1. del Preventivni učinki feniletanola glikozidi iz cistanche tubulosa na govejo serumsko albumin povzroči jetrno fibrozo pri podganah

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrakten

Ozadje:Cistanche tubulosa je tradicionalno kitajsko zeliščno zdravilo, ki se pogosto uporablja za uravnavanje imunitete.Fenil etanol glikozidov iz cistanche(CPhGs) iz te rastline so predvsem izkorisčljivi materiali. Cilj te študije je bil oceniti preventivne in terapevtske učinke CPhG na jetrno fibrozo, ki jo povzroči BSA, pri podganah in povezanih molekularnih mehanizmih, ki vključujejo celice jetrnih stelatov. Zdravilo Biejiarangan (BJRG), drugo tradicionalno kitajsko zeliščno zdravilo, je bilo uporabljeno kot pozitiven nadzor. Metode: Pri poskusih in vivo je bilo 75 podgan SD naključno razdeljenih v 6 skupin: normalne (obdelane z destilirano vodo), model (obdelane z BSA), pozitivno zdravilo (zdravljeno z BSA + BJRG 600 mg/kg/dan) in skupine, zdravljene z BSA + CPhGs (125, 250 in 500 mg/kg/dan). Indeksi jeter in vranice, koncentracije aspartata aminotransferaze v serumu (AST), alanin aminotransferaze (ALT), heksadekenoinska kislina (HA), laminin (LN), prokolagen tipa III (PCIII), kolagen tipa IV (IV-C), hidroksiprolin (Hyp) i transformacijski faktor rasti β1 (TGF-β1) izmereni su u podganama. Histopatološke ocene za fibrozo jeter so bile ocenjene za vsako skupino z uporabo H&E in Masson je trikroma madež. Izraz TGF-β1, kolagen I (Col-I) in kolagen III (Col-III) je bil določen z imunohistokemično metodo obarvanja. Ti učinki so bili nadalje ovrednoteni in vitro z določanjem ravni izražanja NF-κB p65 in Col-I s kvantitativnimi analizami PCR v realnem času. Col-I proteinski izraz so preučili tudi z zahodnim napihnjenim. Rezultati: Vse skupine odmerkov (125, 250 in 500 mg/kg/dan) CPhGs znatno zmanjšale indeks jeter in vranice, zmanjšale alt, AST, HA, LN, PCIII, IV-C serumske ravni, vsebnost TGF-β1 (P< 0.01,="" p="">< 0.01,="" and="" p="">< 0.01),="" and="" hyp="" content.="" cphgs="" also="" markedly="" alleviated="" the="" swelling="" of="" liver="" cells="" and="" effectively="" prevented="" hepatocyte="" necrosis="" and="" inflammatory="" cell="" infiltration.="" immunohistochemical="" results="" showed="" that="" cphgs="" significantly="" reduced="" the="" expression="" of="" tgf-β1="" (p="">< 0.01,="" p="">< 0.01,="" and="" p="">< 0.01),="" col-="" i,="" and="" col-iii.="" the="" in="" vitro="" effects="" of="" cphgs="" (100,="" 75,="" 50,="" and="" 25="" ug/ml)="" on="" hsc-t6="" showed="" that="" cphgs="" significantly="" reduced="" mrna="" expression="" of="" nf-κb="" p65="" and="" col-i,="" and="" cphgs="" also="" downregulated="" col-i="" protein="" expression.="" conclusions:="" cphgs="" have="" a="" significant="" anti-hepatic="" fibrosis="" effect,="" and="" may="" be="" used="" as="" hepatoprotective="" agents="" for="" the="" treatment="" of="" hepatic="">

Ključne besede: jetrna fibroza, Cistanche tubulosa, Fenilethanol glikozid, Kemokin BSA, Preventiva in terapija.

