Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Kliknite tukaj za 2. del

Cistanche ima zelo dober nevroprotektivni učinek

Gabriel Gonzalez 1,2 , Jiˇrí Grz 1, Cosimo Walter D'Acunto 1, Petr Kaˇnovsk2 in Miroslav Strnad1,2,*

1. Laboratorij za regulatorje rasti, Inštitut za eksperimentalno botaniko Češke akademije znanosti,

in Fakulteta za znanost, Univerza Palacký, Šlechtitel ˚u 27, CZ-78371 Olomouc, Češka republika;

Gonzalez.gabriel@seznam.cz (GG); jiri.gruz@upol.cz (JG); waldacun@gmail.com (CWD)

2. Oddelek za nevrologijo, Univerzitetna bolnišnica Olomouc in Fakulteta za medicino in zobozdravstvo,

Univerza Palacký Olomouc, CZ-775 20 Olomouc, Češka; Petr.Kanovsky@fnol.cz

* Korespondenca: miroslav.strnad@upol.cz; Tel.: plus 420-585-634-850

Povzetek: Citokininiso fitohormoni na osnovi adenina, ki uravnavajo ključne procese v rastlinah, kot so delitev in diferenciacija celic, rast korenin in poganjkov, apikalna dominanca, razvejanje in kalitev semen. V preliminarnih študijah so pokazali tudi zaščitno delovanje proti človeškim nevrodegenerativnim boleznim. Da bi razširili poznavanje zaščite (varstvene dejavnosti), ki jo ponujajo, smo raziskovali dejavnosti naravecitokininiproti toksičnosti, ki jo povzroča salsolinol (SAL) (aParkinsonova bolezenmodel) in z glutamatom (Glu) povzročena smrtnevron-podobne dopaminergične celice SH-SY5Y. Ugotovili smo, da so bili kinetin-3-glukozid, cis-zeatin ribozid in N6-izopentenil adenozin aktivni v modelu PD, ki ga povzroči SAL. Poleg tega so trans-, cis-zeatin in kinetin skupaj s kelatorjem železa deferoksaminom (DFO) in zaviralcem nekroptoze nekrostatinom 1 (NEC-1) znatno zmanjšali stopnjo celične smrti v modelu, ki ga povzroča Glu. Testi laktat dehidrogenaze so pokazali, dacitokininizagotovljena nižjanevroprotektivnodejavnost kot DFO in NEC-1. Poleg tega so zmanjšali aktivnosti apoptotične kaspaze-3/7 manj močno kot DFO. Vendar pa jecitokininiimela zelo podobne učinke kot DFO in NEC-1 na proizvodnjo superoksidnih radikalov. Na splošno so pokazali zaščitno aktivnost v modelu, ki ga povzroča SALparkinsonikanevronskicelične smrti in Glu-inducirani model oksidativne poškodbe predvsem z zmanjšanjem oksidativnega stresa.

Ključne besede: citokinin; fitohormon; nevroprotekcija; nevronom podobne celice SH-SY5Y; citotoksičnost; salsolinol; glutamat; oksidativni stres; Parkinsonova bolezen

rastlina cistančao učinkih naNevroprotekcija

1. Uvod

Parkinsonova bolezen(PB) je druga najpogostejša nevrodegenerativna bolezen, povezana z motoriko, in pričakuje se, da bo število globalno diagnosticiranih primerov naraslo s 6 milijonov leta 2015 na več kot 12 milijonov do leta 2040 [1]. Zanj so značilni motorični simptomi, povezani s specifično degeneracijo in izgubo približno 30–70 odstotkov dopaminergičnega (DA)nevroniv substantia nigra pars compacta in njihove projekcije na striatum [2,3]. Nekatere od mnogih znanih molekularnih značilnosti PD vključujejo povečan oksidativni in nitrozativni stres, mitohondrijsko disfunkcijo [4–7], ekscitotoksičnost [8], disfunkcijo ubikvitin/proteasomalnega sistema [9] in nevroinflamacijo [10]. Trenutna zdravljenja imajo različne neželene stranske učinke in nudijo le simptomatsko olajšanje [11], zato si močno prizadevamo za razvoj zdravil z učinkovitimi kurativnimi učinki na degenerirajočo DA.nevroni. Viri, ki lahko pomagajo takim prizadevanjem, vključujejo naravne spojine, ki imajo običajno manj stranskih učinkov. Med drugim so snovi iz ginka bilobe (ginkgetin, ginkolid, bilobalid), ginsenga (ginsenozidi) in flavonoidi (baikalein, kaempferol, rutin in luteolin) pokazale široko zaščitno delovanje v več modelih in vitro (vključno s celično linijo človeškega nevroblastoma SH -SY5Y) in in vivo modeli PD, povzročene z 1,1'-dimetil-4,4'-bipiridinijevim dikloridom (parakvat), 1-metil- 4-fenil-1, 2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP), 1-metil-4-fenilpiridinij (MPP plus ) in 6-hidroksidopamin (6-OHDA) [12].

