Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Kliknite tukaj za 1. del

Zelišče cistanke ima zelo dober nevroprotektivni učinek

2.6. Anti-apoptotični učinki citokininov, določeni z meritvami aktivnosti kaspaze-3/7

Kot je razvidno iz zgoraj opisanih testov barvanja s PI, je SAL povzročil zvišanje stopenj smrti celic SH-SY5Y. Ker je SAL povezan z apoptozo in nekrozo [51], smo raziskali tudi aktivacijo kaspaze-3 in 7 (casp-3/7) kot specifičnega označevalca apoptoze (izvršilna faza) [52] po izpostavitvi celic CK. Aktivnosti kaspaze-3/7, zabeležene po zdravljenju z vsako od preskusnih spojin, so bile normalizirane glede na tiste, zabeležene po zdravljenju s 50{{30}} uM SAL (nastavljeno na 100 odstotkov). Kot je prikazano na sliki 4, je dobro znani zaviralec kaspaze Ac-DEVD-CHO (vključen kot specifična kontrola, povezana z apoptozo) močno zaviral aktivnost kaspaze-3/7 pri submikromolarnih koncentracijah (na 36,3 ± 2,66 in 25,2). ± 2,69 odstotka ravni v celicah, zdravljenih samo s SAL pri 0,05 oziroma 0,5 uM). Podobne ravni inhibicije so že prej opazili [53] v različnih in vitro modelih nevrodegeneracije SH-SY5Y na osnovi celic. Pozitivna kontrola NAC je tudi znatno zmanjšala aktivnost kaspaze-3/7, na 88,7 ± 1,87 odstotka in 78,5 ± 2,56 odstotka ravni, ki jih povzroči SAL, pri 100 uM oziroma 1000 uM. Testirani CK so imeli širok spekter učinkov na aktivnosti kaspaze-3/7. Zanimivo pri ribozidih CK je, da je imel samo cZR pomembne učinke na aktivnosti pri 0,1 uM (zmanjšal jih je na 83,3 ± 4,33 odstotka ravni, ki jih povzroča SAL), medtem ko iPR pri 1 uM ni pomembno zmanjšal casp-3 ,7. Končno je K3G zmanjšal aktivnost kaspaze-3/7 z največjim učinkom pri 10 uM (na 81,7 ± 4,31 odstotka ravni, ki jo povzroči SAL). Na splošno je SAL povzročil 1.6-kratno povečanje aktivnosti kaspaze-3/7 v primerjavi z zdravimi kontrolnimi celicami (CTR, slika 4), v skladu z rezultati prejšnje študije, v kateri je podobno Uporabili smo koncentracijo SAL (400 uM) in isto celično linijo [54]. Znano je, da NAC vpliva na aktivnost kaspaze-3/7 v več modelihnevronskismrt [55–58]. Vendar tukaj predstavljeni rezultati zagotavljajo prvo predstavitev njihove kaspaze-3/7 v celično zasnovanem modelu SAL, induciranem s SH-SY5Y.nevronskismrt. Pozitivna kontrola je zmanjšala aktivnost kaspaze-3/7, inducirano s 500 uM SAL, na podoben način kot CK, vendar sta bila cZR in K3G učinkovita tudi pri submikromolarnih ali mikromolarnih koncentracijah. Druge študije s stresnimi modeli, povezanimi s PD (toksičnost, ki jo povzroči zaviralec proteasomov MG 132- ali H2O2- v celicah SH-SY5Y [17] in fibroblastih [15]) in Huntingtonovo boleznijo (model stradanja seruma v PC12 celice [19]) so prav tako pokazale, da imata CK K in tZR lahko anti-apoptotične (kaspaze-3) aktivnosti [17] in da imata lahko tako K kot tZR aktivnosti proti staranju [17,19] . Poleg tega so povezave med padajočo aktivacijo casp-3,7 innevroprotektivnoaktivnosti so poročali za SAL in modele, povezane s SAL [54, 59, 60].

