2. del Kemijska in genetska diskriminacija Cistanches Herba na podlagi UPLC-QTOF/MS in črtne kode DNA

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

OPLS-DA in identifikacija markerjev Za identifikacijo potencialnih kemičnih markerjev za razlikovanje obeh vrst je bila ustvarjena S-plotvica OPLS-DA (slika 3). Na S-ploskvi vsaka točka predstavlja en ionski par tR–m/z. Osi X in Y predstavljata prispevek oziroma zaupanje iona; Čim dlje je razdalja, ki jo par ionov tR–m/z kaže od nič, tem večji je prispevek/zaupanje te ikone k razliki med obema skupinama. Tako ion tR–m/z, ki kaže na oba konca 'S', predstavlja značilne markerje z največjim zaupanjem v vsaki skupini. Rezultati OPLS-DA so pokazali, da bi lahko za razlikovanje uporabili UPLC-QTOF/MSCistanche deserticolaodCistanche tubulosa(slika 3). Določenih je bilo skupno šest verodostojnih in pomembnih markerjev, ki omogočajo diskriminacijo teh skupin (tabela 3). Identitete treh potencialnih markerjev so bile okvirno dodeljene. Komponente, povezane s temi tremi ioni, so bile okvirno identificirane kot izomeri kampneozida II, cistanozida C in cistanozida A. Markerne spojine a, b in c bi lahko uporabili za razlikovanje obeh rastlinskih vrst, saj sta ionski intenziteti a in b vCistanche deserticolabila višja kot vCistanche tubulosa(sl. 4A, 4B) in marker c je bilo mogoče zaznati vCistanche tubulosa, vendar ne vCistanche deserticola(slika 4C).

Črtno kodiranje DNK: informacija o zaporedju in učinkovitost identifikacije

Informacije o zaporedju so bile prikazane v tabeli 4. Povprečna genetska razdalja psbA-trnH (0.1732) je bila večja od drugih dveh regij (0.0740 , 0,1197) znatno. Povprečna vsebnost GC psbA-trnH (20,64 odstotka) je bila manjša kot v drugih dveh regijah (55.00 odstotkov, 55.00 odstotkov). Čeprav stopnja uspešnosti ITS in ITS2 ni bila dosežena v tej študiji, se je regija psbA-trnH dobro obnesla pri PCR pomnoževanju in sekvenciranju (100 odstotkov, 87,23 odstotka). Učinkovitost identifikacije je bila dosežena z analizo BLAST1 in metodo najbližje razdalje ter je v glavnem odražala stopnjo uspešnosti črtnih kod. Območje psbA-trnH je bilo očitno višje od drugih dveh črtnih kod glede učinkovitosti identifikacije na podlagi dveh metod. Pomanjkanje sekvenc je najverjetneje razlog, da je regija ITS pokazala 100-odstotno identifikacijsko učinkovitost na podlagi metode BLAST1 in 0 na podlagi metode najbližje razdalje.

Analiza genetske divergence z uporabo šestih parametrov

Za analizo znotrajspecifične variacije in medvrstne divergence je bilo uporabljenih šest parametrov z uporabo treh črtnih kod (tabela 5). Pomembna razlika med inter- in intra-specifičnimi variacijami je kazala na uporabnost črtnih kod DNK. Tu je bila najmanjša medvrstna razdalja treh črtnih kod večja od največje znotrajvrstne razdalje. Poleg tega je imela regija psbA-trnH večjo največjo intraspecifično razdaljo in povprečno interspecifično razdaljo kot drugi dve črtni kodi, kar kaže, da se je regija psbA-trnH dobro izkazala pri razlikovanju dveh izvorov Cistanches Herba.

Analiza vrzeli črtne kode za prepoznavanje

Cistanche deserticolainCistanche tubulozaVrzel v črtni kodi predstavlja izjemno variacijo med vrstami in znotraj vrst ter kaže ločene porazdelitve med vrstami in vzorci med vrstami, ki se ne prekrivajo. V tej študiji (slika 5) je bil razpon razdalje nastavljen na 0–0.45, ker je največja razdalja K2P psbA-trnH medCistanche deserticolainCistanche tubulozaje bil blizu 0,45. Tri črtne kode so pokazale izrazite vrzeli v porazdelitvi variacij znotraj in med vrstami. Poleg tega je bila vrzel psbA-trnH bistveno večja od drugih dveh črtnih kod. Zato bi lahko bila regija psbA-trnH idealna črtna koda za razlikovanje dveh izvorovCistanchesHerba.

Drevo, ki povezuje sosede (NJ).

Drevo NJ ponazarja odnos med vrstami in olajša določanje njihovega združevanja. V tej študiji je bilo drevo NJ treh črtnih kod zgrajeno na podlagi modela K2P (slika 6). Rezultati so pokazali, da sta dva izvora Cistanches Herba združena v dva klada ločeno. Tako je drevo NJ jasno razlikovalo medCistanche deserticolainCistanche tubuloza.

