2. del: Karbamilirani sortilin, povezan s kardiovaskularno kalcifikacijo pri bolnikih s kronično ledvično boleznijo

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Kliknitetukajza 2. del.

Karbamilirani sortilin spremeni vezavo liganda

Sortilin je koreceptor za več ligandov.8 Karbamilacija lizina znatno spremeni lastnosti stranske verige lizina, pri čemer se pozitivno nabita amino skupina nadomesti z obsežno polarno skupino, kar lahko vpliva na vezavo liganda. Preučili smo interakcije najpogosteje modificiranih stranskih verig sortilina lizina, ki jih najdemo vkronično ledvicabolezen(zaporedje aminokislin [zaporedje kristalne strukture]), Lys95(62), Lys205(172), Lys260(227) in Lys294(261), z modeliranjem in silico za napoved možnih strukturno-funkcijskih posledic karbamilacije lizina. Uporabili smo obstoječo kristalno strukturo ektodomene sortilina iz oblike, vezane na nevrotenzin, pri nevtralnem pH (datoteka PDB Q24: 4PO7; slika 3a) in oblike brez liganda pri kislem pH (datoteka PDB: 6EHO; dodatna tabela S5).

Pri nevtralnem pH Lys95(62) tvori solni most z Glu609(576) in vodikovo vez s karbonilno skupino glavne verige Arg90(57). Pri kislem pH je interakcija z Glu609(576) tesnejša, saj razdalja med amino skupino Lys95(62) in karboksilno skupino Glu609(576) zdaj omogoča tvorbo vodikove vezi, medtem ko interakcija z Arg90(57) ) ni prisoten. Zato lahko karbamilacija pri Lys95 (62) destabilizira obe konformaciji sortilina. Tako bi karbamilacija pri Lys205 morda dajala prednost kisli pH konformaciji sortilina. Lys294(261) nima interakcij pri nevtralnem in kislem pH.

Učinki cistanche: zdravljenje bolezni ledvic

Končno pri nevtralnem pH Lys260(227) medsebojno deluje z nevrotenzinom-Tyr11 na mestu vezave liganda v tunelu b-propelerja sortilina. Ker kisla pH sortilinska struktura nima afinitete do liganda, v tej strukturi ne najdemo nobenih interakcij stranske verige Lys260(227). Na interakcijo z nevrotenzinom Tyr11 bo vplivala karbamilacija in lahko povzroči manjšo afiniteto za nevrotenzin. Interlevkin 6 (IL-6), znani sortilinski ligand,20 veže sortilin skozi njegov C-terminalni rep, ki vsebuje arginin na enakovrednem položaju nevrotenzina-Tyr11. Tako lahko karbamilacija Lys260(227) verjetno poveča afiniteto za IL-6, ki lahko prispeva k vaskularni kalcifikaciji.

Poznejše študije vezave z uporabo resonančne spektroskopije površinskega plazmona in SortCo ali SortCarb so pokazale učinkovitejšo vezavo IL-6 na SortCarb (KD=23 nM) v primerjavi s Q25 z nemodificiranim SortCo (KD=141 nM), kar kaže na karbamiliran sortilin kot potencialni IL -6 vezni partner (Sliki 3b in c). Progranulin, še en znan ligand sortilina, 22 vezan na SortCo, vendar vezave na SortCarb ni bilo mogoče zaznati (dodatni sliki S7A in B). Tako SortCo kot SortCarb sta vezana na s človeškim receptorjem povezan protein, spojen z oznako GST,23 vendar ne samo na GST, kar podpira Q26 strukturno celovitost sortilina ne glede na njegov status karbamilacije in prikazuje specifičnost naše eksperimentalne nastavitve (dodatna slika S7C– F).

Nato smo ocenili, ali lahko spremenjena afiniteta do IL-6 vpliva na signalne poti, ki sodelujejo pri vaskularni kalcifikaciji. Pri kalcificirajočih hSMC je dodatek IL-6 SortCarbu spodbudil ekspresijo mRNA ALPL in RUNX2 (slika 3d in e) kot tudi aktivnost TNAP (slika 3f), medtem ko v kombinaciji s SortCo ni imel učinka. Ti podatki kažejo, da karbamilacija sortilina poveča sposobnost vezave liganda na IL-6, kar povzroči povečano kalcifikacijo gladkih mišičnih celic.