Slika 4. Aktivnost kaspaze-3/7 v modelu PD, ki ga povzroči SAL. Potroji se v najmanj štirih neodvisnih dneh. * P v primerjavi z vozilom s 500 uM SAL, # P v primerjavi z vozilom brez 500 uM SAL.

2.7. Identifikacija citokininske nevroprotektivne aktivnosti v modelu celične smrti, povzročene z glutamatom

Ker celice SH-SY5Y ne izražajo vseh podenot receptorja NMDA [61], je najverjetnejši mehanizem toksičnosti glutamata (Glu) blokada cistin/glutamatnega Xc-antiporterja z veliko indukcijo oksidativnega stresa [62]. Prejšnji avtorji so že dokazali povezavo med celično smrtjo, ki jo povzroča glutamat, in nekroptozo v celicah SH-SY5Y [63] ter pomen aktivacije kaspaze-3 pri toksičnosti, ki jo povzroča glutamat zanje [62,64]. Več študij je pokazalo tudi pojav celične smrti zaradi železa (feroptoza) po zastrupitvi z glutamatom [62,65,66] in navedlo pojav treh vrst celične smrti (nekroptoza, apoptoza in feroptoza) po blokadi Xc -protiporter sistem. Za dokončanje celovite ocenenevroprotektivnopotencial testiranihcitokinini, je bil sistem za testiranje celične smrti, povzročene z glutamatom, vključen v analitično ploščo z znaniminevroprotektivnokelator železa deferoksamin (DFO) in zaviralec nekroptoze nekrostatin-1 (NEC-1) [67] kot pozitivni kontroli. Tukaj so bile celice SH-SY5Y diferencirane 48 ur, nato obdelane s 160 mM Glu ali v sočasnem zdravljenju z različnimicitokininakoncentracije ({{0}}.1–10 uM) 24 ur in obarvani s PI. V tem modelu je bil učinek Glu na celično smrt 100-odstotni signal PI, zato je bilo ovrednoteno zmanjšanje celične smrti s testnimi spojinami. Glu je povzročil skoraj 4--kratno povečanje celične smrti v primerjavi z zdravimi kontrolami SH-SY5Y (26,1 ± 0,42 odstotka). Pregled pozitivnih kontrol incitokininije razkrilo, da sta obe pozitivni kontroli NEC-1 (50 uM, 76,6 ± 2,51 odstotka) in DFO (10 uM, 84,2 ± 4,54 odstotka) zmanjšali celično smrt, ki jo povzroča glutamat. Kot je prikazano na sliki 5A, s ploščecitokinini, samo tricitokininilahko zaščitilinevron-podobne celice SH-SY5Y na podoben način kot pozitivne kontrole. Najbolj aktivnicitokininista bila trans-zeatin (tZ) (0.1 uM, 79,5 ± 2,91 odstotka; 1 uM, 81,3 ± 2,77 odstotka) in cis-zeatin (CZ) (0.1 uM, 82,1 ± 3,29 odstotek ; 1 uM, {{20}}.2 ± 2,89 odstotka ) in kinetin (K) (1 uM, 88.0 ± 3,76 odstotka ; 10 uM, 79,9 ± 3,44 odstotka ). Za potrditev njihove obetavne aktivnosti je bil uporabljen ortogonalni test za podrobnejšo razjasnitev bioloških učinkov CK v tem modelu: test sproščanja laktat dehidrogenaze (LDH) [68], ki je prav tako pokazal dramatično (4-krat) povečanje toksičnosti po zdravljenju z Glu. Zanimivo je, da nam je določanje sproščanja LDH omogočilo razlikovanje med aktivnostmi CK in pozitivnimi kontrolami (NEC-1 in DFO). CK so imeli zmerno, a pomembno zaščitno delovanje (tZ je zmanjšal smrtnost na 91,9 ± 1,40 odstotka pri 0,1 uM; cZ jih je zmanjšal na 92,3 ± 1,15 odstotka pri 0,1 uM in 91,7 odstotka ± 1,56 odstotka pri 1 uM; K jih je zmanjšal na 92,2 ± 1,15 odstotka pri 0,1 uM 1,06 odstotka pri 1 uM). Pozitivni kontroli NEC-1 in DFO sta imeli močnejše zaščitne učinke, vendar sta bili učinkoviti pri veliko višjih koncentracijah (zmanjšanje stopenj na 76,9 ± 2,94 odstotka oziroma 81,6 ± 3,74 odstotka pri 50 oziroma 10 uM) (slika 5B). Test LDH je potrdil indikacije, pridobljene z barvanjem s PI, in opaženi učinki pozitivnih kontrol so bili skladni z objavljenimi podatki [69,70]. Ugotovitve o učinkih K v modelu celične smrti, ki jo povzroča Glu v celicah HT22 [18], in naša opazovanja učinkov reprezentativnih CK, kot so tZ, cZ in K, kažejo, da so CK obetavni kandidati za zdravljenje nevrodegenerativnih bolezni, povezanih z oksidativnim stresom [ 71]. Končno sta bila prednostna tZ in cZ, ker sta bila učinkovita pri nižjih koncentracijah in sta bila skupaj s K izbrana za nadaljnje študije njunih učinkov na ravni oksidativnega stresa in aktivacijo kaspaze-3,7.

