2. del: Integrirana mrežna farmakologija in model cebrice za raziskovanje komponent z dvojnim učinkom Cistanche Tubulosa za zdravljenje osteoporoze in Alzheimerjeve bolezni
Mar 30, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
KLIKNITE TUKAJ ZA 1. DEL
3. Rezultati
3.1 Kandidatne spojine in Popotencialne tarče
V raziskavi kemičnih sestavin CT je bilo iz TCMSP pridobljenih skupno 75 sestavin. Nato je bil izveden PCA za vizualizacijo kemične porazdelitve CT. Kot je prikazano na sliki 1, so bile sestavine CT v kemijskem prostoru različne in 28 jih je izpolnjevalo Lipinovo pravilo petih (Lipinski, 2003). Zanimivo je, da je bilo veliko prekrivajočih se delov med sestavinami CT in odobrenimi zdravili z majhnimi molekulami za OP/AD. Ponazoril je, da so številne spojine v CT potencialno zdravilne za OP/AD. Za nadaljnje ovrednotenje njihove zdravilne sposobnosti je DL pregledal 43 spojin. Po napovedi ciljev je bilo izbranih 26 kandidatnih spojin za nadaljnjo analizo. Lahko jih povežemo s skupno 847 ciljnimi proteini.
cistamchedeluje proti Alzheimerjevi bolezni.
Genski vnosi, povezani z OP ali AD, so bili zbrani iz podatkovnih baz DisGeNET in GeneCards. Kot rezultat je bilo zbranih 3052 oziroma 8042 genskih vnosov. Oba rezultata iz zbirk podatkov DisGeNET in GeneCards smo sprejeli kot ocene ocenjevanja, pri čemer smo pregledali zgornjo petino ciljev. O petinskem razmerju so odločali predhodni poskusi. Nato je bilo ohranjenih 211 skupnih tarč OP-ED, da se ujemajo s tarčami 26 kandidatnih spojin. Končno je bilo za analizo molekularnih mehanizmov delovanja izbranih skupno 81 beljakovinskih tarč (dodatna tabela S2), ki se povezujejo z 22 kandidatnimi spojinami (dodatna tabela S3), ki tvorijo mrežo interakcij protein-protein (PPI), prikazano na sliki 2.
22 spojin je bilo razdeljenih v 11 kategorij: 5 feniletanoidnih glikozidov (PhG) (dekafeoilakteozid, cistanozid E itd.), 3 fenilakril oligosaharidi (cistanozid H, cistanozid F itd.), 3 iridoidi in iridoidni glikozidi (leonurid, genipozidna kislina, itd.), 3 lignani in lignanski glikozidi (jangambin, ( plus )-pinorezinol-O- -D-glukopiranozid itd.), 2 flavonoida (kvercetin, genistein), 1 alkaloid, 1 terpen, 1 sterol, 1 maščobni alkohol, 1 maščobna kislina in drugo. Po prejšnjih poročilih so te spojine glavne sestavine ali aktivne funkcionalne sestavine CT (Fu et al., 2018).
Na sliki 2 je bilo ugotovljeno, da ima skupno 81 skupnih ciljev korelacije z OP in AD. Stopnja PPI je bila sprejeta kot značilen parameter za opredelitev pomembnosti potencialnih ciljev. Prvih 5 domnevnih ciljnih proteinov, povezanih z OP in AD, so bili albumin (ALB), insulin (INS), interlevkin 6 (IL6), TNF-alfa (TNF) in epidermalni rastni faktor (EGF).
Slika 1.Kemijska porazdelitev na podlagi analize glavnih komponent (PCA).
3.2 Integrirana in razvrščena analiza omrežja
81 domnevnih ciljnih proteinov v tabeli S2 je bilo izbranih za začetek analize obogatitve poti GO in KEGG. Po filtriranju po vrednosti p (mejna vrednost GO manj kot ali enaka 0.05, mejna vrednost poti KEGG manjša ali enaka 0,01), 15 izrazov GO in 66 KEGG vrnjeni so bili izrazi poti, kot je prikazano na slikah 3 in 4. Vključenih je skupno 16 izrazov GO: 5 za molekularno funkcijo, 5 za biološke procese in 6 za celične komponente. Ker je bila ta študija namenjena odkrivanju potencialne skupne patogeneze OP in AD, smo odstranili izraze poti, ki so neposredno povezani z drugimi boleznimi, ostale pa razvrstili v različne funkcionalne kategorije. Predlagalo je, da bi lahko 22 aktivnih sestavin CT reguliralo skupno 66 poti, ki so bile v glavnem povezane s prenosom signala, endokrinim sistemom, imunskim sistemom, celično rastjo in smrtjo, da bi igrale konfrontacijsko vlogo proti OP in AD.