Razprava in sklepi

Cistanches Herba je pomemben medicinski material, ki se običajno uporablja za prehrano azijske skupnosti [38]. Vendar sta oba izvoraCistanchesHerba, Cistanche deserticolainCistanche tubulozaimajo različne kemijske sestave in farmakološke aktivnosti. Hkrati se oba izvora razlikujeta v klinični uporabi in na trgu blaga. Klasifikacija Cistanche je zmedena in množični nadomestki in nečistoče preplavijo trg zaradi pomanjkanja virov in posebnega rastnega okolja za Cistanches Herba. Rod Cistanche vključuje štiri vrste in eno različico:Cistanche deserticola, Cistanche tubuloza, Cistanche sinensis, Cistanche salsa, inCistanchesalsavar. albiflora [39]. Raziskovalci na Japonskem so razmišljali o izvoruCistanchesHerba asCistanche salsa[40–43], medtem ko je bil identificiran kotCistanche deserticolaavtor Tu [44–46]. Zato je v razvrstitvi Cistanche zmeden in je težko razlikovati med dvema izvoroma Cistanches Herba. Tradicionalne metode za nadzor kakovosti Cistanches Herba so morfološka identifikacija [47,48], mikroskopska identifikacija [49] in TLC (tankoplastna kromatografija) [50,51], FTIR (Fourierjeva transformacijska infrardeča spektroskopija) [14], HPLC (visoka Performance Liquid Chromatography) [52,53]. Z morfološko in mikroskopsko metodo zlahka ločimo vrste iz različnih rodov ali družin, ki imajo velike razlike v morfoloških in mikroskopskih značilnostih, medtem ko je vrste sorodnikov težko ločiti. TLC in FTIR lahko jasno razlikujeta vrste, ki imajo različne vrste kemične sestave, medtem ko je težko določiti kemično komponento in vsebnost. HPLC se uporablja predvsem za razlikovanje vrst z različnimi vsebnostmi kemičnih elementov, kljub temu pa je čas analize daljši in občutljivost relativno nižja v primerjavi z UPLC. Temu primerno je bila tehnologija UPLC-QTOF/MS hitrejša in natančnejša pri določanju kemijske sestave kot druge kemijske metode. Metode molekularne identifikacije se dobro kažejo pri diskriminaciji na podlagi genetske variacije, kot je SDS-PAGE (elektroforeza z natrijevim dodecil sulfatom in poliakrilamidnim gelom) [54], AFLP (polimorfizem dolžine ojačanega fragmenta) [55,56]. Vendar teh molekularnih metod ni enostavno uporabljati in niso univerzalne. Skladno s tem bi črtno kodiranje DNK lahko bolj univerzalno, hitro in natančno razlikovalo vrste kot druge molekularne metode. Pri vrstah iz istega rodu in tesnem genetskem sorodstvu te metode same morda ne bodo uspešne pri identifikaciji.

Tukaj smo pri identifikaciji združili UPLC-QTOF/MS in črtno kodiranje DNKCistanche deserticolainCistanche tubulozain ocenili kemične in molekularne označevalce, ki bi jim omogočili diskriminacijo. Odkritih je bilo 23 kvalificiranih masnih vrhov in 16 je bilo identificiranih z uporabo UPLC–QTOF/MS, tri potencialne markerske spojine pa so najprej ugotovile, da olajšajo razlikovanje dveh izvorov z analizo PCA in OPLS-DA. Poleg tega so bili štirje kazalniki ocenjeni s tehnologijo črtnega kodiranja DNK v smislu njihove sposobnosti razlikovanja dveh izvorov: učinkovitost identifikacije, genetska učinkovitost, vrzel v črtni kodi in analiza NJ drevesa. Področje psbA-trnH je bilo podprto kot primerna črtna koda DNA za razlikovanjeCistanche deserticolainCistanche tubuloza. Za zaključek smo najprej vzpostavili novo molekularno in kemijsko analitično kombinirano metodo za razlikovanje in nadzor kakovosti v dveh izvorih Cistanches Herba. Črtna koda DNK lahko razlikuje dva izvora v genetskih variacijah in univerzalno in natančno potrdi pristnost vrst; Tehnologija UPLC-QTOF/MS lahko analizira kemično sestavo za hitro in natančno oceno kakovosti medicinskih materialov. Kombinirana metoda črtnega kodiranja DNK in tehnologije UPLC-QTOF/MS zagotavljata natančnejšo in znanstveno identifikacijo zdravilnih materialov v več virih in lahko služita kot metoda za identifikacijo drugih zmedenih vrst ali rodov pri klasifikaciji.