Karbamilacija sortilina je povezana s kalcifikacijo žil vkroničnoledvicabolezenbolnikov Na podlagi naših podatkov, za katere je bilo ugotovljeno, da se karbamilirani ostanki sortilina povezujejo zkroničnoledvicabolezenin kalcifikacijo, smo nato preučevalikroničnoledvicabolezenudeleženci študije CARVIDA, pri katerih so z računalniško tomografijo kvantificirali CAC. Tako kot udeleženci študije CARE FOR HOMe je imela večina udeležencev CARVIDA 2 in 3 PTM, pri čemer so bili pogosto prizadeti ostanki lizina 95 in 260 (dodatna slika S8A). V primerjavi z bolniki brez karbamiliranih ostankov so bili bolniki z ostanki 1 sortilin karbamil-lizina starejši (P=0.002), imeli so nižjo eGFR (P=0,008), več pogosto (nekdanji) kadilci (P=0,023) in so imeli znatno večji volumen CAC (P <0,001; slika="" 4a="" in="" dodatna="" tabela="">

Ln-(CAC plus 1) na začetku je bil v korelaciji s prisotnostjo in povečanjem post-translacijsko karbamiliranega sortilina (dodatna tabela S7). Poleg tega je bil Ln-(CAC þ 1) povezan tudi z moškim spolom, sladkorno boleznijo, antidiabetiki in zdravili za zniževanje lipidov, višjo starostjo, serumskim IL-6 in hemoglobinom A1c ter nižjim eGFR in serumskim lipoproteinom visoke gostote ( Dodatna tabela S7). Kljub temu je povezava med karbamiliranimi ostanki sortilina in izhodiščnim Ln-(CAC þ 1) ostala pomembna po prilagoditvi za vse zgoraj omenjene spremenljivke (P=0.029; tabela 3).

Učinki cistanche: zdravljenje bolezni ledvic

Nato smo ocenili, ali prisotnost karbamiliranih ostankov vpliva na napredovanje CAC. Prisotnost karbamiliranega sortilina (v primerjavi z brez karbamilacije) je povečala napredovanje CAC (P=0.047). Podrobno,kroničnoledvicabolezenbolniki s karbamiliranim sortilinom (n=33) so pokazali znatno povečano napredovanje CAC v medianem času spremljanja 4,4 leta (slika 4b), z letnim povečanjem mediane prostornine CAC za 30.32 Q27 (interkvartil razpon ¼ 84,0) (slika 4C). V nasprotju,kroničnoledvicabolezenbolniki brez karbamilacije sortilina (n=8) so pokazali letno spremembo medianega volumna CAC 1,63 (interkvartilni razpon=8,54) in nobenega pomembnega napredovanja CAC v obdobju spremljanja (sliki 4b in c). Po prilagoditvi za sospremenljivke, povezane z napredovanjem CAC (izhodiščni volumen CAC, starost, spol, indeks telesne mase, eGFR, diabetes mellitus, serumski IL-6, serumski lipoprotein visoke gostote in zdravila za zniževanje lipidov), je bil status karbamilacije ni več povezan z napredovanjem CAC (P ¼ 0.286).

Bolniki z ostankom karbamil-lizina 260 so pokazali največje povečanje volumna CAC kot bolniki brez karbamiliziranega ostanka ali ostankov karbamil-lizina, razen 260 (dodatna slika S8B).

Na splošno podatki kažejo, da je posttranslacijski karbamilirani sortilin povezan z volumnom CAC in njegovim napredovanjem pri bolnikih zkroničnoledvicabolezen.

DISKUSIJA

V različnih eksperimentalnih študijah in vitro in in vivo ter 2 neodvisnih prospektivnih kohortah dokazujemo, da bolniki zkroničnoledvicabolezenkažejo specifičen vzorec posttranslacijskih karbamiliranih ostankov sortilina lizina v obtoku, ki jih je mogoče zaznati tudi v žilni steni. Poleg tega je bila karbamilacija sortilina povezana s CAC vkroničnoledvicabolezenbolniki, ne glede na starost,ledvicadelovanje in drugi dejavniki tveganja za kalcifikacijo. Mehansko bi lahko pokazali, da karbamilacija sortilina poveča njegovo sposobnost vezave IL-6 in deluje neposredno na vaskularne celice za spodbujanje vaskularne kalcifikacije (slika 4d). Skupaj je ta študija razkrila nov netradicionalni dejavnik tveganja za kalcifikacijo, ki potencialno prispeva k velikemu bremenusrčno-žilnibolezni vkroničnoledvicabolezen.