Ozadje

Jetrna fibroza je odziv za celjenje ran na hudo poškodbo jeter, ki se pojavi pri patogenezi kroničnega hepatitisa, ki ga povzročijo različni dejavniki. Ti dejavniki so virusna okužba, zloraba alkohola, holestaza ter presnovne in avtoimunske bolezni [1–3]. Postopno kopičenje zunajcelijske matrike (ECM) in zmanjšano preureditev motita normalno arhitekturo jeter, kar ima za posledico jetrno fibrozo [4]. Jetrna fibroza je kritična pri kronični bolezni jeter in se pogosto razvije v nepopravljivo cirozo in kancerogenezo. Trenutno ni metod ali učinkovitih zdravil za zdravljenje jetrne fibroze. Zato je nujno najti zdravilo proti jetrni fibrozi, ki bo otežlo napredovanje poškodb jeter fibroze in raka.Cistanche tubulosaW (iz družine Orobanchaceae) je parazitska rastlina, ki se široko goji v južni regiji Xinjiang na Kitajskem [5]. Ljudje jo običajno uporabljajo za poživljajoče ledvice, negujejo kri, sproščajo črevesje in zakasnijo senescenco. Uradno je navedena v kitajski farmakopeji [6]. C. tubulosa vsebuje različne aktivne sestavine. Ti vključujejoFenil etanol glikozidov iz cistanche(CPhGs), iridoidi in polysaccharides. Kot ena od številnih aktivnih komponent vC. tubulosa, CPhGs so v študijah in vivo in in vitro pokazale prepričljive antioksidante, anti-utrujenost, nevroprotektivne in protivnetne učinke [7]. V zadnjih letih so poročali, da so CPhGs(Fenil etanol glikozidov iz cistanche) imajo hepatoprotektivne učinke. Potencialni mehanizmi, na katerih so ti učinki, so hlajenje prostih radikalov, zaščita jetrnih membran, imunoregulacija, zaviranje apoptoze, zaviranje izražanja HBsAg in HBeAg ter zaviranje replikacije HBV DNK in drugih [8–11]. Vendar pa le malo študij v literaturi obravnava učinek grafike proti jetrni fibrozi. Zato je bila ta študija usmerjena v preiskavo učinka GPHC proti jetrni fibrozi z modelom govejega serumskega albumina (BSA), ki je pri podganah inducirajo jetrno fibrozo. Povezane molekularne mehanizme so raziskovali v celicah HSC-T6.

Metode

Kemikalije in reagenti

Hidroksiprolin komplet (alkalna hidroliza) (Lot: 20140616) je bil kupljen pri Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Kitajska). Podgana TGF-β1 sendvič ELISA kompleti (Lot: 238240615) so bili kupljeni od Lianke Biotech Co., Ltd. (Kitajska). Rabbit Anti-Collagen I protitelo (Lot: 140619), Rabbit Anti-Collagen III protitelo (Lot: 980788 W), in Rabbit Anti-TGF-β1 protitelo (Lot: 140619) je zagotovil Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., LTD (Kitajska). Zaprta z običajnim ovčjem serumu (delovna tekočina) (Lot: WP141214), PV-6000 (Lot: WK141225) in DAB komplet (Lot: K136621D) so bili kupljeni od Zhongshan Golden Bridge Biotech Co., Ltd. (Kitajska). Odkrivanje primarnih protiteles je bilo izvedeno z uporabo 2. Raztopina protiteles (Alk-Phos. konjugni, proti zajcu) in 2. Raztopina protiteles (Alk-Phos. Konjugnjena, protimiška) (lot: 272387) kupljena pri Invitrogen Company (ZDA). Albumin govejega seruma (BSA) (Lot: SLBG8239V) je bil kupljen pri Sigmi (ZDA). Pred uporabo je bila BSA pripravljena pri 18 g/L v normalni slanini, bakterijah, odstranjenih s filtracijo, in BSA, shranjenih pri 4 °C. Freundov nepopoln adjuvans, ki vsebuje 1 g lipida iz ovčje dlake (Lot: AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd(Kina,) je bio pomešan sa 2 g tečnih parafina (Lot: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (Kina,), steriliziran u parnoj autoklavi, i skladištio na 4 °C. Pozitivno zdravilo BJRG je bilo pridobljeno kot Biejiarangan tablete iz Notranje Mongolije Furui Medical Science Co, Ltd (Kitajska). Zaloge zdravil BJRG so pripravili z raztapljanjem tablet BJRG v destilirani vodi v koncentraciji 600 mg/kg.

