2. del: Verbaskozid ščiti celice trebušne slinavke pred ER-stresom
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, plus , Paola Marciani 1, plus , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3, Michela Castagna 1 in Carla Perego 1,*
Kliknite tukaj nazaj na 1. del
3.4 Verbaskozid modulira mitohondrijsko aktivnost in dinamiko celic
Testi sposobnosti preživetja MTT kažejo na možen vplivverbaskozidneposredno na mitohondrije, kar zagotavlja povezovanje izločanja inzulina s prehranjevalnim stanjem in preživetje celice v tej vrsti celic. Oblika in membranski potencial sta označevalca zdravja mitohondrijev [42]. Najprej smo ovrednotili potencial mitohondrijske membrane z označevanjem celic z MitoSpyw Orange CMTMRos, prepustnim barvilom, katerega koncentracija je odvisna od potenciala notranje mitohondrijske membrane, medtem ko je bil MitoSpyw Green FM uporabljen za normalizacijo podatkov na mitohondrijsko maso (slika 4A, B). Membranski potencial mitohondrijev vverbaskozid-tretiranih celic se je povečalo v primerjavi s kontrolo v bazalnih in stresnih pogojih. zanimivo,verbaskozidpresnovki so imeli različne učinke. Cafe kislina ni izboljšala mitohondrijskega potenciala, medtem ko je hidroksitirozol povzročil od odmerka odvisno okvaro mitohondrijske funkcije, v skladu s podatki o viabilnosti celic je bil tak učinek bolj očiten po izpostavljenosti H2O2 (slika S3).
Ker je funkcija strogo povezana z morfologijo, smo izmerili Feretov premer, površino in krožnost mitohondrijev. Akutni oksidativni stres spodbuja obsežno cepitev mitohondrijev, kar povzroči manjše, krožne mitohondrije [42]. V pogojih stresa H2O2 so bili mitohondriji celic, zdravljenih z verbaskozidom, bolj podolgovati in so pokazali povečano površino kot kontrolni (slika 4C, D in slika S4). Mitohondrijska krožnost je bila nižja v celicah, zdravljenih z verbaskozidom, kot v kontrolnih skupinah, razlike pa so bile bolj očitne v celicah, obdelanih s H2O2 (slika S3), kar ponovno potrjuje zaščitno vlogo polifenola.
Sposobnost teh organelov, da spremenijo svojo obliko kot odziv na prehranska stanja ali stresne razmere, je pod nadzorom dogodkov fuzije in cepitve in zahteva mitohondrijsko gibljivost [39]. Sledenje gibanju mitohondrijev nas je pripeljalo do izračuna kumulativne prevožene razdalje in analiza je pokazala znatno povečanje dinamike mitohondrijev v celicah, zdravljenih z verbaskozidom, v primerjavi s kontrolo že v bazalnih pogojih (slika 4E, F in videoposnetki S1–S4). Učinek je bil izrazitejši po zdravljenju s H2O2, dejansko je predhodno zdravljenje z verbaskozidom skoraj popolnoma odpravilo vpliv oksidativnega stresa na mitohondrijsko dinamiko.
Skupaj ti podatki močno podpirajo ključno vlogo verbaskozida pri zagotavljanju dinamike mitohondrijev, kar je ključnega pomena za spodbujanje hitrega prilagajanja tega organela na stresne razmere.
