med seboj povezani (slika 5 e, f). Ko so jih presadili v subepitelijski prostor miši z imunsko pomanjkljivostjo, so se ti ledvičnim podobni organi, pridobljeni iz hiPSC, integrirali v vaskulaturo miši gostiteljice (slika 5 gi).

Slika 5:e: Shema, ki prikazuje in vitro rekonstrukcijo ledvičnih struktur iz hiPSC. f: Trojno imunsko barvanje ledvičnih organoidov 20. dne za označevalce podocitov (PODXL), proksimalnih tubulov (LTL) in distalnih tubulov ter zbiralnih kanalčkov (CDH1; levo) ter za PODXL in označevalce distalnih tubulov in zbiralnih kanalčkov (AVPR2) in zbiralnikov samo kanali (CALB1; desno). Upoštevajte, da so bili šibki signali CDH1 najdeni tudi v delih LTL in proksimalnih tubulih na levi plošči. g: Shema, ki prikazuje in vivo rekonstrukcijo ledvičnih struktur iz hiPSC. h: slika z manjšo povečavo, ki prikazuje celotno ledvico gostitelja in ledvični presadek, pridobljen iz hiPSC (zeleno), po dajanju dekstrana, konjugiranega z rodaminom B, skozi repno veno miši gostiteljice. i: Intravitalna večfotonska mikroskopska slika po injiciranju dekstrana, konjugiranega z rodaminom B, v repno veno, ki kaže, da lumni žil miši gostiteljice prodrejo v strukturo, podobno glomerulu, ki izhaja iz hiPSC (zeleno). Lestvice, 100 μm v (b)–(d) in (f), 500 μm v (h) in 40 μm v (i). (b)–(d) in (e)–(i) sta prilagojena iz Osafune et al. in Tsujimoto et al

Za presaditev ledvičnih organov z urinarnimi trakti so bile raziskane metode z uporabo poskusnih živalskih teles, kot sta medvrstna komplementacija blastociste in metode organskega ekotona. Goto et al. vbrizgali mESC divjega tipa v blastociste anemičnih podgan Sall1(-/-) in uspešno ustvarili mišje ledvice pri podganah gostiteljicah. Fujimoto idr. razvili metodo celične presaditve, pri kateri so NPC, pridobljene iz hiPSC, presadili v razvijajočo se ledvično regijo (tj. ekoton organa) mišjih materničnih zarodkov, presajeni NPC pa so sooblikovali mezenhim himerne kapice z gostiteljskimi NPC, pritrjenimi na gostiteljsko mišjo UB. Čeprav so bili glomeruli in tubuli, pridobljeni iz mm, izpeljani iz vbrizganih PSC ali NPC, so bili preostali tipi ledvičnih sestavnih celic, kot so zbiralni kanali, pridobljeni iz UB ter spodnje sečnice in vaskularne celice, pridobljeni iz živali gostiteljice v obeh strategijah.

Zeliščna cistanča

REFERENCE

1. Sodelovanje GBD pri kronični ledvični bolezni. Globalno, regionalno in nacionalno breme kronične ledvične bolezni, 1990–2017: sistematična analiza za študijo Globalnega bremena bolezni 2017. Lancet. 2020; 395 (10225): 709–33.

2. Karagiannis P, Takahashi K, Saito M, Yoshida Y, Okita K, Watanabe A, Inoue H, Yamashita JK, Todani M, Nakagawa M, Osawa M, Yashiro Y, Yamanaka S, Osafune K. Inducirane pluripotentne izvorne celice in njihove uporabo v človeških modelih bolezni in razvoja. Physiol Rev. 2019; 99 (1): 79–114.

3. Saxen L. Organogeneza ledvic. Cambridge: Cambridge University Press; 1987.

4. Osafune K, Takahata M, Kispert A, Asashima M, Nishinakamura R. Identifikacija multipotentnih progenitorjev v embrionalni mišji ledvici z novim testom za tvorbo kolonij. Razvoj. 2006; 133 (1): 151–61.

5. Kobayashi A, Valerius MT, Mugford JW, Carroll TJ, Self M, Oliver G, McMahon AP. Six2 definira in uravnava multipotentno samoobnavljajočo se populacijo progenitorjev nefrona v celotnem razvoju ledvic sesalcev. Celična matična celica. 2008; 3 (2): 169–81.

6. Taguchi A, Kaku Y, Ohmori T, Sharmin S, Ogawa M, Sasaki H, Nishinakamura R. Redefiniranje in vivo izvora metanefričnih prednikov nefrona omogoča ustvarjanje kompleksnih struktur ledvic iz pluripotentnih matičnih celic. Celična matična celica. 2014;14(1):53–67.

7. Mugford JW, Sipilä P, McMahon JA, McMahon AP. Izražanje Osr1 razmejuje multi-potentno populacijo vmesnega mezoderma, ki je podvržen progresivni omejitvi na od Osr1-odvisnega nefronskega predniškega oddelka v ledvicah sesalcev. Dev Biol. 2008;324(1):88–98.