Rastlinski materiali

C. tubulosa(družina Orobanchaceae) je bila kupljena v kitajski regiji Minfeng. Gradivo je potrdil raziskovalec Jun Zhao, Key Laboratory for Uighur Medicine, Inštitut Materia Medica iz Xinjianga. Vavčerski primerki so bili odlagani na Inštitutu Materia Medica iz Xinjianga.

Priprava CPhG(Fenil etanol glikozidov iz cistanche)

Posušeni in narezani revomiC. tubulosa(6,0 kg) so bili trikrat zaporedno izvleči pod refluksom s 70 % etanola, topilo pa je bilo odstranjeno, da se je izvlekel izvleček etanola. Ekstrakti etanola so bili očiščeni z ab-8 smolo za pridobitev fenil etanol glikozidov (CPhGs). Stock raztopine CPhGs, ki se uporabljajo za različne skupine odmerkov v študijah na živalih (500 mg/kg, 250 mg/kg, oziroma 125 mg/kg), so bile raztopljene v 0,5 % (5 g/L) karboksimetil celuloze (natrijeva sol).

Kvantifikacija CPhG(Fenil etanol glikozidov iz cistanche)

Vsebino dveh sestavnih delov (ehinakozid in akteozid) v CPhGs je HPLC določil z uporabo predhodno sporočene metode (Zhang et al. 2004) [12]. HPLC so izvedli z uporabo Shimadzu LC-10A HPLC, opremljenega z UV detektorjem. Stolpec HPLC je bil stolpec Phenomenex Gemini ODS (250 × 4,6 mm, 5 μm). Izokratska mobilna faza je bila sestavljena iz metanolacetonitrila-1 % ocete kisline (15:10:75, v/v/v). Izmik je bil 40 min, pretok pa je bil 0,6 ml/min. Temperatura stolpca je bila konstantna pri 30 °C. UV zaznavanje je bilo pri 334 nm.

Živali in mobilna linija HSC-T6

Zdrave odrasle moške podgane Sprague-Dawley (SD) (180–220 g) so bile kupljene v centru za živali Xinjiang Medical University, št. licence: SCXK (Novo) 2011–0004. Podgane so hranili brez specifičnega patogena (SPF) chow. Vse postopke v zvezi z poskusi na živalih je odobril Odbor za etiko živali prve povezane bolnišnice Zdravstvene univerze Xinjiang. Podgane so bile v kletkah pod nadzorovanimi okoljskimi pogoji (25 °C in 12 h svetlobnega/temnega cikla) in so imele prost dostop do standardne hrane za pelet podgane in vode iz pipe. Podgane so bile pred zdravljenjem aklimirane. V wuhan Procell Gene Biotechnology Co., LTD. (Wuhan, Kitajska) je bila pridobljena celična linija stelata podgane jetrnega stelata HSC-T6. Celice HSC-T6 so bile kultivirane v Dulbeccovem modificiranem orlovem mediju (visoka glukoza) (DMEM, Peking, Kina) dopolnjena s 10 % fetalnog govejeg seruma (Gibco, Južna Amerika), 100 IU/ml penicilina, i 100 μg/ml streptomicina (Peking, Kina) u vlažnom inkubatoru na 37 °C s 5 % CO2.