3.5 Vpliv verbaskozida na preživetje in delovanje Langerhansovega bolnika
Glede na prevodni potencialverbaskoziduporabe v zdravju ljudi, smo preverili njegov vpliv na človeške izolirane Langerhansove otočke, ustreznejši model za fiziopatološke in farmakološke študije na -celicah. Izolirane otočke smo 5 dni zdravili s 16 uM verbaskozida in ovrednotili potencial mitohondrijske membrane. Kot je prikazano na sliki 5A, medtem ko je bil potencial organelov v kontrolnih človeških otočkih po izpostavljenosti H2O2 ogrožen, se notranji membranski potencial mitohondrijev v otočkih, predhodno obdelanih z verbaskozidom, ni bistveno zmanjšal, kar podpira hipotezo o zaščitni vlogi verbaskozida pred ROS-induciranimi - celično disfunkcijo. Analiza izražanja markerjev ER-stresa je pokazala pomembno zmanjšanje frakcije P-eIF2 v dveh različnih pripravkih otočkov, vzdrževanih v 16 uM verbaskozida, kar potrjuje znižanje te poti tudi v človeških vzorcih (slika 5D). Koristne učinke zdravljenja s polifenoli je potrdila povečana vsebnost insulina, opažena pri otočkih, zdravljenih z verbaskozidom, v primerjavi s kontrolami (slika 5B). Razpršenost podatkov v naših poskusih ni omogočila dokazati nobene pomembne razlike z glukozo stimuliranega izločanja insulina (GSIS) v otočkih, zdravljenih z verbaskozidom, čeprav se zdi pozitiven trend očiten tako v bazalnih kot v stresnih pogojih (slika 5C).
4. Razprava
Oksidativni stres in vnetje sta osnova za disfunkcijo celic, ki se pojavi med T2D [43,44], zato so funkcionalno hrano, prehranske dodatke in fitokemikalije raziskali kot orodja za preprečevanje sladkorne bolezni tipa 2 [45]. V tem delu smo se osredotočili na verbaskozid, za katerega je znano, da deluje protivnetno in antioksidativno na nevrone [18]. Kljub visoki strukturni kompleksnosti so verbaskozid in izoverbaskozid našli v krvni plazmi podgan, hranjenih z izvlečkom Lippia citriodora, skupaj z nekaterimi metaboliti [20]. Poleg tega so kopičenje verbaskozida in verbaskozida v celicah odkrili v celični liniji raka dojke SKBR3 [23] in študije, izvedene na celicah Caco-2, kažejo, da zmerne količine verbaskozida in izoverbaskozida ostanejo nedotaknjene in biološko dostopne po prebavi in vitro postopek. Poleg tega lahko Caco-2 sprejme obe molekuli s hitrim in linearnim transportom v območju od 10 do 100 uM [22]. Podatkov o biološki uporabnosti verbaskozida pri ljudeh ni bilo, vendar zgoraj omenjene študije kažejo, da je morda izvedljivo, da nepresnovljeni verbaskozid prehaja črevesno pregrado, kroži v krvni plazmi in ima antioksidativne učinke na endokrine celice trebušna slinavka.
Ugotovili smo od odmerka odvisno (0.8–16 uM) zaščitno vlogo verbaskozida na klonskih in človeških celicah, tako v bazalnih kot v stresnih pogojih. Ta učinek je posledica samega verbaskozida in ne njegovih metabolitov kofeinske kisline in hidroksitirozola, ki se dejansko zdita citotoksična pri koncentraciji 16 uM. Koncentracije, ki so bile dokazano aktivne v naših poskusih, so v skladu s tistimi, opisanimi pri živalih, hranjenih z verbaskozidom [20].
Čeprav ne vemo, ali verbaskozid deluje zunajcelično z vezavo na membranski receptor ali se internalizira z endocitozo in deluje znotrajcelično, naši podatki potrjujejo, da ima verbaskozid antioksidativne in protivnetne lastnosti ter ščiti celice pred motnjami, povezanimi z ER-stresom, tako da zmanjša UPR in spodbujanje mitohondrijske dinamike.