Karbamilacijo beljakovin lahko posreduje cianat, ki se razvije med spontano razgradnjo sečnine ali nastane z oksidacijo tiocianata, katalizirano z mieloperoksidazo, na mestih vnetja.24 Pokazali smo, dakronično ledvicabolezenbolnikih z višjo koncentracijo sečnine zaradi zmanjšaneledvicafunkcija je pokazala več karbamilacijskih ostankov sortilina kot zdrave kontrole. Vendar pa nismo našli povezave med skupnimi ravnmi in aktivnostjo mieloperoksidaze in karbamilacijo sortilina, kar kaže na uremijo kot primarno gonilo karbamilacije sortilina vkroničnoledvicabolezen. Poleg tega naši podatki kažejo, da so starost, NT-proBNP in manjši vnos antagonistov aldosterona povezani z več karbamiliranimi ostanki. Naši podatki so skladni s prejšnjimi poročili, v katerih je bilo opredeljeno, da je staranje pomemben posrednik karbamilacije beljakovin.25 Dokazano je bilo, da antihipertenzivni zdravili hidroklorotiazid in amlodipin vplivata na ravni homocitrulina, aminokisline, povezane s ciklusom sečnine, in produkta, pridobljenega iz karbamilacije.26 Ali jemanje antagonistov aldosterona zniža homocitrulin in tako zmanjša karbamilirane ostanke vkroničnoledvicabolezenbolnikov, ni znano. Drechsler et al. je pokazala korelacijo med serumskim karbamiliranim albuminom in NT proBNP, kar je bilo povezano s srčnim popuščanjem pri dializno odvisnihkroničnoledvicabolezen27 Ni znano, ali lahko karbamilacija sortilina služi tudi kot dejavnik tveganja za srčno popuščanje, vendar bi povečana koronarna kalcifikacija s potencialno kasnejšimi škodljivimi učinki na delovanje srca lahko pojasnila povezavo med karbamiliranimi ostanki sortilina in ravnmi NT proBNP v naši študiji.

Učinki dodatka cistanche: zdravljenje bolezni ledvic in izboljšanje imunosti

Nedavne študije so odkrile vlogo sortilina v patogenezi vaskularnih in presnovnih motenj, vendar so bile osredotočene predvsem na izražanje sortilina v tkivih in ne na raziskovanje delovanja topne oblike.7 Krožeči sortilin lahko izvira iz celičnega odvajanja njihove luminalne domene, kot je dokazano in vitro , 28–30, in iz izločenih zunajceličnih veziklov, zapakiranih s sortilinom.9,31 Karbamilacija vodi do sprememb naboja, strukturnih in funkcionalnih lastnosti proteinov, posreduje izgubo funkcije in potencialno patofiziološke celične in molekularne odzive.5 Za prvo smo ugotovili čas specifičnega karbamilacijskega vzorca ostankov lizina v krožečem sortilinukroničnoledvicabolezen, z uporabo ciljno usmerjenega pristopa MS in predvidenih funkcionalnih in strukturnih sprememb z modeliranjem in silico. Predlagamo, da karbamilacija lizina daje prednost kisli pH konformaciji sortilina, kar vpliva na pH-odvisno afiniteto sortilina do liganda. Prejšnje študije kristalne strukture so pokazale, da je pri pH 5,5, ki predstavlja okolje, podobno okolju poznih endosomov, sortilin podvržen konformacijskim spremembam in nastanku dimerja, zaradi česar znana vezavna mesta niso na voljo za vezavo liganda.32,33

Lizin 260 tvori vodikovo vez s tirozinom nevrotenzina znotraj tunela b-propelerja, kar namiguje, da bi bili prizadeti tudi drugi ligandi, ki se vežejo podobno kot nevrotenzin. Naša preiskava je odkrila povečano afiniteto IL-6 do karbamiliranega sortilina, kar kaže na sodelovanje v signalnih poteh IL-6. Več študij je nakazovalo, da lahko IL-6 prispeva k vaskularni kalcifikaciji vkroničnoledvicabolezen.22,34,35 funkcionalna vloga pri kalcifikacijski vaskularni patologiji. Topen karbamilirani sortilin je spodbujal vaskularno kalcifikacijo in vitro in ex vivo s povečanjem osteogenih ciljnih genov, aktivnosti TNAP in mineralizacije matriksa. Poleg tega je dodatek IL-6 karbamiliranemu sortilinu dodatno povečal osteogene ciljne gene in aktivnost TNAP.

