2. DEL: Polisaharid Cistanche Deserticola zavira z OVX povzročeno izgubo kosti pri miših in z RANKL povzročeno osteoklastogenezo

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Osteoporoza je resna bolezen kosti, ki prizadene starajoče se prebivalstvo. Cistanche deserticola (CD), krepčilno in zdravilno živilo, ki se pogosto uporablja na Kitajskem, dokazano zagotavlja učinkovito zdravljenje osteoporoze.Polisaharid Cistanche deserticola(CDP), ekstrahiran iz CD, ima različne farmakološke lastnosti, vendar njegova vloga pri tvorbi in delovanju osteoklastov ter osteoporozi ostaja neznana. Namen te študije je bil ekstrahirati in očistiti CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)za nadaljnje raziskovanje njegovega možnega mehanizma delovanja na osteoporozo. Rezultati so pokazali, da je CDP (Polisaharid Cistanche deserticola) je zdravljenje preprečilo osteoporozo, ki jo povzroča OVX, in izboljšalo izgubo kosti z zatiranjem aktivnosti in delovanja osteoklastov. Poleg tega CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)zdravljenje znatno zavrlo osteoklastogenezo, ki jo povzroča RANKL. resorpcijo kosti in izražanje genov, specifičnih za osteoklaste. Mehansko, CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)zaviral aktivacijo signalnih poti NF-xB in MAPK, ki jih povzroča RANKL, in posledično vplival na aktivacijo NEATc1 navzdol. Ugotovitve te študije kažejo, da CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)je potencialno varno zdravilo za zdravljenje osteoporoze.

Zdravljenje osteoporoze: polisaharid Cistanche Deserticola

KLIKNITE TUKAJ ZA BARK PRAT 1

3. Rezultati

3.1. CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)preprečuje z OVX povzročeno izgubo kosti in vivo

Uporabili smo mišji model osteoporoze, ki ga povzroča OVX, da bi raziskali učinke CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)zdravljenje osteoporoze in vivo. V primerjavi s skupino Sham se je telesna teža miši OVX znatno povečala, medtem ko se je maternični indeks zmanjšal, kar kaže, da je bil model osteoporoze uspešno izdelan (sliki 1B in D). mikro-CT analiza golenic v skupini OVX je pokazala obsežno izgubo kosti. V primerjavi s skupino OVX se je število kostnih trabekul povečalo v skupini CDP-L, medtem ko je bilo povečanje v skupinah CDP-H in E2 pomembnejše, trabekule v zadnjih dveh skupinah pa so postale grobejše in vrzel se je zmanjšala. Kvantitativna analiza je potrdila, da je več histomorfometričnih parametrov kosti, vključno z BMD, BV/TV, BS/TV in Tb. N je imel bistveno povečane vrednosti, medtem ko je Tb. Sp je pokazal znižane vrednosti v skupini CDP-H (sl. 1E in F). Histopatološka preiskava z barvanjem H&E je pokazala, da je bilo število kostnih trabekul v skupinah CDP-H in E2 bistveno večje kot v skupini OVX, medtem ko v skupini CDP-L ni bilo pomembnega izboljšanja (slika 1G). Poleg tega je barvanje s TRAcP pokazalo, da se je število osteoklastov izrazito povečalo v skupini OVX, vendar zmanjšalo v skupinah CDP-H in E2 (slika 1H). Skupine CDP-L, CDP-H in E2 so pokazale, da so zavirale povečanje vsebnosti P, ki ga povzroča OVX, vendar so povečale vsebnost Ca v krvnem serumu. Označevalca absorpcije kosti, RANKL in TRAcP-5b, sta pokazala trend padanja v CDP-L.

3.2. CDP(Polisaharid Cistanche deserticola) in vitro zavira osteoklastogenezo, ki jo povzroča RANKL

Spremljali smo celično proliferacijoCDP-obdelani BMM z uporabo dolgotrajnega analizatorja dinamičnega slikanja živih celic v realnem času. V primerjavi s kontrolno skupino je sotočje celic vCDPzdravljenih skupinah se odmerek ni spremenil<10 µg/ml,="" but="" was="" significantly="" reduced="" at="" the="" 20="" and="" 40="" µg/ml="" dosages="" (fig.="" 2a).="" to="" investigate="" the="" effect="" of="">CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)pri osteoklastogenezi, ki jo povzroča RANKL, so bili BMM stimulirani z RANKL in M-CSF v prisotnostiCDPfor 7 days. TRAcP, a characteristic enzyme of osteoclasts, is considered an indicator of osteoclast function (Minkin, 1982). TRAcP staining showed that the osteoclasts treated with>1,25 µg/mlCDP(Polisaharid Cistanche deserticola)pokazala znatno zmanjšano velikost in število. Ti rezultati so pokazali, da CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)učinkovito zaviral pričakovano osteoklastogenezo, ki jo povzroča RANKL, ne da bi vplival na viabilnost celic.