Dejansko smo zaznali znatno zmanjšanje vsebnosti ROS v celicah, zdravljenih z verbaskozidom, kar je dodatno potrjeno z zmanjšanjem peroksidacije lipidov, izmerjeno z izražanjem HNE in akroleina. Za razliko od večine rastlinskih polifenolov, aktivnost verbaskozida pri odstranjevanju ROS poteka predvsem posredno (preko povečane regulacije encimov za odstranjevanje ROS) in ne po neposrednih poteh. Pravzaprav poveča transkripcijo genov nekaterih antioksidativnih encimov z aktivacijo poti Nrf2 (NF-E2-povezan faktor 2) in prek mehanizma, ki je odvisen od AhR (arilnega ogljikovodikovega receptorja) [24,29]. Tako smo ugotovili povečano izražanje SOD1 v celicah, zdravljenih z verbaskozidom.
Homeostaza ROS je izjemno pomembna pri patologiji celic. Zaradi pomanjkanja antioksidativnih encimov povišane proizvodnje ROS ni mogoče nevtralizirati in sproži se ER stres, ki spodbuja napačno zlaganje beljakovin. ER stres vodi do zmanjšanja transkripcije in prevajanja insulina z aktivacijo UPR [44, 46]. Ta pot ima glavni namen obnovitev funkcije ER z reprogramiranjem genske ekspresije, vendar, ko je prekomerno stimulirana, sproži apoptozo. Naši podatki kažejo, da je pomembno delovanje verbaskozida ublažitev UPR, kar omogoča modifikacije, potrebne za popravilo disfunkcije ER, brez povzročanja apoptoze. V skladu s to možnostjo je bila ekspresija proteinov BIP, HSP70 in PERK zmanjšana v celicah, zdravljenih z verbaskozidom, in aktivacija poti PERK je bila oslabljena kot odziv na ER stres, ki ga povzroča tunikamicin. O podobnem delovanju so poročali za tirozol v celični liniji insulinoma NIT-1 [47].
Še posebej zanimiva je sposobnost verbaskozida, da modulira aktivacijo PERK veje UPR. V celicah je ta pot potrebna za vzdrževanje bazalne sekretorne homeostaze in preživetje celic, pri sladkorni bolezni pa je močno deregulirana [41,48]. Še bolj zanimivo je, da pogoste različice pri PERK prispevajo k tveganju za prediabetes in recesivne mutacije v genu EIF2AK3 (ki kodira PERK) so osnova dovzetnosti za Wolcott-Rallisonov sindrom, za katerega je značilna trajna neonatalna od insulina odvisna sladkorna bolezen [49,50].
V našem sistemu so v prisotnosti verbaskozida odkrili tudi znižano regulacijo vnetne poti IKB -NFKB. NFKB predstavlja glavno vnetno pot v celicah in njegova trajna aktivacija sproži kaskado dogodkov, ki se zaključijo s smrtjo celic. V stresnih celicah zmanjšanje ekspresije NFKB ščiti celice trebušne slinavke pred diabetogenimi povzročitelji [27, 51], kar dodatno podpira uporabo verbaskozida pri preprečevanju sladkorne bolezni. Zanimivo je, da signalizacija PERK aktivira transkripcijska faktorja NFR2 (vpleten v redoks homeostazo) in NFKB, kar pojasnjuje antioksidativne in protivnetne učinke verbaskozida [40, 52].
Naši podatki razkrivajo tudi pomembno vlogo verbaskozida pri aktivnosti in dinamiki mitohondrijev.
Označevalec kakovosti delovanja mitohondrijev je njihova dinamika, proces, za katerega so značilni usklajeni cikli dogodkov fuzije in cepitve, ki uravnavajo število mitohondrijev, porazdelitev, morfologijo in membranski potencial [39]. V skladu s to možnostjo verbaskozid izboljša potencial mitohondrijske membrane tc3 tako v bazalnih kot v stresnih pogojih. Ponovno je učinek posledica verbaskozida in ne njegovih metabolitov, saj kofeinska kislina ne izboljša delovanja mitohondrijev, hidroksitirozol pa bistveno zmanjša potencial organelov. S sledenjem gibanja mitohondrijev so opazili povečano dinamiko mitohondrijev in spremembe v njihovi morfologiji, kar nakazuje, da verbaskozid spodbuja program mitomorfoze. Preoblikovanje celičnega mitohondrijskega omrežja vpliva na sestavo superkompleksov dihalne verige, s čimer se spremeni ne le celični metabolizem, ampak tudi njegovo redoks stanje in omogoči celicam, da se bolje zoperstavijo oksidativnemu stresu in vnetju [5,37,39].