Poškodba in zdravljenje jeter, ki jih povzroči BSA

75 podgan SD je bilo naključno razdeljenih v šest skupin: normalno (destilirano z vodo), model (BSAtreated), pozitivno zdravilo (BSA, zdravljeno + BJRG 600 mg/kg/ dan) in BSA zdravljene + CPhGs(Fenil etanol glikozidov iz cistanche)(125, 250, 500 mg/kg/ dan). Skupine, zdravljene z BSA + CPhGs (125, 250, 500 mg/ kg/dan) so imele v vsaki skupini 13 podgan, druga skupina pa 12 podgan v vsaki skupini. Model poškodbe jeter, ki ga povzroči BSA, je razdeljen na primarno senzibilizacijo, ki ji sledi imunološki napad) [13]. Razen normalne skupine so druge skupine dajali več subkutanih injekcij z 0,5 ml (9 mg/ml) nepopolnim adjuvansom BSA Freund na 1. dan, 15. dan, 22. dan, 29. dan in 36. dan za primarno senzibilizacijo. Sedem dni po petem injiciranju so kri dobili s pleksusom mrežnične žile podgane in testirali na protitelesa proti albuminu v serumu. Protitelesa BSA v serumu podgane so odkrili z dvojno metodo difuzije agarja. Napad so izvedli z dajanjem 0,4 ml BSA v normalni soli skozi kavdalno veino pri podganah, pozitivnih na protitelesa BSA, dvakrat na teden desetkrat. Koncentracije in časi injekcij so bili 5,00, 5,50, 6,00, 6.50, 7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 i 10.00 g/L na dan 46, dan 50, dan 53, dan 57, dan 60, dan 64, dan 67, dan71, dan 74 i dan 78. V normalni skupini je bila normalna fiziološka raztopina uporabljena za imunološke primarne (senzibilizacije) in sekundarne (napadne) injekcije namesto BSA, druga stanja pa so bila enaka tistim v skupini modelov. Običajno skupino so peroralno dajali destilirano vodo z odmerkom 10 ml/kg/dan. Skupina modelov je bila peroralno dana 10 ml/kg/dan 0,5 % CMC-Na raztopine. Pozitivna skupina zdravil je bila peroralno dana 600 mg/kg/dan BJRG. Z BSA obdelani + CPhGs (125,

250 in 500 mg/kg/dan) peroralno dajali 125, 250 in 500 mg/kg/dan(Fenil etanol glikozidov iz cistanche)oziroma. Dnevne podgane za odmerjanje so se nadaljevale dva tedna po zadnjem injiciranju. Po poskusnem obdobju so podgane postele 12 h pred 10 % kloralnega hidrata in nato takoj evtanirale. Vzorci seruma so bili zbrani iz vsake podgane in takoj uporabljeni. Jetra so bila pobrana za dva namena: (1) konzerviranje v tekočem dušik za Hyp komplete in (2) fiksacijo v 10 % formaldehida za histološke in imunohistokemične preglede. Celotno trajanje študij na živalih je bilo 93 dni.

Indeksi jeter in vranice

Jetra in vranico so secrali z laparotomijo in jih umili s 4 °C normalne soli. Po vpijanju odvečne vode s filtrnim papirjem so bila jetra in vranica tehtana za izračun ustreznih indeksov: Relativna teža organov = masa organov (g)/posamezna telesna masa (g) × 100 % [14].

Poskusi celic

Celice HSC-T6 so bile na platirani plošči z 96-dobro. Sprva so bile celice kulture z DMEM, ki vsebujejo 10 % FBS za 48 h. Medij so nato zamenjali z DMEM brez FBS, da bi izgladnjeli celice za 12 h. Celice so bile nato kulturne z DMEM, ki je vseboval 5,0 ng/ml TGF-β1 (brez FBS) 24 h. Nazadnje, različne koncentracije CPHG(Fenil etanol glikozidov iz cistanche)(100ug/ml, 50ug/ml, i 25ug/ ml), akteozid (6 ug/ml, 3 ug/ml, i 1,5 ug/ml), i echinacoside (500ug/ml, 250ug/ml, i 125ug/ml) su izvedeni u ploči u četvernim buinama i inkubatorni 48 h.

