Študije 4. dela so pokazale, da ima avtofagija pomembno vlogo pri uravnavanju celičnega odlaganja LD

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

2.14. Test laktat dehidrogenaze (LDH).

V skladu z navodili proizvajalca smo celice nasadili na 96-ploščo z vdolbinicami po 5000 celic/vdolbinico in zbrali gojišče za merjenje ravni LDH s kompletom za testiranje (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). Potem je bila absorbanca vzorcev zaznana z Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) pri 450 nm.

2.15. BODIPY493/503, BODIPY 581/591 C11 in MitoTracker temno rdeče obarvanje

Žive celice smo sprali s PBS in inkubirali z 2 ug/ml BOD-IPY 493/503 (InvitrogenTM, Cat D3922) ali BODIPY 581/591 C11 (BD-C11）（2.0 µM, InvitrogenTM, Cat D3861）v PBS 15 minut pri 37 stopinjah. Za obarvanje z MitoTracker Deep Red smo žive celice inkubirali z 0,5 ug/ml MitoTracker Deep Red (InvitrogenTM, Cat M22426) v PBS 30 minut pri 37 stopinjah. Nato celice smo dvakrat sprali v PBS in 10 minut fiksirali v 3,5-odstotnem PFA, čemur je sledilo pranje in nasprotno obarvanje s Hoechst 3342 (Sigma, Cat B2261) 10 minut, preden smo jih pokrili na stekelca za slikanje.koliko cistanche vzetiSlike so bile opazovane in fotografije so bile zajete s fluorescenčno mikroskopijo (Olympus, Tokio, Japonska).

Za več informacij kliknite tukaj

2.16. Barvanje po Hoechstu in PI

Celice smo obarvali s Hoechst 33,342 (1 ul, razredčen v 500 ul PBS, Sigma, Cat B2261) in (ali) PI （0,1 ul, razredčen v 500 ul PBS, Solarbio, (cistanche spanje) CA1020) 10 minut in nato fiksiran in opazovan s fluorescenčno mikroskopijo (Olympus, Tokio, Japonska).

2.17.Pretočna citometrija

Celice smo prebavili in splaknili z D-hankom, nato pa jih obarvali z aneksinom V-FITC（5 ul, razredčenega v 500 ul PBS）/PI （0,1 ul, razredčenega v 500 ul PBS) apoptoznega kompleta (CA1020, Solarbio, Peking, Chian ) v skladu s protokolom proizvajalca. Nato smo apoptotične celice analizirali s pretočno citometrijo (guava easyCyterM 8, Millipore, ZDA). Meritve mitohondrijskih ROS in potenciala mitohondrijske membrane so bile izvedene, kot je bilo objavljeno 【12】. Celice SH-SY5Y smo obarvali z MitoSOX （2,5 μM, Invitrogen, ZDA） ali z JC1 （10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, ZDA） pri 37 stopinjah 30 minut. Po dvakratnem izpiranju s PBS smo celice nato resuspendirali v hladnem PBS, ki je vseboval 1 odstotek FBS za pretočno citometrično analizo. Podatki so bili analizirani s programsko opremo FCS Express (Guava Easy CyterM8, Millipore, Hayward, CA, ZDA).

2.18. Testi dihanja morskega konjička

Mitohondrijsko dihalno funkcijo v živih celicah SH-SY5Y smo izmerili z analizatorjem zunajceličnega toka Seahorse (XFe96) (Agi-lent, Santa Clara, ZDA) s spremembami v stopnji porabe kisika （OCR）. Celice SH-SY5Y, zasejane s 3 × 10³ celic/vdolbinico, so se pustile, da so se prilepile na plošče s celično kulturo Seahorse in dosegle približno 80-odstotno konfluentnost v času poskusa. (čaj iz cistanche) Naslednji dan so bile celice predhodno obdelane s Ka in nato izpostavljeni MPP* še 24 ur. OCR je bil odkrit v bazalnih pogojih, čemur je sledilo zaporedno dodajanje 1 μM oligomicina, 1 μM FCCP, kot tudi 1 μM rotenona in antimicina A.