Tu predstavljena študija se je osredotočila na učinke razreda naravnih fitohormonov, imenovanihcitokinini(CK), in njihovi metaboliti, ki so dobro znani regulatorji celične delitve, rasti, diferenciacije in staranja listov v rastlinah [13]. Strukturno so CK derivati ​​adenina, substituirani na položaju N6- s prenilno (izopentenilno) ali aromatsko stransko verigo. Naravne oblike vključujejo 6-(E)-4-hidroksi-3-metil but-2-enilaminopurin (trans-zeatin, tZ), njegov 6-(Z)-izomer ( cis-zeatin, cZ), N6-izopentenil adenin (iP), 6-benzil amino purin (BAP), 6-furfurilaminopurin (kinetin, K) in orto-, meta-, in para-hidroksilirani ali metoksilirani derivati ​​BAP, imenovani topolini (oT, mT, pT, MeoT, MemT, MepT). Pogosto se pojavljajo tudi različni 9-ribozidi, 9-nukleotidi ter 7-, 9 in O-glukozidi teh oblik, kot je prikazano v tabeli 1. Poleg njihovih nativnih vlog v rastline, so CK-ji pokazali močno antoksidantno aktivnost proti reaktivnim kisikovim spojinam (ROS), ki zagotavlja zaščito v več in vitro stresnih modelih motenj, povezanih s staranjem [14].

Tabela 1. Strukturecitokininiin sredstva za pozitivno kontrolo.

Zlasti CK naj bi imele citoprotektivno aktivnost v modelih, kot sta celična smrt človeških fibroblastov [15], ki jo povzroča H2O2-, in glikoksidativni stres, ki ga povzroča D-galaktoza, v astrocitih podgan [16]. Še pomembneje pa je, da so v tem kontekstu pokazalinevroprotektivnoučinki v modelih, povezanih z nevrodegenerativnimi boleznimi, kot je družinska PD, toksičnost, povzročena z zaviralcem proteasomov MG 132-ali H2O2-v celicah SH-SY5Y [17], z Glu povzročena oksidativna poškodba mišjega hipokampusa HT22nevronskicelic [18] in celični model PC12 Huntingtonove bolezni [19]. Druge študije kažejo, da zaščitne aktivnosti CK vključujejo neposredno [20,21] in posredno [15,16,22] modulacijo celičnih redoks sistemov. Poleg značilnih antioksidativnih aktivnosti CK naj bi imeli tudi regulativne učinke v mitohondrijih, ki povečujejonevronskisposobnost preživetja [17]. Poleg tega lahko K ​​stabilizira potencial mitohondrijske membrane in poveča proizvodnjo ATP, s čimer ublaži Glu-inducirano smrt celic HT22 [18]. Vendar je kljub ugotovitvam o njihovih učinkih v več modelih malo znanja o zaščitni aktivnosti CK pri najpogostejši (občasni) obliki PD.