Analiza PCR v realnem času

Raven mRNA izraza NF-κB, p65 in kolagenA I je bila določena s PCR v realnem času. Za določitev izrazov mRNA v celicah HSC-T6 so bile celice (4 × 105 celic) sesane v šest-dobro ploščah s 3 ml DMEM s 10 % FBS in inkubacijo čez noč pri 37 °C in 5 % CO2, po tem pa so medij celične kulture spremenili v DMEM brez seruma. Naslednje, CPhGs(Fenil etanol glikozidov iz cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml in 25 ug/ml), akteozid (6 ug/ml, 3 ug/ml in 1,5 ug/ ml) in ehinakozid (500 ug/ml, 250 ug/ml in 125 ug/ml). Po 48 h inkubacije s CPhGs ali monomerne sestave, skupaj RNK je bil ekstrahiran s TRIzol reagent (Invitrogen, ZDA) in močno vznemirjen s kloroformom za 15 s. Po 3 min sedenju pri sobni temperaturi je bil lysat centrifugiran na 12.000 × g 15 min pri 4 °C. RNA v vodeni fazi je bila oborina z izopropanolom, zgornja vodna faza pa je bila prenesena v novo mikrocentrifugno cev. RNK je bila oborina z dodajanjem 0,75 % etanola, po katerem je mikrocentrifugna cev in centrifugirana pri 12.000 × g pri 4 °C ne več kot 5 min. Supernatant so odstranili in RNK so posušili pri sobni temperaturi 5–10 min. Specifični seti primerkov (Sangon, Šanghaj, Kitajska), ki so se uporabljali za ojačitev podgane β-aktin [GenBank: NM_031144.3], Collagen I [GenBank: NM_ 053304.1], in NF-κB p65 [GenBank: NM_199267.2] geni so bili zasnovani z uporabo Batch Primer 3. Prednja (fw) in vzvratna (rv) primera sta bila naslednja: Kolagen I (fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG, rv: GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA), NF-κB p65 (fw: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG, rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA), β-actin (fw: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G, rv: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Rezultati so bili normalizirani na mRNA gospodinjskega gena β deluje kot notranja kontrola in so predstavljeni kot relativne ravni mRNA. Reakcije so bile izvedene z 8 μL iQ SYBR Green Supermix, 1 μL 10 pM primer parom, 8,5 μL destilirano vodo in 2,5 μL cDNA. Vsaka verižna reakcija polimeraze je bila izvedena pod naslednjimi pogoji: 95 °C za 3 min, nato 40 ciklov 10 s pri 95 °C, 30 s pri 55 °C in 10 s pri 55 °C – 95 °C za podaljšanje, nato pa enkratno merjenje fluorescence. Končni rezultati so bili opisani z relativnim vrednostima (2-ΔΔCt). Izračun in analizo je opravil sistem za zaznavanje PCR v realnem času.

Analiza zahodnih blot

Kolagen I (Abcam, Cambridge, ZDRUŽENO kraljestvo, art št.: ab34710) beljakovinske vrednosti so bile določene z zahodnim napihnjenim [z β-aktinom (Lot: 60008-1-lg; Proteintech, Kitajska) kot nadzor gospodinjstev. Celocelični ekstrakti so bili pripravljeni s pomočjo radioimunoprecipitacijskega assaya (RIPA) (Thermo Scientific, ZDA) s 1 % koktajli zaviralca halt proteaze (Thermo Scientific, ZDA) in 1 % koktajli zaviralca zaustavitve fosfataze (Thermo Scientific, ZDA). Koncentracija beljakovin je bila izmerjena in količinsko razvrščena z bradfordsko metodo [18]. Beljakovine (10–50 ug) so ločili na 10 % SDS-PAGE gel in se prenesli na PVDF membrane (Millipore, ZDA). Membrane so bile blokirane 1 h pri sobni temperaturi s 5 % BSA, primarna protitelesa (protitelesa proti kolagenu I, 1:200 redčenje ali mAb miške β-aktina, 1:5000 redčenje) pa so bila inkubatorna pri 4 °C čez noč. Pripadajoči Alk-Fos. sekundarnih protiteles inkubatorjev pri sobni temperaturi. Nazadnje so membrane trikrat izplili z 1 × Tris–HCl s 0,1 % Tween 20, signale pa je skeniral in vizualiziral GEL DOC XR Imaging System (Bio-Rad). Densitometrična analiza je bila izvedena na beljakovinah interesa in normalizirana β deluje gel DOC Image Studio programska oprema (Bio-Rad). β-aktin je bil uporabljen kot notranji nadzor.