Cistanche lahko izboljša imuniteto

2.19. Statistična analiza

Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SEM. Pomembnost razlike je bila določena s Studentovim t-testom, dvosmerno analizo variance ali enosmerno analizo variance (ANOVA), ki ji je sledil Tukeyjev post hoc test. Razlika je veljala za pomembno pri P<>

3. Rezultati

Rezultat1. Ka obnovi motorično disfunkcijo in poveča raven dopamina v striatumu miši modela MPTP/p PD

Da bi raziskali nevroprotektivni učinek patogeneze PD Kaon, so 4-mesečnim samcem miši C57BL/6 vbrizgali nevrotoksin MPTP, da bi vzpostavili model MPTP/p PD, in jih zdravili s Ka (slika la). Po indukciji modela sta bila za ovrednotenje motorične in vedenjske zmogljivosti miši v različnih skupinah uporabljena test z vrtljivo palico in test s palico. Kot je prikazano, se je čas delovanja rotaroda izrazito zmanjšal pri miših, zdravljenih z MPTP, in ta učinek je preprečil Ka (slika 1b). (koristi cistanche tubulosa) Ka je obnovil tudi vedenjske primanjkljaje, ki jih povzroča MPTP, kot je razvidno iz zmanjšanja časa obračanja in skupnega časa v testu s palico (sl. 1c in d), ne da bi vplival na telesno težo miši (sl. le). Poleg tega je analiza HPLC pokazala, da je bila raven dopamina v striatumu znatno znižana pri miših, ki so bile izzvane z MPTP/p, in ta raven je bila obnovljena z zdravljenjem s Ka (slika 1f). (izvleček cistanche tubulosa) Zdravljenje s Ka je tudi ublažilo MPTP/ p-inducirano zmanjšanje ravni dihidroksi-fenil ocetne kisline (DOPAC, metabolit dopamina) v striatumu (slika 1g).superman zelišča cistancheTi rezultati kažejo, da Ka obnovi motorično disfunkcijo in poveča raven dopamina v striatumu pri miših PD, ki jih povzroča MPTP.

Rezultat 2. Ka ublaži izgubo nevronov DA v SNpc miši modela MPTP/p PD

Nato smo za nadaljnjo oceno nevroprotektivnega učinka Kaon MPTP/p-inducirane nevronske okvare DA pregledali nevrone tirozin hidroksilaze (TH) v mišjem SNpc z imunskim barvanjem. Kot je prikazano na sliki 2a in b, je MPTP/p povzročil znatno zmanjšanje števila nevronov TH, kar je bilo omililo zdravljenje s Ka. Poleg tega stereološka štetja skupnih nevronov v SNpc, kot jih je opredelil Nissl

Slika 1. Zdravljenje s Ka ublaži motorično disfunkcijo in poveča raven dopamina v striatumu miši modela MPTP/p PD.

(a) Shematski diagram eksperimentalne zasnove. (cistanche tubulosa reddit) (b) Čas na palici je bil izmerjen za preskus rotarod tri zaporedne dni. (cd) Čas, potreben za obračanje (čas obračanja) in spust po palici (čas plezanja), je bil zabeležen za preizkus palice. ( e ) Telesna teža miši je bila izmerjena na koncu študije. (fg) Dopamin (DA) in dihidroksi-fenil ocetna kislina (DOPAC) v striatumu sta bila analizirana s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti. Podatki so izraženi kot povprečje±SEM.n=9-10 za vsako skupino v (b,c,d);n=6-8 za vsako skupino v (f,g).ns, ni pomembno,* p<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,kaempferol.="" staining,="" verified="" that="" the="" loss="" of="" th+="" cells="" reflected="" cellular="" death="" but="" not="" the="" downregulation="" of="" th="" expression="" and="" showed="" that="" ka="" treatment="" restored="" the="" decrease="" in="" the="" number="" of="" nissl-positive="" neurons="" in="" the="" snpc="" of="" mptp-treated="" mice="" from="" 43.3%="" to="" 25.4%="" (fig.="" 2c="" and="" d).in="" addition,="">koristi bioflavonoidovKa je znatno izboljšal zmanjšanje izražanja proteina TH in DAT, ki ga povzroča MPTP, kot je bilo izmerjeno z Western blottingom (sl. 2e-g). Ti dokazi potrjujejo nevroprotektivni učinek Kaona v mišjem modelu PD.