Da bi odpravili zgoraj opisano vrzel v znanju, smo sistematično ovrednotili učinke naravnih CK in njihovih metabolitov v dveh modelih in vitro: modelu PD, ki ga povzroča salsolinol (SAL), in modelu oksidativne poškodbe, ki ga povzroča glutamat (Glu).nevron-kot celice SH-SY5Y. Ta linija je bila uporabljena zaradi njenega dopaminergičnega fenotipa, občutljivosti na dopaminergične toksine, kot je SAL, in priročne tvorbe relativno stabilnih populacij diferenciranihnevronskicelice z zmanjšano stopnjo proliferacije po 48-urni izpostavljenosti 10 uM all-trans retinojske kisline (ATRA) [23–25].

Nevron-podobne celice so bile izpostavljene endo/eksotoksinu SAL, da bi oponašale patologijo PD prek disfunkcije celičnega redoks sistema: izčrpanje glutationa (GSH) in inhibicija aktivnosti antioksidantnih encimov (Cu/Zn superoksid dismutaza in katalaza) in mitohondrijskih kompleksov (I in II), kar vodi do apoptoze in nekroze [26]. V drugem modelu povzroči Glu potencialno smrtonosno oksidativno škodo z motnjami redoks sistema. Oba modela v celični liniji SH-SY5Y sta bila predhodno uporabljena v študijah nevroprotekcije [26,27].

Preizkušene so bile citoprotektivne in/ali antioksidativne aktivnosti, povezane z degenerativnimi motnjami K, iP, BAP, iPR, tZR in njihovih prostih baz, in (kot je navedeno zgoraj) je bilo ugotovljeno, da imajo nekateri CK zaščitne aktivnosti vnevronskicelice. Vendar pa nobena prej objavljena študija ni preučila strukture-nevroprotektivnorazmerje aktivnosti (SAR) naravnih CK (tabela 1). Zato je bila ta študija izvedena za preučitevnevroprotektivno(proti-parkinsonika) aktivnosti skoraj vseh znanih naravno prisotnih CK v izbranih modelih nevrodegeneracije, povzročenih s SAL in Glu. Najprej smo ovrednotili absorbanco kisikovih radikalov (ORAC) in (v varnostnih testih) citotoksičnost vsakega od CK.nevron-kot celice SH-SY5Y. Nato smo ovrednotili nevroprotektivne učinke spojin in vpliv na ravni oksidativnega stresa z merjenjem proizvodnje superoksida (O2.) (dihidroetidij, DHE test) in aktivnosti apoptotične kaspaze-3,7. Rezultati zagotavljajo prve poročane sistematične indikacije odnosov med naravnimi strukturami CK innevroprotektivnodejavnosti.

Cistanche herbaima zelo dobronevroprotektivnoučinek

2. Rezultati in razprava

2.1. Absorbcijska zmogljivost kisikovih radikalov citokininov (ORAC)

Ker so nevrodegenerativne bolezni povezane s povečanim oksidativnim stresom, ima antioksidativna aktivnost ključno vlogo pri obrambinevronskicelice. Za oceno biološkega potenciala CK v tem pogledu je bila antioksidativna zmogljivost določena z ORAC, ki se običajno uporablja za določanje antioksidativne sposobnosti snovi [28]. Antioksidativna zmogljivost je bila izražena kot Trolox ekvivalenti (TE), ki določajo učinkovitost (nižjo proti višji) spojin kot Trolox na ekvimolarni osnovi. Rezultati, predstavljeni v tabeli 1, kažejo, da imajo topolini (oT, mT in pT) in njihovi ribozidi (oTR, mTR, pTR) visoko antioksidativno aktivnost, ki je verjetno tesno povezana z z elektroni bogatim sistemom njihovega C{{ 3}}hidroksi benzil amino substituent. Kljub visokim vrednostim ORAC topolini niso imeli visokihnevroprotektivnodejavnost. Vendar pa več heteroaromatskih CK, vključno s K (N6-furfurilaminopurinom) in nearomatskim cis-zeatin-O-glukozidom (cZOG), ki ima 4-hidroksi-3-metilbut{{7} }en-1-il)amino substituent, prav tako pokazala visoko antioksidativno zmogljivost (tabela 2). Drugi metaboliti CK – vključno s kinetin-3-glukozidom (K3G), kinetin ribozidom 5<-monophosphate (kmp),="" kinetin-9-glucoside="" (k9g),="" and="" trans-zeatin=""><- monophosphate="" (tzmp)—had="" moderate="" antioxidant="" activity.="" all="" the="" others="" had="" detectable="" capacity="" except="" bap.="" these="" results="" confirm="" previous="" findings="" that="" ip,="" pt,="" k="" can="" act="" as="" direct="" radical="" scavengers,="" but="" conflict="" with="" the="" previously="" reported="" activity="" of="" bap="" in="" the="" orac="" test="" [20,21].="" to="" conclude,="" these="" compounds="" have="" potential="" in="" the="" treatment="" of="" neurodegenerative="" diseases="" associated="" with="" increased="" oxidative="" stress="">