Statistična analiza

Shapiro-Wilk test normalnosti in Leveneov test homogenosti variance sta bila uporabljena za preverjanje normalnosti in You et al. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 Stran 4 od 13homogene variance. Analiza variance (ANOVA), ki ji je sledil Tukeyjev po hoc testu, je bila uporabljena za ugotavljanje statističnih razlik v nehomogenih, običajno porazdeljenih podatkih. Za analizo podatkov, ki niso običajno porazdeljeni ali homogeni, so uporabili ne-parametrični test Kruskal-Wallis. Rezultati so bili izraženi kot ± sd. Pomen je bil določen na P< 0.05.="" all="" data="" were="" analyzed="" by="" spss="" 16.0="" software="" (xinjiang="" medical="">

Rezultati

Kvantitativna določitev CPHG

CPhGs v C. Tubulosa vsebuje dva feniletil alkoholna glikozid, ehinakozid i akteozid, a njihov vsebnost u CPhG-om je bila u skladu s HPLC analizom (sl. 1) 42,71 ± 0,42 % i 14,27 ± 0,18 %.

Indeksi jeter in vranice

Kot je bilo prikazano v preglednici 1, so bili indeksi jeter in vranice vzorčne skupine znatno povišani [P< 0.01,="" p="">< 0.05].="" the="" liver="" and="" spleen="" indices="" of="" the="" positive="" drug="" bjrg="" and="" cphgs="" at="" different="" dose="" groups="" were="" significantly="" reduced="" compared="" with="" the="" model="" group="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0.004," pliver="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="0.070," respectively].="" the="" liver="" and="" spleen="" indices="" were="" lower="" than="" those="" of="" the="" model="">

Učinki CPhG na ALT, aktivnosti AST in označevalci jetrne fibroze

V sedanji študiji so bile vrednosti jetrnih encimov AST in ALT v serumu znatno povečane v skupini modelov, kar je odražalo okvaro jetrne celice pri podganah s fibrozo jeter, ki so jih povzročile BSA. Vendar pa poskusi.

(600 mg/kg) in CPhGs (125, 250 in 500 mg/kg) bistveno zmanjšalo AST [PAST< 0.001,="" past="">< 0.001,="" past="">< 0.001,="" past="">< 0.001,="" respectively]="" and="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189," palt="0.255," respectively]="" levels="" in="" hepatic="" fibrosis="" rats.="" (table="" 2).="" the="" levels="" of="" ha,="" ln,="" pc="" and="" iv-c="" in="" model="" rats="" were="" significantly="" increased="" [pha="">< 0.001,="" pln="">< 0.001,="" ppciii="0.002," piv-c="">< 0.001,="" respectively].="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" levels="" of="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007," pha="0.009," pha="0.023," respectively],="" ln="" [pln="0.011," p="" ln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069," respectively],="" pc="" iii="" [p="" pciii="0.006," p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," respectively],="" and="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001,="" respectively]="" in="" rats="" were="" markedly="" decreased="" by="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" and="" cphgs="" at="" different="" dose="" groups="" (125,="" 250,="" and="" 500="" mg/kg)="" (table="" 3).hyp="" content="" and="" tgf-β1="" collagen="" content="" was="" also="" detected="" by="" measuring="" hyp="" levels="" in="" liver="" tissue.="" as="" shown="" in="" table="" 4,="" the="" mean="" hyp="">skupinah modelov bistveno višja od normalne skupine, vendar se je v skupini BJRG in različnih skupinah odmerkov CPhGs občutno zmanjšala. Jetrna koncentracija TGF-β1 vzorčnih skupin pri podganah se je znatno povečala [P< 0.001].="" compared="" with="" the="" model="" group,="" tgf-β1="" levels="" of="" the="" positive="" drug="" and="" the="" different="" cphgs="" dose="" groups="" were="" markedly="" decreased="" [p="" tgf-β1="">< 0.001,="" p="" tgf-β1="">< 0.001,="" p="" tgf-β1="">< 0.001,="" ptgf-β1="">< 0.001,="" respectively].="" the="" results="" are="" summarized="" in="" table="">

Histopatološki pregled

Opažanja normalnih jetrnih tkiv, ki so vidni z H&E in Massonovim trikromom, izkažejo ločene jetrne lobule in jetrne sinusoide. Struktura jetrnega tkiv v modelu podgan je bila neuporabna, jetrno tkivo in jetrne sinusoide pa je nadomestila velika količina povezovalnega tkivo. Vendar pa so v skupini za zdravljenje odkrili bolj normalno citoarhitekturo in manj povezovalno tkivo kot v skupini z modelom.