Rezultat 3. Ka zmanjša kopičenje vakuol LD in oksidativni stres v SNpc miši, zdravljenih z MPTP/p

Vse več dokazov je pokazalo vpletenost LD-jev v NDD [10], naše prejšnje delo pa je dosledno odkrivalo povečane LD-je v SNpc MPTP-induciranih miši PD [12]. LD-je je mogoče zlahka identificirati in kažejo okrogle strukture z nizko gostoto s homogenimi amorfne vsebine [28]. Običajno se lahko LD razgradijo z avtofagijo, da se prepreči kopičenje [29].kupi cistancheDa bi raziskali, ali bi Ka lahko reguliral LD ​​pri PD, smo kopičenje LD analizirali s transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM) v SNpc kontrolnih, MPTP/p in MPTP/p ＋ Ka miši. Kot je prikazano v našem prejšnjem delu [12], sta bila število in velikost LD

povečali pri miših MPTP/p v primerjavi s kontrolami, zdravljenimi s fiziološko raztopino (sl. 3a in b), in so bili znatno zmanjšani pri miših, zdravljenih s Ka (sl. 3c-e). Poleg tega so pri miših, zdravljenih s Ka, LD pogosteje opazili tudi v bližini, zaprti v ali razgrajeni z avtolizosomi, ki so bili opredeljeni kot zrnca lipofuscina z elektronsko gostoto. Nadaljnje histološko obarvanje nevronov TH z BODIPY, barvilom, ki specifično označuje nevtralne lipide in se običajno uporablja za odkrivanje LD [30], je pokazalo, da sta bila tako število kot velikost BODIPY plus LD v SNpc višja pri miših PD kot pri kontrolah, in so se znatno zmanjšale z zdravljenjem s Ka (sl. 3f-h).

Če LD-jev ni mogoče razgraditi pravočasno, so lahko nakopičeni LD-ji podvrženi peroksidaciji in prispevajo k mitohondrijskemu ROS-posredovanemu stresu [4],razdaljaki poveča nevrotoksičnost in napredovanje bolezni. Zato smo nadalje preučili ekspresijske profile genov, povezanih z zaščito pred toksičnostjo prostih FA (Gpx8), nevtralizirajočimi oksidativnimi vrstami, superoksidnimi radikali (Sod3) in vodikovim peroksidom (Cat) ter presnovo FA (Acsbg1 in Dbi), kot je navedeno [31]. , vsi pa so bili izrazito zmanjšani v SNpc miši, zdravljenih z MPTP, v primerjavi s kontrolami, in ti učinki so bili izboljšani pri miših PD, zdravljenih s Ka (slika 3i). Podobno je MPTP/p povečal tudi ravni izražanja mRNA

Slika 2. Ka izboljša izgubo nevronov DA v SNpc miši modela MPTP/p PD.

(ab) Mikrofotografije nevronov, pozitivnih na tirozin hidroksilazo(TH) (a) in stereološko število TH-pozitivnih nevronov v substantia nigra pars compacta (SNpc) (b). Lestvice so navedene. (cd) Mikrofotografije krezil vijolično pozitivnih celic (c) in stereološka štetja krezil vijolično pozitivnih celic v SNpc (d). Lestvica, 120 um. (npr.) Western blot analiza ekspresije proteina TH in DAT v SNpc (e) in kvantitativna analiza (f,g). Kvantificirani podatki se normalizirajo na kontrolno skupino s fiziološko raztopino. Podatki so izraženi kot povprečje ± SEM.*P<><0.01, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.n="4-5" for="" each="" group.="" ve,="" vehicle,="" ka,="" kaempferol;="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydroloyridine..="" (for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="" article.="" of="" nadph="" oxidase="" subunits="" such="" as="" nox1,="" nox2,="" and="" nox4="" in="" the="" snpc="" of="" mptp/p="" mice,="" which="" were="" further="" blunted="" by="" ka="" treatment="" (fig.="" 3j).="" taken="" together,="" these="" data="" suggest="" that="" ka="" alleviates="" mptp/p-induced="" ld="" accumulation,="" peroxidation,="" and="" ros-mediated="">