Avtorski prispevki

Zasnoval in oblikoval poskuse: LFH SHZ LBW. Izvedel poskuse: SHZ LBW. Analizirali podatke: SHZ LBW. Prispevani reagenti/materiali/orodja za analizo: LFH. Napisal prispevek: SHZ XJ LBW. Preverite rokopis: ZHW.

Cistanche deserticola ima številne učinke, kliknite tukaj za več informacij

Reference

1. Tu PF, Lou ZC, Li SC, Wang CS, Jiang WY et al. (1996) Primerjava učinkovitosti hranjenja ledvic in krepitve janga treh različnih vrstherbacistanches. Časopis kitajskih zdravilnih materialov 19: 420–421.

2. Zhang Y, Wu H, Wang SN, Zheng HC (1994) Primerjava funkcij hranjenja ledvic in krepitve janga treh različnih vrstherbacistanches. China Journal of Chinese Materia Medica 19: 169–171.

3. Lei L, Song ZH, Tu PF (2003) Napredek pri raziskavah kemičnih sestavin v rastlinahCistancheHuffing. et povezava. Kitajska tradicionalna in zeliščna zdravila 34: 473–476.

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S, et al. (2006) Feniletanoidni aminoglikozidi in acilirani oligosugarji z vazorelaksantnim delovanjem izCistanchetubuloza. Bioorg Med Chem 14: 7468–7475.

5. Shimoda H, Tanaka J, Takahara Y, Takemoto K, Shan SJ, et al. (2009) Hipoholesterolemični učinkiCistanchetubulozaizvleček, kitajsko tradicionalno surovo zdravilo, pri miših. Am J Chin Med 37: 1125–1138.

6. Yamada P, Iijima R, Han J, Shigemori H, Yokota S, et al. (2010) Zaviralni učinek akteozida, izoliranega izCistanchetubulozao sproščanju kemičnih mediatorjev in produkciji vnetnih citokinov s celicami RBL-2H3 in KU812. Planta Med, 1512–1518.

7. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Matsuda H, et al. (2010) Acilirani feniletanoidni aminoglikozidi s hepatoprotektivnim delovanjem iz puščavske rastlineCistanchetubuloza. Bioorg Med Chem 18: 1882–1890.

8. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, et al. (2010) Iridoidni in aciklični monoterpenski glikozidi, kankanozidi L, M, N, O in P izCistanchetubuloza. Chem Pharm Bull (Tokio) 58: 1403–1407.

9. He YP, Yin ZZ, Tu PF, Lou ZC (1997) Identifikacija in pregled komercialne surove droge herba cistanche. Časopis kitajskih zdravilnih materialov 20: 117–122.

10. Zhu SY (2001) Farmakognostična identifikacijaCistanchetubulozazmedena vrstaCistanchedeserticola. Časopis kitajskih zdravilnih materialov 24: 24–25.

11. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG, et al. (2013) Mikroskopska identifikacija trehherbacistanchesv Xin Jiangu. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881–883.

12. Zhang M, Fu XL, Wang SY (2004) Mikroskopska identifikacija komercialnihHerbaCistanchess tehniko digitalnega slikanja. Časopis kitajskih zdravilnih materialov 27: 400–402.

13. Li JS, Yao ZQ, Yu MX (2000) Študija o identifikacijiherbacistanchesin prešuštniki. Shizhen Medicine and Materia Research 11: 317–318.

14. Xu R, Sun SQ, Liu YG, Chen J, Liu TN, et al. (2010) FTIR in 2D-IR spektroskopske študije na različnih virihherbacistanches. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 30: 897–900.

15. Chen J, Sun SQ, Xu R, Liu YG, Yu J, et al. (2009) IdentifikacijaCistanchedeserticolaiz solarija Boschniakla rossica in Cynomorium z uporabo FTIR in dvodimenzionalne korelacijske IR spektroskopije. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 29: 1502–1507.

16. Yang HC, Xia PX, Huang JX, Yuan HZ (2008) Študija prstnega odtisa HPLCCistanchedeserticola. Pharm Care & Res 8: 255–257.

17. Xie JN, Zhao MB, Wu FW, Tu PF (2005) Kromatografski prstni odtisCistanchedeserticolas HPLC. Kitajska tradicionalna in zeliščna zdravila 36: 268–271.

18. Han JP, Song JY, Liu C, Chen J, Qian J, et al. (2010) IdentifikacijaCistanchevrste (Orobanchaceae) na podlagi zaporedij intergenske regije plastida psbA-trnH. Acta Pharmaceutica Sinica 45: 126–130.

19. Shi HM, Wang J, Wang MY, Tu PF, Li XB (2009) IdentifikacijaCistancheVrste po kemijskem in ponavljajočem se prstnem odtisu med enostavnimi zaporedji. Biol. Pharm. Bull., 32: 142–146.