cistancheoceneo učinkihnevroprotekcija

2.8. Učinki citokininov na oksidativni stres, ki ga povzroča Glu, v celicah SH-SY5Y

Za razliko od prejšnjega modela lahko Glu povzroči oksidativni stres v celicah SH-SY5Y po ​​različnih poteh. Eden temelji na blokadi cistin/glutamatnega (Xc-) antiporterja, kar vodi do izčrpavanja glutationa (GSH) in negativnih učinkov na aktivnost superoksid dismutaze (SOD) [62]. Glu-posredovana celična smrt domnevno vključuje tudi tvorbo ROS, ki jo poganja Rac-NADPH-oksidaza (zlasti superoksidni radikal) v celicah SH-SY5Y [72]. Te ugotovitve kažejo, da je glavni vzrok celične smrti v Glu-induciranem modelu OS. Znotraj modela,nevron-podobne celice so bile sočasno obdelane z Glu in testiranimi spojinami, obarvane z DHE in opazovane s fluorescenčno mikroskopijo. Kot je razvidno iz slike 6A, so opazili dramatičen porast rdeče fluorescence DHE v celicah, obdelanih z Glu, kar je bilo izboljšano s snovmi pozitivne kontrole in testiranimi CK. Na podlagi opazovanja z mikroskopom je bila kvantifikacija ravni superoksida izvedena v celicah, induciranih z Glu, na podoben način, s testom DHE, kot v celicah, induciranih s SAL. Rezultati so bili normalizirani glede na ravni, ki jih povzroča sam Glu (nastavljen kot 100 odstotkov), kar je povzročilo dramatično, skoraj 3--kratno povečanje ravni superoksida v samo 4 urah vnevron-podobne celice SH-SY5Y glede na ravni v zdravih kontrolnih celicah (CTR: 33,79 ± 1,45 odstotka). Kot je prikazano na sliki 6B, so CK, kot so tZ, cZ in K, pomembno znižali raven superoksida v celicah, zastrupljenih z Glu: 0.1 uM tZ, 0.1 uM cZ, 1 uM in 10 uM K ga je zmanjšal na 81,0 ± 4,03, 80,6 ± 3,89, 81,8 ± 3,39 in 83,8 ± 2,32 odstotka ravni v celicah, zdravljenih samo z Glu. Te ravni so primerljive s tistimi, pridobljenimi z zaviralcem nekroptoze NEC-1 (80,5 ± 3,19 odstotka pri 5 uM in 80,4 ± 2,70 odstotka pri 50 uM) in kelatorjem železa DFO (80,2 ± 3,80 odstotka pri 10 uM). Rezultati, dobljeni z modelom celične smrti, ki jo povzroča Glu, zlasti učinki pozitivnih kontrol, so skladni s prejšnjimi poročili [70,73]. Prejšnji dokazi, da imajo CK učinke na zmanjševanje OS pri modelih, ki jih povzroča Glu, ali podobnih modelih, so omejeni na dokaz, da je K močno sredstvo za zmanjševanje OS (pri približno 23 uM) v modelu celične smrti, ki temelji na celicah HT22 in Glu [18]. ]. Ugotovili smo, da ima K učinek zmanjšanja OS pri nižjih koncentracijah (1–10 uM) v naših celicah SH-SY5Y. Poleg tega so opazili koristne dolgoročne učinke tZ na človeške fibroblaste, vključno z aktivnostjo razgradnje vodikovega peroksida [15], kar kaže na to, da imata tZ in cZ lahko posredne učinke zmanjševanja OS v modelih celične smrti, ki jih povzroči Glu. Poleg tega so druga poročila poudarila povezave med učinkom zmanjšanja OS, ki ga posredujejo CK, in zaščitno aktivnostjo [22,74–76]. Skupaj so tZ, cZ in K pokazali presenetljivo močne učinke zmanjšanja OS, primerljive z učinki pozitivnih kontrol, kljub različni jakosti v skupnemnevroprotektivnoučinek.