Rezultat 4. Ka ščiti celice SH-SY5Y pred apoptozo, ki jo povzroči MPP plus

MPP, aktivni metabolit MPTP, zavira encime mitohondrijskega kompleksa in povzroči celično smrt, ki je neposredno povezana s PD [32]. Nato smo raziskali, ali bi Ka lahko preprečil MPPt-inducirano nevronsko apoptozo in vitro. Kot je prikazano na sliki 4a in b, je MPPt (40 uM, 24 h) povzročil sproščanje LDH iz celic SH-SY5Y, Ka (30 in 60 uM) pa je znatno oslabil sproščanje LDH, ne da bi vplival na preživetje celic (slika 4a). Ker je Ka povzročil znaten zaščitni učinek pri koncentraciji 30 μM （sl. 4b), smo to koncentracijo uporabili v naslednjih poskusih. Rezultati barvanja Hoechst/PI so tudi pokazali, da je Ka znatno zmanjšal odstotek celic z MPPt-inducirano kondenzacijo kromatina (sliki 4c in d) in celično apoptozo, kar dokazujeta povečana intenzivnost fluorescence Hoechst (slika 4c) in odstotek Celice, obarvane s Hoechst/PI (Hoechst plus /PI') (slika 4e). Kot je odkrila pretočna citometrija, je MPP plus induciral celično apoptozo, kar dokazuje povečan odstotek celic, obarvanih z aneksinom V (AV /PI in AV plus /PI plus), zaščiten s Ka (sl. 4f in g). Poleg tega je Ka opazno obrnil spremembe, ki jih povzroči MPP, v ekspresiji beljakovin, povezanih z apoptozo, kar dokazuje zvišanje regulacije Bcl-2, znižanje regulacije Bax (slika 4hi-j) in zmanjšano cepitev kaspaze-3 (Slika 4h, k). Ti podatki kažejo, da lahko Ka odpravi škodljive učinke MPPt na preživetje celic.

Rezultat 5. Ka zavira kopičenje LD, ki ga povzroči MPPt, in peroksidacijo lipidov, ki posredujeta mitohondrijsko poškodbo v celicah SH-SY5Y

Nedavne študije so pokazale, da lahko nepričakovano kopičenje LD povzroči povečan stres, ki ga povzroča peroksidacija lipidov, in pospeši mitohondrijsko disfunkcijo, ki spodbuja nevrodegeneracijo [10]. Naše prejšnje delo je tudi pokazalo, da so bili povečani LD v SNpc povezani s patologijo PD pri miših [12]. Da bi raziskali, ali je bil zaščitni učinek Ka povezan s kopičenjem LD in vitro, smo najprej izvedli LD-specifično obarvanje v celicah SH-SY5Y z uporabo BODIPY 493/503 in opazili povečano odlaganje LD (povečane ravni nevtralnih lipidov)

Rezultat 6. Ka spodbuja avtofagijo in zmanjšuje proizvodnjo mtROS v celicah SH-SY5Y, obdelanih z MPP plus