H&E madež

V normalni skupini so opazili strukturno celovitost jetrnih lobule brez nenormalnih portalnih območij in jetrnih sinusoidov. Jetrne vžigalice so bile urejene urejeno, z jedrom okroglo in jasno. Jedra se nahajajo v središču celice, z obilnim citoplazmom. Le območje portala ima majhno količino vlaknastega tkivo (slika 2a). V skupini modelov je bila lobularna struktura močno poškodovana. Jetrne celice so pokazale blago vodeno degeneracijo, večinoma degeneracijo balonov in/ali maščobno degeneracijo. Opazili so tudi nastanek vnetne celične infiltracije, obsežno hiperplazijo vlaknastih tkiv, nastanek velikega števila vlaknastih septumov, razdeljenih lobulov in znatnega proliferacije jetrnih celic. Ta opažanja so potrdila uspeh vzpostavitve imunskega modela imunske poškodbe podgane živalskega modela jetrne fibroze (slika 2b). V primerjavi s skupino modelov se je v različnih CPhGs zmanjšala vnetna infiltracija celic. Opazili so tudi manj nekroze in maščobne degeneracije jetrnih celic ter lajšanje fibroze. CPhGs znatno ublažili patologijo jetrne fibroze, ki jo je povedla BSA, pri podganah, ublažili otekanje jetrnih celic in učinkovito preprečili infiltracijo hepatocitov in vnetnih celic, kar kaže, da CPhGs učinkujejo zaščitno na BSA-inducirano podgano jetrno fibrozo. (slika 2c–f). Massonov trikromni madež V normalni skupini je bilo tkivo jeter normalno. Območje jetrnega portala je pokazalo majhno število modrih kolagenskih vlaken, jetrno tkivo pa je bilo običajno strukturirano (slika 3a). V primerjavi z jetrnim tkivom normalne skupine se je vlaknato tkivo, ki se širi s centralnim navodilom, razširilo v jetrni parenhim. Kolagenska vlakna, razširjena in povezana in

okrožila celotno lobulo in obkrožila centralno Ti učinki so skupaj s fibrozo hepatocita, lobularnimi strukturnimi poškodbami, periportalno fibrozo in tvorbo pseudolobula (slika 3b) predložili dokaze, da je bil model ustanovljen. V primerjavi s skupino modelov so bila kolagenska vlakna v skupini za pozitivno kontrolo drog rahlo razširjena navzven od območja perifernega portala (slika 3c). V primerjavi s skupino modelov so se kolagenska vlakna v različnih skupinah odmerkov CPhGs bistveno zmanjšala, inhibatorna je bila proliferacija vlaken in znatno zmanjšano razmnoževanje vlaknastega tkivo znotraj parenhimov jeter. Ti rezultati kažejo, da so CPhGs ščitil podgane pred fibrozo jeter, ki jo je pognala BSA (slika.3d–f).

Imunohistokemično madež

Pomembno je, da izraz kolagena tipa I in kolagena tipa III igrata bistvene vloge pri razvoju jetrne fibroze, njihova generacija in deponiranje v jetrnem tkivu pa bi lahko služila kot pomembna determinanta učinkovitosti protijetrne fibroze. Rezultati so povzeti v preglednici 5

Kolagen tipa I

Normalna skupina je izrazila kolagen tipa I predvsem v krvnih žilah in območju portala. Modelska skupina zelo izražena kolagenska fibroza tipa I na portalnih območjih. V prostoru Disse so opazili madeže kolagena tipa I ali kot obližno porazdelitev. Kolagen je obložil vlaknasti septa za oblikovanje pseudolobule. V teh poskusih je bilo za zdravilo BJRJ (600 mg/kg) in različnih skupin odmerkov CPhGs (125, 250, i 500 mg/kg) [PCol I = 0.002, PCol I = 0.001, PCol I = 0,023, i P Col I = 0,044, respectively]. Polkvantitativne rezultate so pokazale, da je bil izraz njihovega kolagenskega tipa I v primerjavi s skupino modelov bistveno nižji (slika 4).