3.3. CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)zavira osteoklastno resorpcijsko aktivnost, ki jo povzroča RANKL, in za osteoklaste specifično izražanje genov

Nadalje smo ugotavljali učinke CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)zdravljenje aktivnosti kostne resorpcije osteoklastov z uporabo plošč, prevlečenih s hidroksiapatitom. Resorpcija kosti je glavna funkcija in standard za merjenje aktivnosti in sposobnosti osteoklastov (Novack & Faccio, 2011). Rezultati so pokazali, da CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)lahko bistveno zmanjša kostno resorptivno območje osteoklastov na način, ki je odvisen od odmerka, kar kaže, da CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)zaviral aktivnost kostne resorpcije, ki jo povzroča RANKL (sliki 3A in B). Zlasti osteoklastično kostno resorptivno območje se je zmanjšalo na približno 6,3 odstotka po zdravljenju z 10 µg/mL CDP(Polisaharid Cistanche deserticola). Da bi bolje ugotovili oviro CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)o osteoklastogenezi smo izmerili nivoje transkripcije genov, povezanih z osteoklasti. Brez zdravljenja s CDP(Polisaharid Cistanche deserticola), je indukcija z RANKL spodbujala izražanje genov NFATc1, CTSK, Acp5, Atp6v0d2 in Mmp9. Nasprotno, sočasna uporaba CDP in RANKL je teh pet genov znatno znižala.

3.4. CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)zavira aktivacijo NFATc1, ki jo povzroči RANKL

Barvanje s TRacP je pokazalo, da CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)zdravljenje je znatno zmanjšalo pričakovano povečanje števila zrelih osteoklastov po stimulaciji RANKL 3–7 dni (sliki 4A in B). Poleg tega smo raziskali, ali lahko zdravljenje s CDP učinkovito zmanjša diferenciacijo osteoklastov z zaviranjem izražanja NFATc1. Rezultati so pokazali, da je bil NFATc1 močno izražen po 5-dnevni stimulaciji z RANKL, ki je bil po CDP znatno zavrt(Polisaharid Cistanche deserticola)zdravljenje (sliki 4C in D). Poleg tega je zdravljenje s CDP zavrlo ravni ekspresije CTSK, proteina, potrebnega za normalno tvorbo in delovanje osteoklastov (Bossard et al., 1996) (sliki 4E in F). Izbrali smo časovno predstavitev stimulacije RANKL za 5 dni, da bi dodatno raziskali učinek 10 µg/mL CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)zdravljenje translokacije NFATc1. Kot pričakovano, CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)zdravljenje znatno zaviralo jedrsko translokacijo NFATc1, ki jo povzroča RANKL.

3.5. CDP(Polisaharid Cistanche deserticola) zavira RANKL-inducirano aktivacijo signalnih poti NF-κB in MAPK

Da bi razjasnili mehanizme, vključene v inhibicijo diferenciacije osteoklastov, ki jo povzroči CDP, smo preučili vpliv CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)zdravljenje na poteh NF-κB in MAPK. Rezultati so pokazali, da CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)zdravljenje je imelo supresivne učinke na razgradnjo IκB- in fosforilacijo p65 na način, odvisen od odmerka. Fosforilacija treh članov družine MAPK, zlasti zunajcelične signalno regulirane kinaze (ERK), c-Jun N-terminalne kinaze (JNK) in p38, je bila povečana.

Cistanche Deserticola

4. Razprava

Osteoporoza je pogosta in degenerativna bolezen kosti. Trenutno obstaja veliko zdravil s kemično sintezo, ki se uporabljajo v kliničnem zdravljenju osteoporoze, kot sta estrogen in bisfosfonat. Vendar pa bo dolgotrajna uporaba teh zdravil postopoma oslabila klinično učinkovitost in celo povzročila številne resne neželene učinke, vključno s povečanim tveganjem za raka jajčnikov, dojk in endometrija ter osteonekrozo čeljusti (Beral, 2003; Khan et al., 2009; Lacey et al., 2002). V tej študiji smo izbrali CDP(Polisaharid Cistanche deserticola), učinkovita komponenta, ekstrahirana iz CD, kot terapevtsko sredstvo in dokazala, da CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)imela zaščitni učinek proti

izgubo kosti pri miših OVX in zaviral tvorbo in delovanje osteoklastov, ki jih povzroča RANKL. Medtem pa se po teoriji tradicionalne kitajske medicine o "ledvicah, ki upravljajo s kostmi" izguba kostne mase pripisuje pomanjkljivostim ledvic. Kot medicinska hrana, ki krepi ledvice, CD dokazano zagotavlja učinkovito zdravljenje osteoporoze (Fan et al., 2019; Jiang, Wang, Li in Zhang, 2016). Torej, CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)pridobljen iz te naravne rastline, je boljša in varnejša možnost zdravila.