20. Han LF, Yiadom MB, Liu EW, Zhang Y, Li W, et al. (2012) Strukturna karakterizacija in identifikacija feniletanoidnih glikozidov izCistanchesdeserticolaYC Maz UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS. Fitokemična analiza 23: 668–676.

21. Jiang X, Huang LF, Wu LB, Wang ZH, Chen SL (2012) UPLC-QTOF/MS analiza alkaloidov v tradicionalno predelanem Coptis chinensis Franch. Dokazno dopolnilo Alternat Med 2012: 942384.

22. Wu LB, Jiang X, Huang LF, Chen SL (2013) Preiskava tehnologije obdelave listov mušmula (Eriobotrya japonica) s tekočinsko kromatografijo z izjemno zmogljivostjo – kvadrupolna časovno-preletna masna spektrometrija v kombinaciji s kemometrijo. PLoS ONE 8: e64178.

23. Hebert PD, Ratnasingham S, Waard JR (2003) Črtno kodiranje živalskega sveta: razlike podenote 1 citokrom c-oksidaze med tesno sorodnimi vrstami. Proc. R. Soc. Lond. B., 270 Suppl 1: S96–99.

24. Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, Waard JR (2003) Biološke identifikacije prek črtnih kod DNA. Proc Biol Sci., 270:313:321.

25. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005) Uporaba črtnih kod DNK za identifikacijo cvetočih rastlin. Proc Natl Acad Sci., 102: 8369–8374.

26. Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J, et al. (2010) Validacija regije ITS2 kot nove črtne kode DNK za identifikacijo vrst zdravilnih rastlin. PLoS One 5: e8613.

27. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, et al. (2011) MEGA5: Analiza molekularne evolucijske genetike z uporabo metod največje verjetnosti, evolucijske razdalje in metod največje varčnosti. Mol Biol Evol 28: 2731–2739.

28. Meyer CP, Paulay G (2005) Črtno kodiranje DNK: stopnje napak na podlagi celovitega vzorčenja. PLoS Biol 3: e422.

29. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Študije o sestavinahCistancheHerba.IV. Izolacija in strukture dveh novih fenilpropanoidnih glikozidov, cistanozidov C in D. Chem Pharm Bull 32: 3880–3885.

30. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Študije o sestavinahCistancheHerba. VI. Izolacija in strukture novega iridoidnega glikozida, 6-Deoxyeatalpol. Chem Pharm Bull 33: 3645–3650.

31. Jiang Y, Li SP, Wang YT, Chen XJ, Tu PF (2009) DiferenciacijaHerbaCistanchess prstnim odtisom s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti–detekcija nizov diod–masna spektrometrija. Journal of Chromatography A 1216: 2156–2162.

32. Han LF, Boakye YM, Liu E, Zhang Y, Li W, et al. (2012) Strukturna karakterizacija in identifikacija feniletanoidnih glikozidov izCistanches deserticola YC Maz UHPLC/ESI–QTOF–MS/MS. Phytochem Anal 23: 668–676.

33. Li L, Tsao R, Yang R, Liu CM, Young JC, et al. (2008) Izolacija in čiščenje feniletanoidnih glikozidov izCistanchedeserticolas hitro protitočno kromatografijo. Kemija hrane 108: 702–710.

34. Lu DY, Zhang JY, Yang ZY, Liu HM, Li S, et al. (2013) Kvantitativna analizaCistanchesHerbaz uporabo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti v kombinaciji z detekcijo nizov diod in masne spektrometrije visoke ločljivosti v kombinaciji s kemometričnimi metodami. J Sep Sci 26: 1945–1952.

35. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Študije o sestavinahCistancheHerba. V. Izolacija in strukture dveh novih fenilpropanoidnih glikozidov, cistanozida E in F. Chem Pharm Bull 33: 1452–1457.

36. Jiang Y, Tu PF (2009) Analiza kemičnih sestavin vCistanchevrste. J Chromatogr A 1216:1970–1979.

37. Masssart DL, Vandeginste BGM, Deming SN, Michotte Y, Kaufman L (1988) Ravnanje s podatki v znanosti in tehnologiji. Kemometrija: učbenik.

38. Huang LF, Zheng SH, Wu LB, Jiang X, Chen SL (2014) EkotipiCistanche deserticolatemelji na kemijski komponenti in molekularnih lastnostih. SCIENTIA SINICA Vitae 44: 318–328.

39. Tu PF, Jiang Y, Guo YH (2011) raziskave in industrijski razvoj zeliščcistanches. Journal of Chinese pharmaceutical 46: 882–887.

40. Kobayashi H, Oguchi H, Takizawa, Miyase T, Ueno A, et al. (1987) Novi feniletanoidni glikozidi izCistanchetubuloza(SCHRENK) Hook. f. I. Chem Pharm Bull 35: 3309–3314.