Slika 5. (A) Umrljivostnevron-podobne celice SH-SY5Y v modelu celične smrti, ki ga povzroči glutamat (Glu); (B) Glu-inducirana toksičnost (sproščanje LDH).nevron-kot celice SH-SY5Y. Potroji v vsaj treh neodvisnih dneh.* P v primerjavi z vehiklom s 160 uM Glu, # P v primerjavi z vehiklom brez 160 uM Glu.

Slika 6. (A) Glu-induciran oksidativni stres (OS) in aktivnost za zmanjševanje OS navedenih spojin pri ljudehnevronSH-SY5Y podobne celice, vizualizirane s fluorescenčno mikroskopijo po označevanju z dihidroetidijem (DHE). Palice=50 um. Slike kažejonevron-podobne celice SH-SY5Y, obdelane z DMSO (kontrola), 160 mM glutamata (Glu) samega in skupaj z: 10 uM deferoksamina (plus DFO), 50 uM nekrostatina{{6} } (plus NEC-1), 0,1 uM tZ (plus tZ) in 0,1 uM cZ (plus cZ) 4 ure, nato obarvan z DHE. (B) Glu-inducirana tvorba superoksidnega radikala vnevron-podobne celice SH-SY5Y po ​​4 urah. Graf prikazuje kvantifikacijo celic, obarvanih z DHE, z uporabo bralnika mikroplošč Infinite M200 Pro (Tecan, Avstrija). Potrojni v petih neodvisnih dneh.

* P v primerjavi z vehiklom s 160 uM Glu, # P v primerjavi z vehiklom brez 160 uM Glu.

2.9. Učinki citokininov na aktivnost kaspaze-3/7 v modelu celične smrti, povzročene z Glu

Glu ima podobne toksične učinke na celice SH-SY5Y kot prej poročani učinki na celice HT22, povezane z blokado Xc-antiporterja. Tako so v obeh primerih vključeni neapoptotični mehanizmi celične smrti (feroptoza, nekroptoza itd.) [62], čeprav se izražanje kaspaze-3 in do neke mere podenote NMDA NR1 lahko močneje pojavi pri SH celice -SY5Y [61]. Zato se lahko končne stopnje celične smrti v obeh celičnih linijah razlikujejo. Prispevek aktivnosti kaspaze-3 je bil opažen v številnih študijah v Glu-induciranem modelu celične smrti celic SH-SY5Y [62,77–79]. V tem testu,nevron-podobne celice SH-SY5Y smo tukaj obdelali s 160 mM Glu, kar vodi do povečanja aktivnosti kaspaze-3/7. V prizadevanjih za pojasnitev vloge apoptoze pri smrti celic SH-SY5Y, ki jo povzroča Glu, so uporabili specifičen zaviralec kaspaze-3/7, Ac-DEVD-CHO, za katerega je bilo ugotovljeno, da ima močan zaviralni učinek: pri 50 nM je zmanjšal aktivnost kaspaze-3,7 na 23,70 ± 1,01 odstotka ravni v zdravljenih celicah

samo z Glu in pri 0,5 uM je skoraj popolnoma blokiral aktivnost (zmanjšal jo je na normalizirano raven samo 7,22 ± 1,05 odstotka; primerljivo z ravnjo, opaženo v zdravih celicah:

7,8 ± 0,39 odstotka ), kot je prikazano na sliki 7. Uporaba pozitivnih kontrol je povzročila postopno, od odmerka odvisno zmanjšanje aktivnosti kaspaze-3,7. Zanimivo je, da je imel NEC-1 rahel učinek z največjim učinkom pri 50 uM, DFO pa močnejšo zaviralno aktivnost pri 10 uM (zmanjšanje aktivnosti na 80,5 ± 1,85 in 75,8 ± 3). .00 odstotkov ). Po drugi strani pa so le rahle, a pomembne učinke na casp-3,7 dosegli tZ pri 1 uM (89,5 ± 2,50 odstotka), cZ pri 0,1 uM (87,4 ± 1,62 odstotka) in K pri 1 uM ( 91,0 ± 2,06 odstotka ). Rezultati skupaj kažejo, da sta imeli obe pozitivni kontroli močnejšo aktivnost za zmanjševanje aktivnosti kaspaze-3/7 kot testirani CK, vendar so imeli CK učinke pri precej nižjih koncentracijah. Na splošno rezultati kažejo, da ima modulacija aktivnosti kaspaze-3/7 ključno vlogo pri močnemnevroprotektivnoaktivnost agentov, kot je DFO [58] v Glu-induciranem modelu celične smrti [79,80]. Vendar, kot je prikazano v tem razdelku, je imel tudi NEC-1nevroprotektivnoaktivnosti, kar kaže na to, da so druge vrste celične smrti morda vključene v Glu-inducirano smrt nevronom podobnih celic SH-SY5Y [63,67,81]. Indikacije, da so od kaspaze neodvisni mehanizmi vključeni v celično smrt, ki jo povzroči Glu, so bile pridobljene tudi v analizah učinkov NEC-1 [70], DFO [69] in K [18] na celice HT22.

Slika 7. Aktivnost kaspaze-3/7 v Glu-modelu oksidativne poškodbenevron-kot celice SH-SY5Y. Potroji se v najmanj štirih neodvisnih dneh. * P v primerjavi z vehiklom s 160 uM Glu, # P v primerjavi z vehiklom brez 160 uM Glu.

3. Sklepi

Če povzamemo, je naša študija pokazala, da imajo CK in njihovi metabolitinevroprotektivnodejavnosti v modelu, ki ga povzroča SALParkinsonova bolezenin Glu-inducirana oksidativna poškodba pri človeku diferenciranem SH-SY5Ynevronskicelice. Ugotovljeno je bilo, da so K3G, cZR in iPR biološko pomembninevroprotektivnodejavnosti. Poleg tega so bili aktivni CK učinkoviti pri nižjih (submikromolarnih in mikromolarnih) koncentracijah kot pozitivna kontrolna snov NAC. K3G, cZR in iPR so imeli tudi pozitivne učinke na sposobnost preživetja, citotoksičnost, oksidativni stres in aktivnost kaspaze-3,7 (razen iPR). Ortogonalne demonstracije močno kažejo, da ima aktivnost antioksidativnega stresa ključno vlogo pri zaščitnih učinkih CK v modelu celične smrti, ki ga povzroči SAL. Zaščiteni so bili samo trije presnovki v testirani skupini CK (tZ, cZ in K).nevron-podobne celice SH-SY5Y v Glu-induciranem modelu oksidativne poškodbe na podoben način kot kelator železa NEC1 in inhibitor nekroptoze DFO. Da bi potrdili njihovo obetavno aktivnost, smo preizkusili njihove učinke v ortogonalnem testu sproščanja laktat dehidrogenaze (LDH). CK so imeli zmerno, a pomembno zaščitno delovanje. To je bilo šibkejše od ustreznih aktivnosti kontrolnih snovi, vendar kljub razlikam v modulacijinevronskizdravje, so vsi trije testirani CK spodbudili močno zmanjšanje tvorbe superoksidnega radikala, podobno kot snovi pozitivne kontrole. CK so imeli primerljive učinke na oksidativni stres, ki ga povzroči Glu, v celicah SH-SY5Y kot tisti iz NEC1 in DFO, vendar so imele te spojine močnejše zaviralne učinke na aktivnost kaspaze-3/7 kot CK. Ker celična smrt, ki jo povzroča Glu, ni odvisna od poti, ki je odvisna od kaspaze, kot je prikazano v študijah učinkov DFO in NEC-1 na celice HT-22 [70], lahko CK očitno modulirajo tako kaspazno- odvisna in neodvisna celična smrt z zmanjšanjem oksidativnega stresa [18,82]. V tekočih študijah je podroben mehanizem delovanja CK in/ali njihovih mitohondrijskih učinkov nanevronskiali bodo raziskane celice astrocitov.