Običajno se LD dostavijo v lizosome preko avtofagije in se lahko razgradijo na FA, da se prepreči peroksidacija. Vendar pa dokazi kažejo, da je avtofagija oslabljena, kar igra ključno vlogo pri PD [2]. Kadar avtofagija vključuje porcioniranje LD, ki se razgradijo v lizosomih (slika 6a), se postopek posebej imenuje lipofagija [2]. Da bi raziskali, ali je avtofagija vključena v nevroprotektivni učinek Ka, smo pregledali ravni proteinov, povezanih z avtofagijo. Kot je prikazano na slikah 6b-d, je bila v kultiviranih celicah SH-SY5Y raven proteinske lahke verige 3 (LC3)-II, povezane z mikrotubulami, izrazito zmanjšana, medtem ko je bila ekspresija p62 izrazito povečana v celicah, obdelanih z MPP plus, kot je bilo izmerjeno z imunoblotingom, in ta učinek je znatno obrnil Ka. Nadalje smo pregledali spremembe v avtofagiji z imunskim barvanjem za LC3. Da bi omogočili kopičenje avtofagosomov v celicah, smo dodali bafilomicin, da preprečimo fuzijo avtofagosomov z lizosomi. Kot je prikazano, so v celicah, obdelanih z MPP*, odkrili povečano število LC3b puncta, kar kaže na oslabljeno avtofagično razgradnjo, ta učinek pa je tudi obrnil Ka (sliki 6e in f). Ti rezultati kažejo, da se LD v celicah SH-SY5Y mobilizirajo z avtofagijo za morebitno odstranitev in da lahko Ka spodbuja avtofagijo za zmanjšanje kopičenja oksidiranih lipidov. Povečana peroksidacija lipidov lahko poslabša mitohondrijsko poškodbo s povečanjem mitohondrijskega oksidativnega stresa [4]. Poleg tega je zdravljenje s Ka znatno zmanjšalo robustno generiranje mtROS, kot je bilo ugotovljeno z obarvanjem z MitoSOX (sl. 6g in h), in zmanjšalo število disfunkcionalnih mitohondrijev, kot je bilo ugotovljeno z mitohondrijsko specifičnimi oznakami za razlikovanje med dihanjem (MitoTracker temno rdeča) in skupnim ( MitoTracker zelena) mitohondrije (sliki 6i in j). Poleg tega smo za neposreden vpogled v mitohondrijske spremembe dodatno zaznali stopnjo porabe kisika (OCR) z analizatorjem Seahorse XF. Kot je prikazano na sliki 6k, je bilo dihanje mitohondrijev zmanjšano v celicah, obdelanih z MPPt, medtem ko zdravljenje s Ka očitno obrne to škodo, ki jo povzroča MPP plus (slika 6k).

Rezultat7. Inhibicija avtofagije obrne zaviralni učinek kopičenja Kaon LD, mitohondrijske disfunkcije in poškodbe nevronov DA in vitro

Da bi preverili, ali je avtofagija eden od glavnih mehanizmov, s katerimi Ka posreduje nevroprotekciji DA, je bil uporabljen zaviralec avtofagije 3-MA. Ugotovili smo, da so zaviralni učinki Ka na poškodbe, ki jih povzroča MPP#, vključno z zmanjšanim kopičenjem LD (sl. 7a in b), zmanjšano proizvodnjo mtROS (sl. 7c in d) in ublažili mitohondrijsko disfunkcijo (sl. 7e in f) v SH-SY5Y celice, je znatno blokiral 3-MA. Ker sta oksidacija LD in mitohondrijska disfunkcija tesno povezani z nevronsko smrtjo DA, smo nato pregledali primarno kultivirane nevrone DA. Gojene nevrone mezencefalona TH plus smo obdelali s Ka in/ali MPPf ter kvantificirali število in dolžino TH plus nevronskih procesov z imunskim barvanjem. Morfološka analiza je pokazala, da sta bila število in dolžina nevronskih procesov izrazito zmanjšana z MPP plus in zaščitena s Ka, to zaščito pa je nadalje obrnil 3-MA (sl. 7g-i). Ti podatki kažejo, da Ka ublaži poškodbe nevronov DA s spodbujanjem avtofagije.