Da bi razkrili razlike v delovanju različnih vrst spojin, je bila mreža PPI, izdelana na sliki 2, analizirana glede na njihove kategorije v tabeli S3. Slika 5 prikazuje, da je lahko 5 PhG, 2 flavonoida, 1 terpen in 1 sterol, zlasti flavonoidi, pomembnejši od drugih sestavin CT proti OP in AD. Po tem so bile izbrane te 4 serije aktivnih spojin, da bi odkrili njihove stisnjene poti. Kot je razvidno iz slike 6, so PhG, flavonoidi, terpen in sterol delovali skupaj ali sami na 27 poteh, ki so vsebovale 11 modulov: rast in smrt celic, endokrini sistem, imunski sistem, prenos signala, razvoj in druge. Rezultati kažejo, da bi lahko te spojine igrale sinergistično vlogo pri pozitivnih učinkih CT na OP in AD. Treba je omeniti, da bi lahko bili zaščitni učinki PhG-jev bolj izjemni kot flavonoidi pri nevrodegenerativnih boleznih, saj so imeli PhG-ji neposredne interakcije s potjo Alzheimerjeve bolezni, medtem ko so bili flavonoidi povezani s signalnimi molekulami in interakcijo. Le sterol in terpen sta bila povezana s presnovo lipidov in izločevalnim sistemom. Poleg tega so PhG, terpen in flavonoidi pokazali potencialno povezavo z endokrinimi in presnovnimi boleznimi.
Glede na ilustracijo PPI so bili 2 flavonoida (GE, QU), 1 terpen (AA) in 1 sterol (BSS) sprejeti kot dragocene spojine za nadaljnje raziskave molekularnih mehanizmov. Zanimivo je, da smo ugotovili, da so vsi medsebojno povezani s signalno potjo MAPK in signalno potjo TGF-beta. In p-vrednost obeh poti je bila tudi veliko višja. Domnevne tarče 4 dragocenih spojin in porazdelitev njihovih prizadetih proteinov v obeh poteh so bile prikazane na sliki 7.
3.3 Validacija učinkovitosti dragocenih spojin
V tej mrežni analizi, vzpostavljeni v 3.2, smo zajeli 4 dragocene spojine za validacijo farmakološke aktivnosti. Z metodo topološko strukturne analize v tej študiji smo ugotovili, da genistein (GE, C9, DL=0.21), kvercetin (QU, C11, DL=0.28), abietinska kislina (AA, C19, DL=0.28) in -sitosterol (BSS, C20, DL=0.21) sta pokazala izvedljivo medsebojno delovanje proti OP in AD. V tem delu so bili vzpostavljeni in vivo modeli ličink ribice cebrice, inducirani s Pre ali AlCl3, da bi ocenili zaščitne učinke 4 spojin proti OP in AD.
3.3.1. Učinek 4 spojin na OP
Da bi odkrili, ali imajo 4 spojine zaščitne učinke proti OP, je bil Pre uporabljen za vzpostavitev modela OP cebrice. Razvoj osteoblastov so najprej preučili z obarvanjem z alizarinsko rdečim, da bi raziskali neposredne učinke 4 spojin na tvorbo kosti. V primerjavi s kontrolno ribico cebrico je Pre očitno povzročil spremembo v morfologiji kosti in gostoti kosti lobanj rib cebrice v modelni skupini (slika 8). Zmanjšanje površine obarvanja in IOD v skupini Pre in nasprotni trend v skupini Ed sta tudi vizualno pokazala uspeh modela OP. Še več, površina obarvanja in 2 IOD lobanj cebric v skupinah BSS/GE/QU/AA sta se znatno povečala v primerjavi z modelno skupino (slika 9). Tipični označevalci tvorbe in resorpcije kosti, kot sta ALP in TRAP, so bili analizirani, da bi dodatno ocenili učinek štirih spojin proti osteoporozi. Kot je prikazano na sliki 10, je Pre znatno zmanjšal aktivnost ALP in povečal aktivnost TRAP v nasprotju s kontrolno skupino. Nasprotno pa so spojine Ed in 4 pokazale nasproten trend od skupine Pre pri aktivnostih ALP in TRAP rib cebric. Ti rezultati skupaj so potrdili, da imajo lahko BSS, QU, GE in AA pozitivne vloge pri tvorbi kosti pri ribah cebricah s predhodno induciranim OP.