koristi stebla cistanchenaproti Alzheimerjevi bolezni

2.2. Diferenciacija celic SH-SY5Y

Za študij CK-jevnevroprotektivnoučinki so bile celice nevroblastoma SH-SY5Y (izbrane zaradi že opisanih razlogov [23]) diferencirane z izpostavljenostjo 10 uM ATRA 48 ur, kot je opisano prej [23, 24]. Nato so jih obarvali s kompletom za barvanje membrane, da bi preučili morfološke razlike med nediferenciranimi in diferenciranimi celicami. Kot je prikazano na sliki 1A, jenevron-podobne diferencirane celice so rasle manj gosto, bile so daljše in so proizvedle več nevritov (označenih z rumenimi puščicami na sliki) kot nediferencirane celice. Te morfološke spremembe, povezane z diferenciacijo, so že prej opazili, tudi po krajši izpostavljenosti (24 ur) ATRA [24, 30]. Še pomembneje je, da število nevritov dramatično naraste do ravni, ko lahko ustvarijo nevritno mrežo. Iz tega razloga je bila izmerjena viabilnost celic za primerjavo stopnje proliferacije nediferenciranih in diferenciranih celic SH-SY5Y. Sposobnost preživetja nediferenciranega SH-SY5Y je bila vzeta kot največja stopnja proliferacije. Rezultati prisotni v

Slika 1B prikazuje, da se je stopnja proliferacije (ocenjena s preizkusom sposobnosti preživetja Calcein AM) SH-SY5Y zmanjšala za 23 odstotkov po 48-urnem zdravljenju z ATRA.

Slika 1. (A) Fluorescentne mikrofotografije celic SH-SY5Y z membranami, obarvanimi s kompletom za rast Neurite (Invitrogen™): kontrolne, nediferencirane celice (izpostavljene lažni raztopini za zdravljenje:<0.1% dmso);="" cells="" differentiated="" by="" exposure="" to="" 10="" um="" all-trans="" retinoic="" acid="" (atra)="" for="" 48="" h.="" bars="50" um.="" (b)="" proliferation="" rates="" of="" undifferentiated="" and="" differentiated="" sh-sy5y="" cells:="" numbers="" of="" viable="" cells="" after="" 48="" h="" exposure="" to=""><0.1% dmso="" and="" 10="" um="" atra,="" respectively.="" data="" were="" obtained="" from="" five="" independent="" experiments="" with="" triplicate="" cultures:="" asterisks="" show="" the="" significance="" of="" differences="" in="" numbers="" of="" viable="" cells="" (as="" percentages="" of="" numbers="" of="" undifferentiated="" cells)="" between="" the="" cultures:="" *="" p="" <="">

Tabela 2. Kapaciteta absorpcije kisikovih radikalov (ORAC) testiranihcitokinini(CK), izraženo kot Trolox ekvivalenti (TE) na ekvimolarni osnovi. Imena, okrajšave in strukture CK so predstavljene na sliki 1.