Čeprav molekularni mehanizem še ni znan, lahko domnevamo, da verbaskozid, tako kot drugi polifenoli, ščiti mitohondrijsko DNA z zmanjšanjem koncentracije ROS [53] in preprečuje odpiranje prehodnih por mitohondrijske prepustnosti [54], kar zagotavlja fiziološko mitohondrijsko aktivnost. Druga zanimiva možnost je, da je sprememba dinamike in aktivnosti mitohondrijev ponovno posredovana z delovanjem verbaskozida na UPR. Dejansko nedavna raziskava na mitohondrijskem področju kaže, da imajo mesta interakcije ER-mitohondriji ključno vlogo pri nadzoru mitohondrijske dinamike in aktivnosti kot odziv na oksidativni stres in PERK je vključen v ta pojav [55]. Večina in vitro študij s polifenoli je bila opravljena na celičnih linijah, pogosto tumorskega izvora, ki se razlikujejo od prvotnih celic v smislu metabolizma in proizvodnje ROS. Tukaj ponujamo dokaze, da ima verbaskozid zaščitni učinek tudi na človeške izolirane Langerhansove otočke, končno tarčo intervencije pri sladkorni bolezni. Zanimivo je, da polifenol ublaži aktivacijo signalizacije PERK že v bazalnih pogojih, s čimer poveča vsebnost insulina in prepreči mitohondrijske disfunkcije, ki jih povzroča oksidativni stres. Treba je še razjasniti, ali učinek polifenola na vsebnost insulina odraža sposobnost spojine, da prepreči smrt celic, ublaži stres ER ali neposredno nadzoruje ekspresijo genov insulina, kot je prikazano za druge polifenolne spojine [56]. Ti podatki so še posebej pomembni glede na možno uporabo verbaskozida kot komplementarne terapije pri zdravljenju sladkorne bolezni.
5. Sklepi
Študije in vitro o klonskih in človeških celicah, o katerih poročamo tukaj, kažejo, da ima verbaskozid zaščitne učinke proti disfunkcijama, povezanim z ER, stresom, ublaži aktivacijo PERK veje UPR in izboljša dinamiko mitohondrijev. Ker motnje homeostaze ER sprožijo poškodbe celic in sladkorno bolezen, ti podatki dajejo utemeljitev za možno uporabo verbaskozida kot nutracevtika pri preprečevanju in zdravljenju bolezni. Kljub temu je treba za učinkovito klinično uporabo verbaskozida rešiti veliko vprašanj. Kljub številnim laboratorijskim študijam so zanesljive klinične študije, ki potrjujejo zdravstvene učinke verbaskozida in vivo, omejene. Poleg tega je povečanje njegove stabilnosti in biološke uporabnosti obvezno za prihodnjo uporabo te spojine v zdravju ljudi. S tega vidika je verbaskozid zanimiva molekula, ker ima njegov ogrodje različna reaktivna mesta, ki jih je mogoče spremeniti s kombinirano kemijo. Pričakujemo, da bodo informacije, ki izhajajo iz teh študij, odprle poti za terapevtsko modulacijo oksidativnega stresa in vnetja v patoloških stanjih z uporabo naravnih spojin.