3.3.2. Vpliv 4 spojin na AD
Za ovrednotenje zaščitnih učinkov proti AD 4 spojin je bil uporabljen dobro priznan model AD cebrice, ki ga povzroča AlCl3-. Za ta model AD diskinezije je bil analizator vedenja uporabljen za sledenje gibanja cebric. Kot je prikazano na sliki 11, je bil AS skupine AlCl3 bistveno nižji od tistih v kontrolni skupini, medtem ko je bil AS za DPZ in vse 4 spojine blizu kontrolnega. DRR in RE sta bila navedena v tabeli S4. Rezultati so pokazali, da so različne koncentracije GE, BSS, QU in AA povečale DRR za 2.37-37.64 odstotka, 60.18-103.92 odstotka, 70.{{14 }}.61 odstotkov , 2.37-42.64 odstotkov oziroma z delno pomembnim (p-vrednost < 0.001-0.01).="" ∆ss="" v="" kontrolni="" skupini,="" skupini="" alcl3="" in="" skupini="" dpz="" so="" dodatno="" podprli,="" da="" je="" bila="" konstrukcija="" modela="" ad="" uspešna.="" re="" za="" ge,="" bss,="" qu="" in="" aa="" je="" bilo="" 13.12-50.45="" odstotkov,="" 11.41-63.09="" odstotkov,="" 1.63-66.89="" odstotkov,="" 13.{{34}="" },09="" odstotka="" oz.="" ti="" rezultati="" s="" pomembnimi="" razlikami="" so="" pokazali,="" da="" lahko="" ge,="" bss,="" qu="" in="" aa="" do="" neke="" mere="" izboljšajo="" diskinezijo="" rib="" cebric.="" določanje="" aktivnosti="" označevalcev="" živčne="" prevodnosti="" (ache="" in="" chat)="" v="" skupinah="" je="" prikazano="" na="" sliki="" 12.="" alcl3="" je="" znatno="" povečal="" aktivnost="" ache="" in="" zmanjšal="" aktivnost="" chat="" v="" primerjavi="" s="" kontrolno="" skupino.="" toda="" dpz="" in="" 4="" spojine="" so="" pokazale="" sposobnost="" delne="" obnovitve="" sprememb,="" ki="" jih="" povzroča="" alcl3="" v="" aktivnostih="" ache="" in="" chat.="" skladno="" je="" z="" rezultati="" ocene="" rehabilitacijskega="" učinka="" diskinezije.="" skratka,="" ge,="" bss,="" qu="" in="" aa="" imajo="" lahko="" potencial,="" da="" postanejo="" pomembna="" sredstva="" proti="">
3.4 Validacija domnevnih ciljev
Za preverjanje domnevnih ciljev, ki so bili predvideni v tem delu, so bili za analizo qRT-PCR izbrani cilji, povezani s signalnimi potmi MAPK in TGF-beta. Njihove relativne ravni izražanja mRNA v modelu OP so bile prikazane na sliki 13. V primerjavi s skupino Pre je GE povečal ravni mapk14a, fgfr1b, tgfb1, bmp2 in znižal ravni tp53, TNF-, jun, tgfbr1 in c-fos . QU je povečal ravni mapk14a, fgfr1b, tgfb1, bmp2 in znižal ravni tp53, jun in il1b. BSS je pokazal samo zmanjšane učinke na tp53, TNF- in mapk3. Kot je prikazano na sliki 14, so v modelu AD GE, QU, BSS in AA zmanjšali raven izražanja mRNA tp53. GE in QU sta znižala ravni TNF-, bmp2, tgfbr1, sp1, tgfb2 in ifn ter zvišala ravni jun, medtem ko sta GE in AA zvišala ravni mapk3. Zdi se, da je samo GE obrnil porast mapk14a, fgfr1b, fgfr1a in igf1ra. Poleg tega je QU znižal visoke ravni il1b in EGF. Relativne ravni izražanja mRNA genov, vključno s tp53, TNF-, mapk14a, mapk3, fgfr1b, bmp2, jun, il1b in tgfbr1, so se bistveno spremenile v nasprotju s kontrolno skupino v vsakem modelu. Ti rezultati kažejo, da lahko služijo kot povezava med obema boleznima. Poleg tega so ti rezultati nakazali tudi možnost sinergijskih učinkov 4 spojin.
