2. DEL Izolacija in identifikacija feniletanoidnih glikozidov iz Aloysia Polystachya in njihova aktivnost kot zaviralcev monoaminooksidaze-A

Kaj je razlog, zakaj lahko Cistanche Actosides zavira aktivnost encimov?

Princip Cistanchejevega antioksidativnega učinka

Za več informacij se obrnite na:joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola ima številne učinke, kliknite tukaj za več informacij

Ločevanje in identifikacija sestavin z ultra zmogljivo tekočinsko kromatografijo-masno spektrometrijo

Kromatografske analize so bile izvedene s sistemom Waters Acquity UPLC H-razreda, opremljenim z detektorjem diodnih nizov (DAD) in tandemskim kvadrupolnim masnim spektrometrom Waters Xevo TQ-S z virom Z-spreja, ki deluje v načinu negativnih ionov. Založne raztopine, ki vsebujejo 1.0mg/mL ekstrakta ali standardeakteozid, izoakteozid, 6'-acetilakteozidin 4',4'',5,5''-tetrahidroksi-6,6'',3'''-trimetoksi-[C7–O–C7'']-biflavon v metanolu stopnje LC so bili pripravljeni ločeno, z ultrazvočno sonikacijo 30 min, kadar je bilo potrebno, in filtrirani skozi 0.45 μm Millipore filtre (Merck Millipore). Raztopine smo razredčili na 10µg/mL z metanolom in alikvote (5µL) vbrizgali v kolono Sigma-Aldrich Ascentis Express C18 (1{{30}}0×4,6 mm id; velikost delcev 2,7 µm). Mobilna faza je bila sestavljena iz vode, ki je vsebovala 0,1 odstotka mravljinčne kisline (topilo A) in metanola, ki je vseboval 0,1 odstotka mravljinčne kisline (topilo B), dovedena s hitrostjo pretoka 0,5 ml/min glede na profil elucije: izokratski s 3 odstotki B med 0 in 4 min, sledijo linearni gradienti od 3 do 60 odstotkov B med 4 in 19 min in od 60 do 90 odstotkov B med 19 in 23 min ter se končno vrnejo na 3 odstotke B med 23 in 28 min. Iztok je bil nadzorovan z DAD v območju od 210 do 720 nm in z MS z optimiziranim virom in delovnimi parametri, kot sledi: kapilarna napetost 2,50 kV, temperatura vira Z-pršila 150 stopinj, temperatura raztapljanja (N2) 350 stopinj, pretok desolvatnega plina 600 L/h in masni razpon m/z 150 do 600 v načinu polnega skeniranja.

Čiščenje identificiranih sestavin

Surovi hidroetanolni ekstrakt (10 g) smo raztopili v vodi:etanol (50:50; v/v) in zaporedno porazdelili proti heksanu, etil acetatu in n-butanolu. Frakcijo butanola smo koncentrirali na rotacijskem uparjalniku in 3 g vzorca frakcioniranega ekstrakta nanesli na stekleno kolono (10 × 3 cm zunanjih dimenzij), napolnjeno s C-18 RP silikagelom (230-400 mreža; Sigma -Aldrich) in eluirali z vodo, čemur so sledile zaporedne mešanice voda: metanol (90:10, 50:50 in 10:90; v/v). Podfrakcijo, dobljeno z eluiranjem z vodo: metanolom (90:10; v/v), smo nadalje očistili z RP-HPLC z uporabo Shimadzu LC-20AP sistema, povezanega z SPD-20A UV/Vis detektorjem in opremljen s kolono Phenomenex Luna® C-18 (250 × 10 mm id; velikost delcev 5 μm). Mobilna faza je bila voda: metanol, ki se je začel pri 90:10 (v/v) in se je v 100 minutah spremenil v 30:70 (v/v), da so nastale štiri znane spojine.akteozid(750 mg), izolirana stran (430 mg), 6'-acetilakteozid(42 mg) in 4',4'',5,5''-tetrahidroksi-6,6'',3'''-trimetoksi-[C7–O–C7'']-biflavon ( 13 mg). Hitrost pretoka mobilne faze je bila 1 ml/min, prostornina vbrizga je bila 500 μL, kromatogram je bil posnet pri 340 nm, UV spektri pa so bili pridobljeni v območju od 240 do 400 nm. Identiteta prečiščenih sestavin je bila potrjena z njihovimi spektri 1H- (500 MHz) in 13C-NMR (125 MHz), posnetimi na spektrometru Bruker model DPX 500, in primerjavo podatkov s tistimi, ki so na voljo v literaturi [18, 19, 41]. Čistost izoliranih spojin je bila potrjena z UPLC-DAD-MS (▶sl. 1b–d) in NMR (▶sl. S1–S12, podporne informacije).