2.3. Citotoksičnost citokininov proti nevronom podobnim celicam SH-SY5Y

V testih potencialne citotoksičnosti CK s testom viabilnosti Calcein AM [31] je večina pokazala nizko toksičnost zanevron-kot celice SH-SY5Y. Zmanjšanje sposobnosti preživetja pod 90 odstotkov je veljalo za prag za nevrotoksični učinek. Edini dve izjemi sta bili KR (11,9 odstotka ) in pTR (10,5 odstotka ), v skladu s prejšnjimi ugotovitvami, da nekatericitokininametaboliti, zlasti ribozidi, imajo lahko citotoksične učinke [32]. Drugi ribozidi, kot so cZR, iPR, oTR, mTR, niso povzročili očitnega zmanjšanjanevron-podobna sposobnost preživetja celic SH-SY5Y (tabela 3). Za DFO [33,34] in NEC-1 [35,36], uporabljena kot pozitivni kontroli v našem modelu in vitro, so tudi druge študije na celicah SH-SY5Y dokazale, da niso strupeni. Skratka, večinoma derivata KR in pTR sta pokazala nižjo sposobnost preživetja od 90 odstotkov in sta se zato štela za manj zanimiva za nadaljnje vrednotenje v obeh in vitro modelih nevrodegeneracije.

Tabela 3. Viabilnost celicnevron-podobne celice SH-SY5Y po ​​izpostavljenosticitokininiza 24 ur. Viabilnost je izražena kot odstotek kontrole DMSO.

2.4. Identifikacija nevroprotektivnih citokininov v modelu PD, ki ga povzroči SAL

Za te teste,nevronskiCelice SH-SY5Y smo diferencirali 48 ur, nato pa sočasno obdelali s 500 uM SAL in vsako CK v treh koncentracijah (0,1, 1, 10 uM). Kot je prikazano s pikčasto črto na sliki 2A, je uporaba nevrotoksina SAL pri 500 uM zmanjšala sposobnost preživetja diferenciranih celic SH-SY5Y glede na preizkus Calcein AM za 30 odstotkov. N-acetilcistein (NAC) je bil v teh testih uporabljen kot pozitivna kontrola zaradi nevroprotektivnega učinka, o katerem so poročali v istem in vitro modelu SH-SY5Y [37]. Koncentracije 10, 100 in 1000 uM NAC so bile uporabljene za induciranje delnega ali skoraj popolnega okrevanja v modelu SAL. NAC je lahko povečal viabilnost celic pri koncentraciji 100 uM in 1 mM, kar ustreza 83,39 ± 1,74 odstotka oziroma 89,21 ± 2,89 odstotka. Zaščitna aktivnost NAC pri 100 uM (označena s črtkano črto na sliki 2A) je bila uporabljena kot prag moči za izbiro CK za nadaljnje teste. Glede na to nastavitev so opazili biološko pomembne nevroprotektivne aktivnosti pri K3G pri 10 uM (81,84 ± 2,36 odstotka), cZR pri 0,1 uM (81,14 ± 2,30 odstotka) in 1 uM (81,53 ± 2,24 odstotka) ter iPR pri 1 uM (82,43 ± 2,51 odstotka). Tako sta bila iPR in cZR učinkovita nevroprotektorja pri nižjih mikro ali submikromolarnih koncentracijah kot NAC. Thecitokininapresejanje je tudi pokazalo, da lahko številni drugi metaboliti zmerno povečajo sposobnost preživetja diferenciranih celic SH-SY5Y, izpostavljenih SAL. Vendar so imeli nekateri testirani CK (vključno s tZR, tZMP, mT, mTR, pT in pTR) zelo majhen zaščitni učinek.

Slika 2. (A)Nevroprotektivnodejavnostcitokininiin N-acetilcistein (NAC) v modelu PD, ki ga povzroči SALnevron-kot celice SH-SY5Y. Črtkana črta prikazuje prag učinka NAC, pri kateremcitokininiizbrani za nadaljnje testiranje; črtkana črta nato šteje število živih celic v testu Calcein AM po obdelavi celic s 500 uM SAL; zdrave kontrolne celice (CTR, DMSO < 0,1="" odstotka).="" potrojni="" v="" najmanj="" treh="" ločenih="" dneh.="" (b)="" normalizirana="" celična="" smrt="" sh-sy5y="" po="" ​​obarvanju="" s="" propidijevim="" jodidom.="" potrojni="" v="" najmanj="" petih="" neodvisnih="" dneh.="" *="" p="" v="" primerjavi="" z="" vozilom="" s="" 500="" um="" sal,="" #="" p="" v="" primerjavi="" z="" vozilom="" brez="" 500="" um="">