4. Razprava
OP in AD sta najpogostejši klinični bolezni, povezani s staranjem. Njihovi zapleteni patofiziološki mehanizmi že leta omejujejo učinkovito zdravljenje dveh bolezni. Dejavniki tveganja za OP in AD so pokazali, da sta dovzetni skupini obeh bolezni delno podobni, kot so starejše ženske (Abraham et al., 2013; Patel, 2017), diabetiki (Vieira et al., 2018; Xia et al., 2012), dolgoletni kadilci (Franič in Verdenik, 2018; Zhong in sod., 2015) ter neaktivni posamezniki (Koedijk in sod., 2017; Sofi in sod., 2011). Poleg tega so sedanje študije pokazale, da imajo nekateri ključni proteini v AD tudi funkcije v presnovi kosti (Li et al., 2016; Pan et al., 2018). Obstajajo razlogi za domnevo, da OP in AD nista povsem neodvisna, imata celo nekaj potencialnih povezav. To je nakazovalo možno homoterapijo za heteropatijo, kar pomeni zdravljenje OP in AD z isto terapijo.
Na podlagi terapevtskih ciljev in načel TKM lahko neprilagojenost v bolezni razvrstimo v več "vzorcev". Torej ima lahko več bolezni, kot sta OP in AD, enak "vzorec" in se zdravijo z istimi TCM (Jiang, 2005). Kot zelišče za krepitev ledvic se CT pogosto uporablja pri zdravljenju OP in AD. Sodobne študije so zagotovile nekaj strnjenih dokazov, da ima CT pozitivne farmakološke učinke na okostje in živčni sistem. Vendar pa še vedno potrebuje podrobnejše študije, da bi razkril mehanizme CT.
cistanche in tongkat aliimajopozitivno farmakološko delovanjenaokostje in živčni sistem.
V tej študiji je bil za jasno razumevanje učinkov CT na OP in AD vzpostavljen mrežni farmakološki pristop za napovedovanje možnih učinkovin in analizo povezanih poti. Razlikuje se od prejšnjih mrežnih farmakoloških študij o CT (Liu et al., 2017). Prvič je bila izvedena molekularna mreža "eno zdravilo - dve bolezni", namesto da bi se osredotočali le na eno bolezen. Po eni strani je integrirana mrežna analiza odkrila skupno 22 aktivnih spojin CT z dvojnimi učinki za zdravljenje OP in AD. Po drugi strani pa so vzorci obeh bolezni podpirali razkrivanje njunih povezav. Klasificirana analiza je pokazala, da imajo lahko te aktivne spojine sinergistične učinke na številne module biološke funkcije, PhG, flavonoidi, terpen in sterol pa so pokazali boljšo učinkovitost. Da bi preverili izvedljivost in primernost te dirigirane mreže, so bile ribe cebrice uporabljene za izdelavo modelov OP in AD in vivo ter ovrednotene učinkovitost štirih spojin. Uporabljena je bila validacija domnevnih ciljev, da bi razkrili njihove potencialne sinergije. Te kombinirane študije in silico in in vivo so zagotovile novo izhodišče za razkrivanje zaščitnega učinka CT na dve bolezni. Lahko zagotovi nove namige o korelaciji med patogenezo OP in AD ter pomaga pri prihodnjem razvoju terapevtskih strategij za dve bolezni. Kljub temu je treba metodo še izboljšati in izpopolniti, da bi v celoti raziskali sinergijske mehanizme CT za zdravljenje OP in AD. V tej študiji so bile za validacijo izbrane le določene spojine. S poskusi je treba dodatno preveriti ostalih 18 aktivnih sestavin z osnovnimi cilji in potmi. Skupne značilnosti med OP in AD je treba še dodatno raziskati in odkriti, zlasti z vidika zdravljenja.