Kvantifikacijaakteozids HPLC-diodnim detektorjem

Vzorec (1 mg) posušenega hidroetanolnega ekstrakta smo ponovno raztopili v 1 ml mešanice (80:20; v/v) metanola (stopnja JT Baker HPLC) in Milli-Q Izjemno čista voda (Merck Millipore), obdelana z ultrazvokom 30 min in filtrirana skozi 0.45-μm Millipore filter. Alikvote (20 µL) te raztopine smo analizirali na sistemu Shimadzu LC-10APvp, povezanem s SPD-M10Avp DAD in opremljenim s kolono Phenomenex Luna C18 (250 × 4,6 mm id, 5 µm), zaščiteno s Phenomenexom Predkolona C18 (4,0 × 3,0 mm id, 5 µm). Ločevanja smo izvedli pri sobni temperaturi (22 ± 1 stopinja) z uporabo mobilne faze, ki je vsebovala 0,1 odstotka ocetne kisline v vodi (topilo A) in metanol (topilo B;

JT Baker HPLC grade), ki se dovaja s konstantnim pretokom 1.0 ml/min v skladu s programom: linearni gradient od 10 do 70 odstotkov B med 0 in 32 min, od 70 do 10 odstotek B med 32 in 35 min in končno izokratsko elucijo z 10 odstotki B med 35 in 40 min. Valovna dolžina detekcije je bila nastavljena na 330 nm.

Vsebinaakteozidv izvlečku je bil ocenjen z uporaboakteozid(Sigma-Aldrich; CAS št. 61276-17-3) kot zunanji standard. Pripravljene so bile raztopine, ki so vsebovale 500, 250, 125, 62,5, 31,2 in 15,6 ug/ml referenčnega standarda, umeritvene krivulje pa so bile izdelane tako, da je bila vsaka raztopina izpostavljena analizi HPLC v treh izvodih [42]. Razmerje med površino vrha standardaakteozidna ustrezno koncentracijo analita je bila določena z linearno regresijo standardnih krivulj (▶sl. S13, podporne informacije). Analitični podatki so bili potrjeni glede linearnosti, natančnosti in točnosti v skladu s smernicami, ki jih je izdala Agência Nacional de Vigilância Sanitária [42]. Meje zaznavnosti (LoD) in kvantifikacije (LoQ).akteozidso bile {{0}}.30 oziroma 0,92 µg/mL.

Testi inhibicije monoaminooksidaze-A

Rekombinantni humani MAO-A, tiramin, klorgilin, vanilijeva kislina, 4-amino antipirin in hrenova peroksidaza so bili kupljeni pri Sigma-Aldrich. Testi inhibicije MAO-A so bili izvedeni z 96-ploščami z vdolbinicami po modificirani različici metode, ki so jo opisali López et al. [43]. Vsako vdolbinico smo naložili s 50 μL kromogene raztopine (0,8 mM vanilijeve kisline, 2,5 mM 4-amino antipirina in 4 U/mL hrenove peroksidaze v fosfatnem pufru pri pH 7,6), 100 μL 3 mM tiramina in 50-µL alikvot surovega hidroetanolnega ekstrakta ali enega od prečiščenih feniletanoidov, raztopljenega v metanolu. Nazadnje smo v vsako vdolbinico dodali alikvote 50 μL 8 U/mL MAO-A in ploščo inkubirali pri 37 stopinjah 30 minut, med tem časom pa smo vsakih 5 minut beležili absorbance z uporabo bralnika mikroplošč. Klorgilin (večji ali enak 97 odstotkom GC; Sigma-Aldrich) in metanol sta bila vključena kot pozitivna oziroma negativna kontrola na vsaki preskusni plošči.

Statistična analiza

Izvedene so bile tri neodvisne ocene inhibitornih aktivnosti MAO-A in pridobljeni podatki so bili analizirani s programsko opremo Graph-Pad Prism. IC₅₀vrednosti hidroetanolnega ekstrakta, prečiščenih feniletanoidov in pozitivne kontrole so bile izračunane z nelinearno regresijo, s simulacijo grafov log (koncentracija inhibitorja) proti normaliziranemu odstotku inhibicije.