cistancheizkušnjezaPDinspomin

4. Materiali in metode

4.1. Kemikalije in reagenti

Citokininstandardi so bili pridobljeni pri OlChemIm (Olomouc, Češka). Calcein AM (1 mg/ml raztopina) in komplet za sproščanje LDH ter komplet za izrastke Neurite so bili kupljeni pri ThermoFisherju. Propidijev jodid, dihidroetidij, sestavine testnega pufra kaspaze- 3/7, medij DMEM/F12 1:1, fetalni goveji serum, tripsin, ATRA, salsolinol hidrobromid, mononatrijeva sol glutamata, deferoksamin, N-acetilcistein , Ac-DEVD-CHO in DMSO za celične kulture smo kupili pri Sigma Aldrich (Merck). Substrat Ac-DEVD-AMC je dobavil Enzo Life Science.

4.2. ORAC testi aktivnosti odstranjevanja radikalov

Sposobnost spojin za lovljenje prostih radikalov in vitro je bila določena s testom absorpcijske zmogljivosti kisikovih radikalov (ORAC). Na kratko, fluorescein (100 uL, 500 mM) in 25 uL raztopine testirane spojine smo dodali v 96- mikroploščo z vdolbinicami, predhodno inkubirano pri 37 °C. Nato 25 uL 250 mM 2,2<-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride (aaph)="" was="" quickly="" added,="" the="" microplate="" was="" shaken="" for="" 5="" s="" and="" red="" fluorescence="" (with="" 485="" and="" 510="" nm="" excitation="" and="" emission="" wavelengths,="" respectively)="" was="" measured="" every="" 3="" min="" over="" 90="" min="" using="" an="" infinite="" 200="" microplate="" reader="" (tecan,="" männedorf,="" switzerland).="" nauc="" (net="" area="" under="" curve)="" values="" were="" used="" to="" express="" antioxidant="" activities="" relative="" to="" that="" of="" trolox="" (a="" synthetic="" hydrophilic="" analog="" of="" α-tocopherol,="" vitamin="" e).="" substances="" with="" orac="" values="" greater="" than="" zero="" are="" deemed="" to="" actively="" trap="" free="">

4.3. SH-SY5Y celična kultura

Celična linija človeškega nevroblastoma SH-SY5Y, kupljena pri ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, ZDA), je bila gojena v Dulbeccovem modificiranem Eagle's Medium in Ham's F12 Nutrient Mixture (DMEM: F-12, 1:1). ), dopolnjen z 10 odstotki fetalnega govejega seruma (FBS) in 1 odstotkom penicilina in streptomicina pri 37 oC v navlaženem ozračju s 5 odstotki CO2. Celice smo pasirali do 20-krat, gojišča pa zamenjali dvakrat ali trikrat na teden. Gostota celic je bila nastavljena kot primerna za načrtovani test (5000, 7000, 10.000 ali 20.000 celic na vdolbino) v 96-ploščah z več jamicami v 100 uL skupnih volumnov medija za vsako poskus. Dan po setvi smo celicam dodali ATRA v 1-odstotnem mediju FBS DMEM/F12 do končne koncentracije 10 uM in z inkubacijo nadaljevali nadaljnjih 48 ur, da smo inducirali diferenciacijo, omogočili tvorbo daljših nevritov in zmanjšali širjenje.