Karbamilacija je bila povezana s spremembo zunajceličnega matriksa,36 oksidativnim stresom,25 endotelnimi disfunkcijami37 in aterosklerozo38, ki so vsi vključeni v začetek in napredovanje kalcifikacije. Čeprav Mori et al. poročali, da karbamilacija beljakovin spodbuja vaskularno kalcifikacijo s karbamilacijo mitohondrijskih proteinov,6 niso identificirali specifičnih ciljnih proteinov. Nedavna študija je pokazala, da je karbamilacija uromodulina povzročila izgubo njegovih antikalcičnih lastnosti in vitro. 39 Obe študiji sta uporabili Western blot za odkrivanje karbamilacije na splošno. Dokazali smo, da in vitro karbamilirani sortilin posnema specifičen in vivo vzorec modifikacije lizina, ki ga najdemo vkroničnoledvicabolezenbolniki, ki uporabljajo MS. Tako naša študija ponuja namige za povezovanje specifičnih mehanizmovkroničnoledvicabolezen, karbamilacija beljakovin, IL-6 in kalcifikacija.

Prej so bile visoke ravni sortilina v serumu povezane s kalcifikacijo trebušne aorte insrčno-žilnievents independent of traditional Framingham risk factors in a community-dwelling cohort of men aged >50 let.10 Pri bolnikih z nizko do srednje velikim tveganjem za bolečino v prsih ravni sortilina niso bile povezane z resnostjo bolezni koronarnih arterij.40 V tej študiji smo lahko pokazali, da bolniki zkroničnoledvicabolezenimajo višje ravni sortilina kot kontrole z normalnoledvicafunkcijo. Raven sortilina se z znižanjem ni povečalaledvicafunkcijo, ko je bolnik imel akroničnoledvicabolezenz eGFR<60 ml/min="" per="" 1.73="" m2.="" however,="" we="" observed="" an="" increase="" of="" carbamylated="" sortilin="" residues="" with="" decreased="">ledvicafunkcijo. Podobno Kalim et al. poročali o nobeni povezavi med ravnijo celotnega in karbamiliranega albumina prikroničnoledvicabolezenbolnikov.41 Sortilin karbamilacija, ki je posledica okvarjenegaledvicafunkcijo, bi lahko dodatno povečala vaskularno kalcifikacijo, povezano zkroničnoledvicabolezen-povezane mineralne motnje. Naša študija ima več prednosti in omejitev. Prednosti vključujejo analizo podatkov, pridobljenih in vitro, ex vivo in pri bolnikih z uporabo različnih eksperimentalnih pristopov. Natančna karakterizacija bolnikov zkroničnoledvicabolezen, vključno s standardiziranimi vprašalniki za oceno značilnosti udeležencev, osebnimi študijskimi obiski, ki jih izvajajo usposobljene medicinske sestre v študiji, in meritvami številnih laboratorijskih vrednosti in kalcifikacije, je posebna prednost študije. Morda se zdi, da majhna kohorta omejuje našo študijo; vendar smo uporabili neodvisnokroničnoledvicabolezenkohorte z nadaljnjimi podatki za kalcifikacijo za potrditev statusa karbamilacije sortilina z naporno ciljno usmerjeno MS. Klinični izvidi so bili narejeni v nemščinikroničnoledvicabolezenbolnikov in lahko tako omeji posplošljivost ugotovitev na druge države ali etnične skupine. Nazadnje, čeprav je zasnova študije omogočala prilagoditev za številne pomembne zmede, preostale zmede, kot v kateri koli opazovalni študiji, ni mogoče v celoti izključiti.

Učinki cistanche: preprečevanje odpovedi ledvic

Zaključek

Skratka, to je prva študija, ki prikazuje specifične aminokisline, ki so posttranslacijsko spremenjene v krožečem sortilinu. Naši podatki kažejo, da prisotnostkroničnoledvicabolezenpospešuje karbamilacijo krožečega sortilina in da karbamilirani sortilin kaže prokalcične lastnosti, kot je dokazano in vitro, ex vivo in s prisotnostjo v kalcificiranem tkivu. Karbamilacija sortilina je bila povezana s CAC, tudi po prilagoditvi glede na starost,ledvicain več drugih dejavnikov tveganja, kar kaže, da bi preprečevanje karbamilacije sortilina lahko zmanjšalo tveganje zasrčno-žilnikalcifikacijo in s temsrčno-žilnizapleti pri bolnikih zkroničnoledvicabolezen. Tako naši rezultati kažejo, da karbamilirani sortilin prispeva ksrčno-žilnibreme bolezni vkroničnoledvicabolezenbolniki.

cistanche

REFERENCE

Ta vir je avtorica Vera Jankowski, IMCAR, Medicinska fakulteta, Univerza RWTH Aachen, Aachen, Nemčija itd.