Trenutno je mišji model OVX klasičen model izgube kosti po menopavzi pri ženskah, ki raziskuje vzroke izgube kosti in izvaja intervencijo (Wehrle et al., 2015). V skladu s tem smo izvedli dvostransko ooforektomijo na mišjih samicah C57BL/6J, da smo zgradili model osteoporoze. V prejšnjih študijah so bili odmerki CDP, dani živalim, 50–200 mg/kg (nizek odmerek) in 1800 mg/kg (visok odmerek) (Guo et al., 2016; Zhang et al., 2018). Tukaj je visok odmerek CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)pri miših je bil 600 mg/kg, kar je temeljilo na visokem kliničnem odmerku 30 g CD v decokciji; tako je podoben trenutni klinični praksi. V tej študiji je zdravljenje s CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)znatno zaviral z OVX povzročeno povečanje telesne mase, kar je pogost pojav, opažen pri miših OVX (Davis et al., 2019). Z uporabo mikro-CT skeniranja in 3D rekonstrukcije smo ugotovili, da je OVX povzročil opazno zmanjšanje BMD, BV/TV, BS/TV in Tb. N in povečanje Tb. Sp, medtem ko je zdravljenje s CDP razveljavilo vse te spremembe. Zlasti v primerjavi s pozitivnim zdravilom bi lahko CDP bistveno izboljšal BMD miši OVX, ki je pomemben pokazatelj kakovosti kosti in se uporablja za odražanje stopnje osteoporoze (Fuggle et al., 2019), kar kaže, da ima CDP prednost nad pozitivnim zdravilom pri izboljšanju BMD. Poleg tega so histološki rezultati pokazali, da bi zdravljenje s CDP lahko zmanjšalo povečano količino TRAcP-pozitivnih osteoklastov, ki jih povzroča OVX. Ti rezultati kažejo, da je dajanje CDP učinkovito ublažilo izgubo kosti pri osteoporozi, ki jo povzroča OVX, verjetno z zaviranjem tvorbe osteoklastov. V skladu z zgornjimi rezultati smo ugotovili, da je CDP odvisno od odmerka zaviral RANKL-inducirano osteoklastično tvorbo in delovanje, medtem ko je imel CDP majhen učinek na proliferacijo osteoklastnih prekurzorskih celic, ki jih povzroča M-CSF, v naših poskusih in vitro.

Vezava RANKL in RANK lahko vodi do rekrutiranja TRAF6 in posledične aktivacije več spodnjih signalnih poti, kot so NF-κB in MAPK (Boyle et al., 2003; Huang et al., 2006). Signalna pot NF-κB igra pomembno vlogo pri regulaciji diferenciacije osteoklastov in utišanje genov, ki kodirajo ključne proteine ​​na tej poti, lahko privede do nenormalnega razvoja kosti (Leibbrandt & Penninger, 2008). Dobro ugotovljeno je, da je NF-κB prisoten v citoplazmi nestimuliranih celic v kompleksu z IκB, vendar hitro vstopi v jedro po stimulaciji RANKL (Boyle et al., 2003). Sproščeni IκB se nato hitro razgradi, medtem ko NF-κB aktivira specifično gensko transkripcijo, posledično spodbuja diferenciacijo, zorenje in apoptozo osteoklastov (Abdelmagid et al., 2015). V tej študiji so rezultati pokazali, da CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)zdravljenje je zavrlo aktivacijo signalne poti NF-κB, ki jo povzroči RANKL, kar je dokazano z inhibicijo razgradnje IκB in fosforilacije p65 na način, odvisen od odmerka, kar lahko vključuje njegov anti-osteoklastogeni učinek. Poleg tega so signalne poti MAPK, vključno z ERK, JNK in p38, tesno vključene v osteoklastogenezo, ki jo povzroča RANKL (Li et al., 2002). Poleg tega lahko prevladujoči zaviralci p38 in JNK preprečijo osteoklastogenezo, ki jo povzroči RANKL (Chang et al., 2008; Kim et al., 2019), medtem ko ima ERK pomembno vlogo pri preživetju osteoklastov (Miyazaki et al., 2000). Ugotovljeno je, da RANKL aktivira signalno pot MAPK s povečanjem fosforilacije ERK, JNK in p38 (Mizukami et al., 2002). V naši študiji smo dokazali, da je CDP zaviral fosforilacijo, ki jo povzroča RANKL, ključnih proteinov v signalni poti MAPK. Ti rezultati skupaj kažejo, da zaviranje aktivacije signalnih poti NF-κB in MAPK prispeva k zaviralnemu učinku CDP proti osteoklastogenezi.