4.4. mikroskopija

Mikrografinevron-podobne celice SH-SY5Y so bile pridobljene z uporabo DM IL LED fluorescenčnega mikroskopa (Leica Microsystems, Mannheim, Nemčija) z ustreznim vzbujevalnim filtrom za test ali namestitvijo svetlega polja z visoko zmogljivo digitalno kamero DP73 (Olympus, Tokio, Japonska). ). Ker je bilo razmerje med signalom in šumom za obarvanje zmerno, je bil kontrast rahlo prilagojen v programski opremi ImageJ (Fidži), ne da bi to vplivalo na nastalo opazovanje. Izvirne slike so vključene v dodatno gradivo.

4.5. Barvanje celične membrane (komplet za izraščanje nevrita, Invitrogen™)

Nevron-podobne celice SH-SY5Y (5000 celic na jamico), pridobljene z 48-urnim postopkom diferenciacije, smo obarvali s kompletom za izrastke Neurite (Invitrogen™) v skladu s priporočili proizvajalca z manjšimi modifikacijami. Celice smo sprali s PBS, označili z raztopino barvila za barvanje membrane, ki je priloženo kompletu (po protokolu za plošče s 96 jamicami), v PBS 20 minut pri 37 oC, ponovno sprali s PBS in jih pregledali pod fluorescenčnim mikroskopom ( z valovnimi dolžinami vzbujanja 533 oziroma 585 nm).

4.6. Zdravljenje celic

Po postopku diferenciacije smo diferenciacijski medij spremenili v 1-odstotni medij DMEM/F12, dopolnjen s preskusnimi spojinami v koncentracijah 0.1, 1 in 10 uM (s 7000 celic na vdolbinico za teste citotoksičnosti) ali skupaj s toksinom SAL pri 500 uM (s 7000–10.000 celicami na vdolbinico) ali 160 mM Glu (z 20.000 celicami na vdolbinico) za ustrezno trajanje za vrsto testa (viabilnost, celična smrt itd.). Kontrolne celice smo obdelali z medijem, ki je vseboval 0,1 odstotka DMSO.

4.7. Viabilnost celic in smrt celic

Sposobnost preživetjanevron-like SH-SY5Y celice, ki rastejo v 96-mikroploščah z vdolbinicami (s približno 7000 celic na vdolbinico) po 24 urah zdravljenja so bile ovrednotene s testom Calcein AM z manjšo modifikacijo [31]. Uporabljena raztopina Calcein AM v PBS je imela koncentracijo 0,75 uM in inkubacijski čas je bil nastavljen na 50 minut. Število živih celic v vsaki vdolbinici je bilo določeno z uporabo bralnika mikroplošč Infinite M200 Pro (Tecan, Avstrija) z valovno dolžino vzbujanja 495 oziroma 517 nm.

Celična smrtnevron-podobnih celic (SAL model: 10,000 celic na vdolbinico; Glu-model: 20,000 celic na vdolbinico) je bilo določeno s PI testom, kot so poročali Stone et al. 2003 z majhno modifikacijo [83]. Na kratko, medij modela, induciranega s SAL, je bil aspiriran in spremenjen v 1 ug/mL raztopine PI v PBS, vendar imajo celice, izpostavljene Glu-indukciji, šibkejšo adherenco, zato je bila dodana 1 mg/mL raztopina PI v PBS dajte končno koncentracijo 1 ug/mL. V obeh primerih so bile celice inkubirane nadaljnjih 15–25 minut pri sobni temperaturi, nato pa je bila fluorescenca PI izmerjena z bralnikom Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, Avstrija) s 535 oziroma 617 valovnimi dolžinami vzbujanja in emisije. Nastala fluorescenca PI, pridobljena samo s toksini, je bila nastavljena kot 100-odstotna celična smrt.