8. Mae S, Shono A, Shiota F, Yasuno T, Kajiwara M, Gotoda Nishimura N, Arai S, Sato-Otubo A, Toyoda T, Takahashi K, Nakayama N, Cowan CA, Aoi T, Ogawa S, McMahon AP, Yamanaka S, Osafune K. Spremljanje in robustna indukcija nefrogene vmesne mezoderme iz človeških pluripotentnih matičnih celic. Nat Commun. 2013;4:1367.

9. Araoka T, Mae S, Kurose Y, Uesugi M, Ohta A, Yamanaka S, Osafune K. Učinkovita in hitra indukcija človeških iPSC/ESC v nefrogeni intermediarni mezoderm z uporabo metod diferenciacije na osnovi majhnih molekul. PLoS ENA. 2014;9(1):e84881.

10. Takasato M, Er PX, Chiu HS, Maier B, Baillie GJ, Ferguson C, Parton RG, Wolvetang EJ, Roost MS, de Sousa C, Lopes SM, Little MH. Organoidi ledvic iz človeških iPS celic vsebujejo več linij in modelirajo človeško nefrogenezo. Narava. 2015; 526 (7574): 564–8.

11. Morizane R, Lam AQ, Freedman BS, Kishi S, Valeius MT, Bonventre JV. Nefronski organoidi, pridobljeni iz človeških pluripotentnih izvornih celic, modelirajo razvoj in poškodbe ledvic. Nat Biotechnol. 2015; 33 (11): 1193–200.

12. Tsujimoto H, Kasahara T, Sueta S, Araoka T, Sakamoto S, Okada C, Mae SI, Nakajima T, Okamoto N, Taura D, Nasu M, Shimizu T, Ryosaka M, Li Z, Sone M, Ikeya M, Watanabe A, Osafune K. Modularni diferenciacijski sistem preslika več človeških ledvičnih linij iz pluripotentnih matičnih celic. Cell Rep. 2020;31(1):107476.

13. Taguchi A, Nishinakamura R. Organogeneza ledvic višjega reda iz pluripotentnih matičnih celic. Celična matična celica. 2017;21(6):730-46. e6.

14. Mae SI, Ryosaka M, Toyoda T, Matsuse K, Oshima Y, Tsujimoto H, Okumura S, Shibasaki A, Osafune K. Ustvarjanje razvejanih tkiv ureteričnih popkov iz človeških pluripotentnih matičnih celic. Biochem Biophys Res Commun. 2018; 495 (1): 954–61.

15. Mae SI, Ryosaka M, Sakamoto S, Matsuse K, Nozaki A, Igami M, Kabai R, Watanabe A, Osafune K. Razširitev človeških iPSC-izpeljanih organoidov ureteričnih brstov s ponavljajočim se potencialom razvejanja. Cell Rep. 2020;32(4):107963.

16. Brown AC, Muthukrishnan SD, Oxburgh L. Sintetična niša za matične celice nefrona. Dev Cell. 2015;34(2):229–41.

17. Tanigawa S, Taguchi A, Sharma N, Perantoni AO, Nishinakamura R. Selektivno in vitro razmnoževanje nefronskih prednikov, pridobljenih iz zarodkov in pluripotentnih izvornih celic. Cell Rep. 2016; 15 (4): 801–13.

18. Li Z, Araoka T, Wu J, Liao H, Li M, Lazo M, Zhou B, Sui Y, Wu MZ, Tamura I, Xia Y, Beyret E, Matsusaka T, Pastan I, Rodriguez Esteban C, Guillen I , Guillen P, Campistol JM, Izpisua Belmonte JC. 3D kultura podpira dolgoročno širitev mišjih in človeških nefrogenih prednikov. Celična matična celica. 2016; 19 (4): 516–29.

19. Tsujimoto H, Araoka T, Nishi Y, Ohta A, Nakahata T, Osafune K. Majhna molekula TCS21311 lahko nadomesti BMP7 in olajša celično proliferacijo in vitro ekspanzijske kulture nefronskih matičnih celic. Biochem Biophys Res Commun. 2020.

20. Moriya N, Uchiyama H, Asashima M. Indukcija pronefričnih tubulov z aktivinom in retinojsko kislino v domnevnem ektodermu Xenopus laevis. Različna rast razvijalcev. 1993; 35: 123–8.

21. Brennan HC, Nijjar S, Jones EA. Specifikacija in inducibilnost rastnega faktorja pronefričnega glomusa pri Xenopus laevis. Razvoj. 1999; 126 (24): 5847–56.

22. Osafune K, Nishinakamura R, Komazaki S, Asashima M. In vitro indukcija pronefričnega kanala v eksplantih Xenopus. Različna rast razvijalcev. 2002;44(2):161–7.

23. Goto T, Hara H, Sanbo M, Masaki H, Sato H, Yamaguchi T, Hochi S, Kobayashi T, Nakauchi H, Hirabayashi M. Generation of pluripotent stem cell-derived mouse kidney in Sall1-targeted anephric podgane. Nat Commun. 2019; 10 (1): 451.

24. Fujimoto T, Yamanaka S, Tajiri S, Takamura T, Saito Y, Matsumoto N, Matsumoto K, Tachibana T, Okano HJ, Yokoo T. Generacija človeških ledvičnih veziklov v niši mišjega organa z uporabo sistema zamenjave nefronskih progenitornih celic. Cell Rep. 2020;32(11):108130.