Kolagen tipa III

Kolagen tipa III je bil v normalni skupini šibko izražen, obrobna območja, ki obdajajo portal in jetrne žile, pa so namesto neprekinjenih vlaken (slika 5a) prikazala majhno količino fino rumene barve. V skupini modelov so kolagenska vlakna razstavljala široke in debele vžige, kar kaže na močan izraz, ki se nahaja predvsem v predelih portala in vlaknastih tkiv (slika 5b). Kolagenska vlakna BJRJ (600 mg/kg) in različne skupine odmerkov CPhGs (125, 250 in 500 mg/kg) so bila filamentna in porazdeljena po osrednjih delih venice in portala. V primerjavi s skupino modelov so bila kolagenska vlakna znatno zmanjšana, obarvanje je bilo bledo in tanko, imunohistokemično obarvanje pa je bilo šibko pozitivno (slika 5c–f). Ti polkvantitativni rezultati kažejo, da so se pozitivno izražene celice v skupinah pozitivnih in različnih odmerkov [PCol III = 0,015, PCol III = 0,001, PCol III = 0,010 in P Col III = 0,037] razlikovali od tistih v skupini modelov.

TGF-β1

V normalnih podganah jetrnih celic ni bilo malo izraza TGIF-β1. Izraz je bil omejen na majhno število intersticijskih celic (slika 6a). V skupini modelov je bil izraz TGF-β1 široko porazdeljen na območju portala, vlaknatih prostorov, celic jetrnih stelatov, vnetnih celic, sinusoidne stene in citoplazme. Na določenem območju portala je bil izražen močno pozitiven izraz z rjavkasto-rumenim obarvanjem (slika 6b). V območju portala in vlaknasti septi BJRJ (600 mg/kg) in različnih skupinah odmerkov CPhGs (125, 250 in 500 mg/kg) je bila izražena majhna količina izraza. Obseg pozitivnih madež v teh skupinah je bil v primerjavi s skupino modelov znatno zmanjšan. Obarvanje v intersticijskih celicah v vlaknasti septi in citoplazma vnetnih celic se je zmanjšalo (slika 6c–f). Polkvantitativni rezultati so pokazali, da so BJRJ in različne skupine odmerkov CPhGs [P TGF-β1 = 0,001, P TGF-β1< 0.001,="" p="" tgf-β1="0.009," ptgf-β1="0.004," respectively]="" were="" significant="" compared="" with="" the="" model="" group.="" as="" mentioned="" earlier="" in="" the="" article,="" tgf-β1="" is="" an="" important="" cytokine="" in="" the="" pathophysiology="" of="">

fibrozo, ki spodbuja proizvodnjo zunajcelične matrike [19]. Pokazali smo, da se je raven TGF-β1 v skupini modelov povečala na način, ki je skladen z resnostjo fibroze jeter. Izražene vrednosti TGF-β1 v jetrih so bile skladne s koncentracijo TGF-β1 v serumu. To kaže, da lahko CPhGs znatno zmanjša fibrozo jeter zaradi izražanja TGF-β1 s sodelovanjem pri sintezi in degradacijo ECM. Izraz kolagena tipa I, kolagena tipa III in TGF-β1 lahko zazna patološki proces jetrne fibroze. Njihova raven izražanja v skupinah za zdravljenje se je znatno zmanjšala in ponazoril, da lahko CPhGs izboljšajo aktivnost kolagenaze, ohranjajo dinamično ravnovesje sinteze in razgradnje jeter ECM ter tako odlašajo in preprečujejo nastanek fibroze jeter.