Za potrditev najaktivnejših naravnih anti-PD aktivnosti CK so bile splošne stopnje celične smrti kvantificirane z barvanjem s propidijevim jodidom (PI), ki (v nasprotju s testi preživetja, ki temeljijo na celičnem metabolizmu) označi le celice z okvarjeno celovitostjo membrane, umirajoče celice in že odmrle celice [38]. Rezultati so bili normalizirani glede na stopnjo celične smrti po zdravljenju samo s SAL (nastavljeno na 100 odstotkov). Kot je prikazano na sliki 2B, je pozitivna kontrolna snov NAC znatno zmanjšala stopnjo celične smrti pri 100 in 1000 uM (na 77,3 ± 2,21 odstotka oziroma 77,5 ± 4,44 odstotka). Na splošno se je NAC izkazal za anevroprotektivnosredstvo s primerljivimi aktivnostmi, kot so bile zabeležene v drugih študijah na način, odvisen od odmerka (v območju 50–500 uM) za celice SH-SY5Y [37]. Test PI je tudi pokazal, da imajo CK cZR, K3G in iPR zaščitne aktivnosti, zlasti cZR, kar je zmanjšalo stopnjo celične smrti na 71,6 ± 5,08 odstotka pri 0,1 uM. V nasprotju s cZR je imel K3G obrnjene učinke, odvisne od odmerka, z največjo aktivnostjo pri 10 uM (zmanjšanje stopnje celične smrti na 75,0 ± 3,69 odstotka), aktivnost NPR pa je dosegla vrh pri 1 uM (zmanjšanje stopnje na 73,9 ± 4,99 odstotka). Skupaj, kot je prikazano na sliki 2, so CK zagotovili primerljivonevroprotektivnoaktivnost do 100 uM NAC glede na teste viabilnosti in citotoksičnosti. Poleg tega so bile učinkovite koncentracije CK, kot sta cZR in iPR, veliko nižje od koncentracij NAC v submikromolarnem in mikromolarnem območju. Prejšnja opažanja, pridobljena po dvojnem barvanju s PI in aneksinom V/PI, kažejo, da lahko K ​​zmanjša apoptozo [39], zato smo raziskali tudi učinke CK in NAC na oksidativni stres in aktivacijo kaspaze-3,7 (dobro znani marker apoptoze).