Podporne informacije

H- in 13C-NMR spektriakteozid, izoakteozid, 6'-acetilakteozid in 4,4,5,5-tetrahidroksi-6,6,3 trimetoksi-[C7–O– C7'']-biflavon in korelacijske analize HSQC/HMBC za trije feniletanoidi so na voljo kot podporne informacije.

Reference

[1] Svetovna zdravstvena organizacija. Depresija in druge pogoste duševne motnje

Motnje: Globalne zdravstvene ocene. Ženeva: WHO; 2017

[2] Ferguson JM. SSRI antidepresivi: neželeni učinki in prenašanje. Prim Care Companion J Clin Psychiatry 2001; 3: 22–27

[3] van der Watt G, Laugharne J, Janca A. Komplementarna in alternativna medicina pri zdravljenju anksioznosti in depresije. Curr Opin Psychiatry 2008; 21: 37–42

[4] Sarris J, McIntyre E, Camfield DA. Rastlinska zdravila za anksiozne motnje, 1. del: Pregled predkliničnih študij. Zdravila za CNS 2013; 27: 207–219

[5] Sarris J, McIntyre E, Camfield DA. Rastlinska zdravila za anksiozne motnje, 2. del: Pregled kliničnih študij s podpornimi predkliničnimi dokazi. Zdravila za CNS 2013; 27: 301–319

[6] Del Vitto LA, Petenatti EM, Petenatti ME. Recursos herbolarios de San Luis (República Argentina). Primera parte: Plantas Nativas. Multiquina 1997; 6: 49–66

[7] González Y, Arrúa RD, Rojas GD, García MG. Etnofarmacobotánica foliar de "burrito",Alojzija polistahija (Griseb.) Moldenke (Verbenaceae), gojene v Paragvaju. Rojasiana 2014; 13: 31–41

[8] Mora S, Díaz-Véliz G, Millán R, Lungenstrass H, Quirós S, Coto-Morales T, Hellión-Ibarrola MC. Anksiolitični in antidepresivni učinki hidroalkoholnega izvlečka izAloysia polystachyapri podganah. Pharmacol Biochem Behav 2005; 82: 373–378

[9] Hellión-Ibarrola MC, Ibarrola DA, Montalbetti Y, Kennedy ML, Heinichen O, Campuzano M, Tortoriello J, Fernández S, Wasowski C, Marder M, De Lima TCM, Mora S. anksiolitikom podobni učinkiAlojzijapolistahija(Griseb.) Moldenke (Verbenaceae) pri miših. J Ethnopharmacol- col 2006; 105: 400–408

[10] Hellión-Ibarrola MC, Ibarrola DA, Montalbetti Y, Kennedy ML, Heinichen O, Campuzano M, Ferro EA, Alvarenga N, Tortoriello J,

De Lima TCM, Mora S. Antidepresivu podobni učinkiAlojzijapolistahija(Griseb.) Moldenke (Verbenaceae) pri miših. Fitomedicina 2008; 15: 478–483

[11] Herraiz T, González D, Ancín-Azpilicueta C, Arán VJ, Guillén H.

-Karbolinski alkaloidi v Peganum harmala in zaviranje človeške monoaminooksidaze (MAO). Food Chem Toxicol 2010; 48: 839–845

[12] Herraiz T, Guillén H, Arán VJ, Salgado A. Identifikacija, pojavljanje in aktivnost kinazolinskih alkaloidov v Peganum harmala. Food Chem Toxicol 2017; 103: 261–269

[13] Herraiz T, Guillén H. Inhibicija monoaminooksidaze-A in s tem povezana antioksidativna aktivnost v rastlinskih izvlečkih s potencialnimi antidepresivnimi učinki. Bio-Med Res Int 2018; 1018: 4810394

[14] Carradori S, D'Ascenzio M, Chimenti P, Secci D, Bolasco A. Selektivni zaviralci MAO-B: Lekcija iz naravnih izdelkov. Mol Divers 2014; 18: 219–243

[15] Fajemiroye JO, Silva DM, Oliveira DR, Costa EA. Zdravljenje anksioznosti in depresije: zdravilne rastline v retrospektivi. Fundam Clin Pharmacol 2016; 30: 198–215

[16] Fišar Z. Zdravila so povezana z delovanjem monoaminooksidaze. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 2016; 69: 112–124

[17] Naoi M, Maruyama W, Shamoto-Nagai M. Monoaminooksidaza tipa A in serotonin sta usklajeno vključena v depresivne motnje: od neravnovesja nevrotransmiterjev do oslabljene nevrogeneze. J Neural Transm 2017; 125: 53–66