Aktivacija signalnih poti NF-κB in MAPK spodbuja izražanje več ključnih transkripcijskih faktorjev, kot so celični onkogen fos, aktivatorski protein 1 in NFATc1 (Huang et al., 2006; Wagner & Matsuo, 2003). NFATc1, pomemben član družine NFAT, je vključen v končno diferenciacijo osteoklastov kot glavni transkripcijski regulator (Asagiri et al., 2005). Poročalo se je, da se embrionalne izvorne celice s pomanjkanjem NFATc1- ne morejo diferencirati v osteoklaste pod stimulacijo RANKL in ektopična ekspresija NFATc1 povzroči diferenciacijo predhodnih celic mimo signalizacije RANKL, kar nakazuje, da ima NFATc1 ključno vlogo pri diferenciacijo osteoklastov (Takayanagi et al., 2002). Rezultati naše študije so pokazali supresivni učinek CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)na ekspresijo NFATc1 in njen naslednji protein CTSK. Zanimivo je, da smo opazili, da se je raven ekspresije proteina NFATc1 najprej povečala in nato zmanjšala ter dosegla najvišjo raven 5. dan po stimulaciji RANKL. To je bilo skladno z rezultati Baek et al. (2014), ki je opazil razgradnjo NFATc1, ki jo povzroči M-CSF, med pozno fazo osteoklastogeneze prek vseprisotnosti NFATc1, ki jo povzroči Cbl, na način, odvisen od kinaze Src. Rezultati imunofluorescenčnega testa so dosledno podpirali zaviralni učinek CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)na transkripcijski aktivaciji NFATc1. Poleg tega so geni, specifični za osteoklaste, vključno s CTSK, Acp5, Mmp9 in Atp6v0d2, regulirani neposredno z NFATc1 (Y. Kim et al., 2005), CDP pa jih je zavrl. Te ugotovitve kažejo, da je NFATc1 tarča inhibitornega učinka CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)na signalnih poteh NF-κB in MAPK.

Polisaharid Cistanche deserticola

5. Zaključek

Če povzamemo, smo ekstrahirali in očistili aktivni polisaharid iz CD in dokazali, da CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)je pokazal zaščitni učinek na osteoporozo, ki jo povzroča OVX, in izboljšal izgubo kosti z zatiranjem aktivnosti in delovanja osteoklastov. Poleg tega CDP(Polisaharid Cistanche deserticola)lahko zavira diferenciacijo in delovanje osteoklastov, ki jih povzroči RANKL, tako da moti signalne poti NF-κB in MAPK in posledično vpliva na aktivacijo NFATc1 navzdol. Skratka, naše ugotovitve zagotavljajo osnovo za razširitev in uporabo CDP pri zdravljenju osteoporoze.

Reference

1. Abdelmagid, SM, Sondag, GR, Moussa, FM, Belcher, JY, Yu, B., Stinnett, H., … Safadi, FF (2015). Mutacija v osteoaktivinu spodbuja diferenciacijo in preživetje osteoklastov, posredovanih z aktivatorjem receptorja liganda NFkappaB (RANKL), vendar zavira delovanje osteoklastov. Journal of Biological Chemistry, 290 (33), 20128–20146. https://doi.org/10.1074/jbc.M114.624270.

2. Baek, JM, Kim, JY, Cheon, YH, Park, SH, Ahn, SJ, Yoon, KH, … Lee, MS (2014). Aconitum pseudolaeve var. erektum zavira receptorski aktivator osteoklastogeneze, povzročene z ligandom jedrskega faktorja kapa-B, prek c-Fos/jedrskega faktorja aktiviranih T-celic, citoplazemske 1 signalne poti in preprečujepolisaharid-inducirana izguba kosti pri miših. Molekule, 19 (8), 11628–11644. https://doi.org/ 10.3390/molecules190811628.