kje kupiti cistanche
V naši študiji je bilo dokazano, da imajo BSS, GE, AA in QU zaščitne učinke na OP in AD pri cebricah. Še bolj prijetno je, da so bile te dragocene sestavine eksperimentalno potrjene tudi v drugi literaturi in so pokazale farmakološke aktivnosti, skladne s tistimi v tem dokumentu (Ayaz et al., 2017; Chauhan et al., 2018; King et al., 2015; Ramnath et al. , 2018; Thummuri et al., 2018; Vargas-Restrepo et al., 2018; Wang et al., 2019; Yuan et al., 2018). Nadalje je dokazal učinkovitost in racionalnost te mreže ter pokazal dvojne učinke preostalih 18 spojin. Kar zadeva validacijo domnevnih tarč, je bilo 9 učinkovitih tarč, sestavljenih iz TP53, JUN, TNF, IL1B, MAPK14, MAPK3, FGFR1, BMP2 in TGFBR1, končno pregledanih kot skupne tarče OP in AD. TP53 je ključni zaviralec tumorjev in njegova aktivacija bi lahko povzročila nevronsko apoptozo (Xiao et al., 2019). TP 53, JUN in SP1 so aktivni transkripcijski faktorji v primarnem OP (Xie et al., 2015). TNF in IL1B sta pogosta vnetna citokina s funkcijami spodbujanja osteoklastogeneze (Geissler et al., 2018) in izgube kosti (Sang et al., 2017). Poleg tega sta oba terapevtska tarča za AD z zaviranjem nevrovnetja za zaščito nevronov (Liu et al., 2017). TGFB1, TGFB2, TGFBR1 in TGFBR1 imajo kompleksne učinke na nevronsko vnetje (Lippa et al., 1998) in osteolizo (Quinn et al., 2001). Kostni morfogenetski proteini (BMP) so eden od dejavnikov, vključenih v glialno diferenciacijo nevralnih matičnih celic (Kwak et al., 2014). Dokazano je, da ima povečana ekspresija BMP2 bistveno vlogo pri diferenciaciji osteoblastov (Li et al., 2017). Poleg teh eksperimentalno potrjenih tarč naj bi bilo tudi 81 skupnih tarč, navedenih v tabeli S2, terapevtske tarče, vendar niso bile raziskane ali so imele predhodne študije v drugih raziskavah.
Posebej je treba omeniti, da so vse te dragocene tarče povezane s signalnimi potmi MAPK in TGF-beta na podlagi analize obogatitve KEGG. Signalna pot MAPK uravnava celično proliferacijo, diferenciacijo, preživetje ali apoptozo, vnetje in prirojeno imunost. Poročali so, da je ogrožena signalna pot MAPK prispevala k patologiji nevrodegeneracije, kot je AD (Kim in Choi, 2015), ter neposredno zavirala osteoblaste (Xiao et al., 2019). Člani družine TGF so igrali različne vloge v okostju z neposrednimi učinki na okvaro kosti (Sun et al., 2016), medtem ko aktivacija nevronskega signaliziranja TGF-beta poveča nevrodegenerativne motnje in bolezni, podobne AD (Tesseur et al. ., 2006). Tako se lahko pričakuje, da bosta signalni poti MAPK in TGF-beta postali skupni mehanizmi za razkrivanje patogeneze OP in AD ali upočasnitev napredovanja. Poleg obeh poti je 22 aktivnih spojin uravnavalo skupno 66 poti, zlasti poti z najvišjo p-vrednostjo, kot so signalna pot prolaktina, signalna pot FoxO in diferenciacija celic Th17, bodo prav tako vredne pozornosti in raziskav ter kot ključ do odkrivanja korelacije med OP in AD. Končno lahko povzeta odkritja nakazujejo povezavo med obema boleznima v imunskem in endokrinem sistemu.
5. Zaključek
V tem delu smo predlagali mrežni farmakološki pristop, ki združuje analizo PCA, presejanje DL, zbiranje in napovedovanje več tarč, konstrukcijo omrežja PPI ter analizo poti GO in KEGG za preverjanje učinkovitosti CT za zdravljenje OP in AD. Naši rezultati so pokazali, da lahko 22 aktivnih sestavin CT v glavnem uravnava transdukcijo signalov, endokrini sistem, imunski sistem, rast celic in smrt ter igra pomembno vlogo pri zdravljenju OP in AD. Da bi bolje razumeli mehanizme CT, je bilo to omrežje globoko izkopano in analizirano glede na vrsto spojin. Na koncu smo ločeno uporabili OP in AD modela cebrice za identifikacijo 4 dragocenih spojin in povezanih tarč, kar je zagotovilo izvedljivo metodo za povezavo genoma s farmakodinamiko in iskanje spojin z dvojnim učinkom.