4.8. Merjenje oksidativnega stresa z dihidroetidijevim (DHE) testom

Celice smo diferencirali in obdelali, kot je opisano v prejšnjem razdelku, za indukcijo SAL (10,000 celic na vdolbino, 24 ur ali Glu-indukcijo (20,000 celic na vdolbino, 4 ure). po zdravljenju so bile celice centrifugirane pri 500 xg 330 s, nato pa je bil gojišče zamenjan (po aspiraciji) z 10 uM raztopino DHE v PBS. 96-plošče z več jamicami s celicami smo inkubirali v temi 30 minut pri sobni temperatura, potem je bila fluorescenca DHE izmerjena z bralnikom mikroplošč Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, Avstrija) z valovnimi dolžinami vzbujanja 500 in 580 nm. Dobljena fluorescenca DHE, dobljena samo s SAL ali Glu, je bila nastavljena kot 100-odstotni superoksidni radikal Ilustrativne fluorescenčne mikrofotografije celic, obarvanih z DHE, so bile pridobljene po meritvi DHE z bralnikom mikroplošč.

Rastlina cistanča ima zelo dober nevroprotektivni učinek

4.9. Merjenje aktivnosti kaspaze-3/7

Enostopenjski testi kaspaze-3/7 so bili izvedeni v skladu s predhodno objavljenim postopkom [84]. Za kulture, ki so bile izpostavljene indukciji SAL in Glu, smo reakcijske zmesi (pufer kaspaze-3,7 in komponente s celicami v 96-ploščah z več jamicami) inkubirali 2 h in 3 h pri 37 oC, oz. Aktivnost kaspaze-3/7 je bila nato izmerjena z bralnikom mikroplošč Infinite M200 Pro (Tecan, Avstrija) z valovno dolžino vzbujanja 346 oziroma 438 nm in emisije.

4.10. Statistična analiza

Poskusi so bili izvedeni v treh izvodih in ponovljeni v treh do petih (n {{0}}–5) neodvisnih dneh. Vsi podatki so izraženi kot povprečje ± SEM. Vrednosti za vse izmerjene spremenljivke so izražene kot srednje vrednosti ± SEM, ki so bile izračunane s programom Prism 8.4.3 (programska oprema GraphPad, La Jolla, CA, ZDA), ki je bil uporabljen tudi za ustvarjanje številk. Statistična analiza je bila izvedena s programskim paketom PAST (ver. 1.97) [85]. Za poskus diferenciacije je bil uporabljen Studentov t-test. Ostali poskusi so bili ovrednoteni z neparametričnim Kruskal–Wallisovim testom z Mann–Whitneyjevim post hoc testom z zaporedno Bonferronijevo korekcijo. Vrednost p < 0,05="" je="" veljala="" za="">

Dodatni materiali: izvirne slike so na voljo na spletu.

Prispevki avtorjev: Prispevki avtorjev so bili naslednji: preiskava, metodologija, validacija, analiza podatkov, GG, CWD in JG; pisanje—priprava izvirnega osnutka GG, CWD in MS; skrbništvo podatkov, pridobivanje sredstev, nadzor, pisanje—pregled in urejanje, CWD, MS in PK Vsi avtorji so prebrali in se strinjali z objavljeno različico rokopisa.

Financiranje: To delo je bilo delno finančno podprto z nepovratnimi sredstvi Interne agencije za nepovratna sredstva Univerze Palacky v Olomoucu, Češka (IGA{{0}}PrF_2020_021), Češke agencije za nepovratna sredstva ({{ 2}}S) in Evropski sklad za regionalni razvoj – projekt ENOCH (št. CZ.02.1.01/0.0/0.0/ 16_019/ 0000868) in študentska štipendija dotacijskega sklada univerze Palacky.

Izjava institucionalnega nadzornega odbora: Ni primerno.

Izjava o informiranem soglasju: Ni primerno.

Izjava o razpoložljivosti podatkov: Podatki so vsebovani v članku ali dodatnem gradivu.

Zahvala: Avtorji se zahvaljujejo Diti Jordovd, Jani Hrubešovd in Lucie Koplikovd za odlično tehnično pomoč. Poleg tega se avtorji zahvaljujejo Sees-editing Ltd., Združeno kraljestvo, za angleško urejanje rokopisa.

Navzkrižje interesov: Avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov.

Razpoložljivost vzorcev: Vzorci spojin niso na voljo pri avtorjih.