3. Black, DM, Bauer, DC, Schwartz, AV, Cummings, SR, & Rosen, CJ (2012). Nadaljevanje zdravljenja z difosfonati zaosteoporozaza koga in kako dolgo? New England Journal of Medicine, 366(22), 2051–2053. https://doi.org/10.1056/ NEJMp1202623.

4. De Martinis, M., Di Benedetto, MC, Mengoli, LP, & Ginaldi, L. (2006). Senilnaosteoporoza: Je to imunsko pogojena bolezen? Raziskave vnetja, 55 (10), 399–404. https://doi.org/10.1007/s00011-006-6034-x.

5. Fuggle, NR, Curtis, EM, Ward, KA, Harvey, NC, Dennison, EM, & Cooper, C. (2019). Predvidevanje zlomov, slikanje in pregled vosteoporoza. Nature Reviews Endocrinology, 15 (9), 535–547. https://doi.org/10.1038/s41574-019-0220-8.

6. Hu, Y., Huang, J., Li, Y., Jiang, L., Ouyang, Y., Li, Y., … Zeng, Q. (2020).Polisaharid Cistanche deserticolainducira melanogenezo v melanocitih in zmanjša oksidativni stres preko aktiviranja poti NRF2/HO-1. Revija za celično in molekularno medicino, 24 (7), 4023–4035. https://doi.org/10.1111/jcmm.15038.

7. Huang, H., Ryu, J., Ha, J., Chang, EJ, Kim, HJ, Kim, HM, … Kim, HH (2006). Osteoklastna diferenciacija zahteva TAK1 in MKK6 za indukcijo NFATc1 in transaktivacijo NF- kappaB z RANKL. Celična smrt in diferenciacija, 13 (11), 1879–1891.

8. Liu, Y., Wang, C., Wang, G., Sun, Y., Deng, Z., Chen, L., … Xu, J. (2019). Loureirin B zavira osteoklastogenezo, ki jo povzroča RANKL, in ovariektomijoosteoporozaz zmanjšanjem aktivnosti NFATc1 in ROS. Teranostika, 9 (16), 4648–4662. https://doi. org/10.7150/thno.35414.

9. Rachner, TD, Khosla, S. in Hofbauer, LC (2011).Osteoporoza: Zdaj in prihodnost. Lancet, 377 (9773), 1276–1287. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(10)62349-5.

10. Strom, O., Borgstrom, F., Kanis, JA, Compston, J., Cooper, C., McCloskey, EV, & Jonsson, B. (2011).Osteoporoza: Breme, zagotavljanje zdravstvenega varstva in priložnosti v EU: poročilo pripravljeno v sodelovanju z mednOsteoporozafundacije (IOF) in Evropske zveze združenj farmacevtske industrije (EFPIA). Arhiv odOsteoporoza, 6, 59–155. https://doi.org/10.1007/ s11657-011-0060-1.

11. Identifikacija in karakterizacija apolisaharidiz korenin Morinda officinalis, kot induktor tvorbe kosti s povečano regulacijo izražanja ciljnih genov. Mednarodni časopis za biološke makromolekule, 133, 446–456.

12. Zhang, A., Yang, X., Li, Q., Yang, Y., Zhao, G., Wang, B., in Wu, D. (2018). Imunostimulirajoče delovanje vodno ekstrahiranegapolisaharidiiz Cistanche deserticola kot rastlinski adjuvans in vitro in in vivo. PLoS One, 13(1), člen e0191356. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0191356.

13. Zhang, K., Ma, X., He, W., Li, H., Han, S., Jiang, Y., … Tu, P. (2014). Izvlečki Cistanche deserticola lahko antagonizirajo imunosescenco in podaljšajo življenjsko dobo pri miših 8 (SAM-P8), ki so nagnjene k staranju. Na dokazih temelječa komplementarna in alternativna medicina, 2014(2), člen 601383. https://doi.org/10.1155/2014/601383.

14. Zhang, S., Zhang, Q., Zhang, D., Wang, C. in Yan, C. (2018).Proti osteoporozi adelo romana Achyranthes Biden tatapolisaharids spodbujanjem tvorbe kosti. Carbohydrate Polymers, 184, 288–298. https://doi.org/10.1016/j.

15. Zheng, H., He, B., Wu, T., Cai, J., & Wei, J. (2020). Ekstrakcija, čiščenje in antiosteoporotično delovanje apolisaharidiz Epimedium Maxim. in vitro. Mednarodni časopis za biološke makromolekule, 156, 1135–1145. https://doi. org/10.1016/j.ijbiomac.2019.11.145.

Dodatki Cistanche deserticola