2.5. Citokinini zmanjšajo tvorbo superoksidnih radikalov, ki jo povzroči SAL

Oksidativni stres (OS) je ključni patološki dejavnik, ki prispeva k več nevrodegenerativnim boleznim, tako SAL (pri > 100 uM) kot tetrahidroizokinolini so močni induktorji OS [26, 40]. Tako smo izmerili tudi tvorbo superoksida (ROS in pomemben marker OS) v prisotnosti SAL z in brez izbranih CK ali NAC. Da bi zagotovili, da je SAL povzročil zadostno škodo OS v celicah SH-SY5Y za odkrivanje odzivov, so bile celice izpostavljene 500 uM SAL za 24 ur, kot v prejšnjem delu [37] in v skladu z zgoraj predstavljenimi ugotovitvami. Celice smo nato obarvali z dihidroetidijem (DHE), da bi odkrili tvorbo superoksidnega radikala [41, 42]. Kot je razvidno iz slike 3A, so bile celice vizualno opazovane po označevanju z DHE (ki zagotavlja rdeče fluorescenčne signale po reakciji s superoksidom). SAL je povzročil jasno povečanje fluorescence DHE v primerjavi z ravnmi v kontrolnih celicah in celicah, zdravljenih z NAC. Poleg tega so imeli trije CK (cZR, K3G in iPR) podobne vizualne učinke kot NAC (100 uM) na fluorescenco DHE. Poleg tega je bila spektrofotometrična kvantifikacija glede na nivoje, odkrite v celicah, zdravljenih samo s SAL (nastavljeno kot 100 odstotkov), v skladu z mikroskopskim opazovanjem. Kot je prikazano na sliki 3B, je bila normalizirana raven superoksida v zdravih kontrolnih celicah (CTR) manj kot 39 odstotkov, pozitivna kontrolna snov NAC pa je zagotovila zmerno do popolno zmanjšanje proizvodnje ROS, ki jo povzroči SAL, pri 100 in 1000 uM (na 76,3). ± 4,33 in 44,3 ± 5,12 odstotka), kar kaže na to, da ima pomanjkanje glutationa (GSH) ključno vlogo v modelu [26]. Zanimivo je, da je SAL povzročil dramatično zmanjšanje vsebnosti GSH v celicah SH-SY5Y, ki ga je spremljalo zvišanje OS, na ravni, podobne tistim, ki so bile prej opažene v študiji, ki je prav tako zabeležila učinke NAC na viabilnost celic, celično smrt in vsebnost glutationa [43] . Tu predstavljeni rezultati kažejo, da je NAC tudi zmanjšal tvorbo superoksidnih radikalov na bazalne ravni (tj. ravni v kontrolah, obdelanih z DMSO). Ribozide CK so testirali pri aktivnih koncentracijah (0,1–1 uM) skupaj s K3G in so znatno zmanjšali vsebnost superoksidnih radikalov v celicah na naslednje ravni (v primerjavi s tistimi v celicah, zdravljenih samo s SAL): cZR 80,34 ± 5,99 odstotka pri 0,1 uM ; K3G 77,1 ± 4,89 odstotka pri 10 uM; iPR 79,2 ± 5,91 odstotka pri 1 uM, primerljivo z učinki 100 uM NAC. Ortogonalne demonstracije skupaj močno kažejo, da ima močna aktivnost proti OS ključno vlogo pri zaščitnih učinkih NAC in CK v modelu PD, ki ga povzroči SAL. Povezavo med izboljšanjem OS in nevroprotekcijo so opazili tudi drugi avtorji [29], več študij pa je pokazalo, da lahko K ​​in BAP neposredno izboljšata aktivnosti OS [44] s tvorbo kompleksov z ioni Cu2 plus, kar ima za posledico superoksid dismutazo- podobna dejavnost [45,46]. Vendar so bili CK opisani tudi kot posredni antioksidanti z učinki, posredovanimi z indukcijo poti antioksidantnega odziva (iPR) z jedrskim faktorjem eritroidnega 2-povezanega faktorja 2 (NRF2) [22] ali delne obnove aktivnosti glutation peroksidaze in SOD ( K) [16]. Poleg tega naj bi Knevroprotektivnoaktivnosti proti poškodbam OS, ki jih povzroča H2O2 v celicah SH-SY5Y [17]. Obe vrsti poročanih aktivnosti CK proti ROS bi lahko potencialno pojasnili učinke cZR, K3G in iPR pri zmanjšanju superoksidnih radikalov v modelu PD celic SH-SY5Y, ki ga povzroči SAL [47–50].

Slika 3. (A) Mikrofotografije, ki prikazujejo oksidativni stres, ki ga povzroči SAL, in aktivnosti zmanjševanja oksidativnega stresacitokininipri človeku diferencirannevronSH-SY5Y podobne celice, vizualizirane s fluorescenčno mikroskopijo po označevanju z dihidroetidijem (DHE). Palice=50 um. Slike prikazujejo celice, obdelane z raztopino DMSO (kontrole), samim 500 uM salsolinolom (SAL) in kombinacijami 500 uM SAL in 1000 uM NAC (plus NAC), 0,1 uM cZR (plus cZR); 10 uM K3G (plus K3G), 1 uM iPR (plus iPR) 24 ur pred barvanjem z DHE. (B) SAL-inducirana tvorba superoksidnega radikala incitokininaali zaščitno aktivnost N-acetilcisteina (NAC). Graf prikazuje kvantifikacijo celic, obarvanih z DHE, z uporabo bralnika mikroplošč Infinite M200 Pro (Tecan, Avstrija). Potrojni v najmanj petih neodvisnih dneh. * P v primerjavi z vozilom s 500 uM SAL, # P v primerjavi z vozilom brez 500 uM SAL.