Dodatna gradiva: Naslednje je na voljo na spletnem naslovu http://www.mdpi.com/2227-9059/8/12/582/s1. Slika S1: Učinki kofeinske kisline in hidroksitirozola na sposobnost preživetja celic. Slika S2: Učinki verbaskozida na ER stres, ki ga povzroči tunikamicin. Slika S3: Učinki kofeinske kisline in hidroksitirozola na potencial mitohondrijske membrane. Slika S4: Kvantitativne slikovne analize mitohondrijev v celicah, obdelanih s kofeinsko kislino in hidroksitirozolom. Video posnetki S1, S2: dinamika mitohondrijev, posneta v bazalnih pogojih, v odsotnosti (S1) ali prisotnosti (S2) verbaskozida. Video S3, S4: Dinamika mitohondrijev, posneta v pogojih oksidativnega stresa, v odsotnosti (S3) ali prisotnosti (S4) verbaskozida.
Avtorski prispevki: Konceptualizacija, AG, PM in CP; urejanje podatkov, AG in PM; formalna analiza, AG in PM; pridobivanje sredstev, CP; preiskava, MC; metodologija, AM in SG; viri, FB, RR in ADG; nadzor, CP; validacija, AM, SG in MC; vizualizacija, AG in AM; pisanje—izvirni osnutek, AG; pisanje—recenzija in urejanje, PM, AM, FB, RR, ADG, MC in CP Vsi avtorji so prebrali in se strinjali z objavljeno različico rokopisa.
Financiranje: Ta raziskava ni prejela zunanjega financiranja.
Zahvala: Radi bi se zahvalili Carlu Corinu in Mariu Dell'Agliju za reagente in koristno razpravo.
Navzkrižje interesov: Avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov.
Reference
1. Cho, NH; Shaw, JE; Karuranga, S.; Huang, Y.; da Rocha Fernandes, JD; Ohlrogge, AW; Malanda, B. IDF Diabetes Atlas: Globalne ocene razširjenosti sladkorne bolezni za leto 2017 in projekcije za leto 2045. Diabetes Res. Clin. Prakt. 2018, 138, 271–281. [CrossRef]
2. Leslie, RD; Palmer, J.; Schlott, NC; Lernmark, A. Diabetes na razpotju: pomen klasifikacije bolezni za patofiziologijo in zdravljenje. Diabetologija 2016, 59, 13–20. [CrossRef] [PubMed]
3. Tokarž, VL; MacDonald, PE; Klip, A. Celična biologija sistemske funkcije insulina. J. Cell Biol. 2018, 217, 2273–2289. [CrossRef] [PubMed]
4. Perego, C.; Da Dalt, L.; Pirillo, A.; Galli, A.; Catapano, AL; Norata, GD Presnova holesterola, delovanje celic trebušne slinavke in diabetes. Biochim. et Biophys. Acta (BBA) Mol. Osnova Dis. 2019, 1865, 2149–2156. [CrossRef] [PubMed]
5. Galli, A.; Alžirija, M.; Marciani, P.; Schulte, C.; Leonardi, C.; Milani, P.; Mafoli, E.; Tedeschi, G.; Perego, C. Oblikovanje diferenciacije in delovanja celic trebušne slinavke: vpliv mehanotransdukcije. Celice 2020, 9, 413. [CrossRef]
6. Ashcroft, FM; Rorsman, P. Diabetes Mellitus in celica: zadnjih deset let. Celica 2012, 148, 1160–1171. [CrossRef] [PubMed]
7. Rosengren, AH; Braun, M.; Mahdi, T.; Andersson, SA; Travers, ME; Shigeto, M.; Zhang, E.; Almgren, P.; Ladenvall, C.; Axelsson, AS; et al. Zmanjšana insulinska eksocitoza v človeških celicah trebušne slinavke z genskimi različicami, povezanimi s sladkorno boleznijo tipa 2. Diabetes 2012, 61, 1726–1733. [CrossRef] [PubMed]
8. Polonsky, KS Dinamika izločanja insulina pri debelosti in sladkorni bolezni. Int. J. Obes. 2000, 24, S29–S31. [CrossRef]
9. Roden, M.; Shulman, GI Integrativna biologija sladkorne bolezni tipa 2. Narava 2019, 576, 51–60. [CrossRef]