Rezultat 8. Utišanje Atg5 je odpravilo Ka-posredovano preprečevanje izgube nevronov in vivo

Za nadaljnjo potrditev, da Ka ščiti pred MPTP/p-inducirano TH in izgubo nevronov na način, ki je odvisen od avtofagije, smo utišali Atg5 z mikroinjiciranjem adeno-povezanega virusa (AAV), ki izraža predhodno označeno shRNA proti Atg5 v dvostranski mezencefalon (slika .8a), kot je opisano prej [25]. V preliminarnih poskusih smo opazili, da je transfekcija Atg5 shRNA za 2 tedna dosegla zadostno ekspresijo GFP v TH plus nevronih (sl. 8b) in zavirala ekspresijo ATG5 v SNpc injiciranih miši (sl. 8c). Ugotovili smo, da je knockdown Atg5- obrnil nevroprotektivni učinek Ka, kar dokazuje povečana ekspresija beljakovin TH (sl. 8d in e) in povečano število TH plus nevronov (sl. 8f in g). Ti podatki nadalje podpirajo prispevek avtofagije k zaščitnemu učinku Ka pri miših PD. Na koncu smo potrdili, da Ka ščiti pred MPTP/p-inducirano poškodbo z zmanjšanjem oksidacije LD in mitohondrijske disfunkcije s spodbujanjem avtofagije.

4. Razprava

Ta študija je pokazala, da je naravna majhna molekula Ka ključni dejavnik, s katerim lahko avtofagično signaliziranje zavira lipidno oksidativno toksičnost. Naši rezultati so pokazali, da je pot avtofagije ključna regulativna zanka, skozi katero Ka ublaži peroksidacijo LD in posledično poškodbo mitohondrijev, in se osredotočili na vlogo toksičnosti LD, ki je regulirana z avtofagijo, pri lajšanju poškodb mitohondrijev, medtem ko preprečuje nevrodegeneracijo zaradi čezmernega oksidativnega stresa (sl. 9).

LD so znotrajcelična mesta za shranjevanje nevtralnih lipidov [5] in so ključnega pomena za metabolizem lipidov in energijsko homeostazo, medtem ko je disfunkcija LD povezana s številnimi boleznimi [16]. Kopičenje dokazov kaže, da so vloge LD v biologiji in patologiji bistveno širše, kot se je prej mislilo. V CŽS so dokazi pokazali, da so povečane LD v nevronih in gliji vpletene v nevrodegenerativno patologijo [10,36]. Podrobneje so LD odkrili tako v aksonih nevronov Aplysia, gojenih in vitro [37] kot v možganskih delih iz Modeli Huntingtonove bolezni [38]. Poleg tega je bilo dokazano, da so nevroni še posebej občutljivi na toksičnost lipidov in kopičenje LD, ki jih ni mogoče odstraniti pravočasno, vodi do pospešene peroksidacije LD in lahko povzroči nevrodegeneracijo [17].

Kopičenje lipidov v hiperaktivnih nevronih ni strupeno le zaradi dovzetnosti teh lipidov za peroksidacijo. Poleg tega lahko vsebina presežnih LD vstopi v neoksidativne presnovne poti, kar sproži čezmerno proizvodnjo ceramida, ki je toksičen za celice [39]. Nedavne študije so tudi pokazale, da se v celicah z okvarjenimi LD FA lahko pretvorijo v acilkarnitine, ki nato povzročijo mitohondrijsko disfunkcijo in proizvodnjo ROS [40]. Ti procesi bodo verjetno imeli specifične in globoke posledice v hiperaktivnih nevronih, ker disfunkcionalni mitohondriji ogrožajo zmogljivost za porabo FA, proizvodnja mtROS pa nadalje povzroča membransko peroksidacijo lipidov.

Zato mora biti homeostaza LD dobro nadzorovana v nevronih, kar je ključnega pomena za izogibanje toksičnosti in končno ohranjanje zdravja možganov. V tej študiji smo ugotovili, da majhna naravna molekula Ka zavira nevronsko toksičnost LD, ki se kaže kot povečano kopičenje LD, povišana peroksidacija lipidov in povečana ekspresija genov, povezana s toksičnostjo lipidov, v celicah SH-SY5Y, prizadetih z MPP#. Še pomembneje pa je, da smo tudi pokazali, da zdravljenje s Ka zmanjša 45]. V tej študiji smo opazili okvarjeno avtofagijo/lipofagijo v nevronskih celicah, poškodovanih z MPPt, vključno z znižanimi ravnmi LC3-II in povišanim izražanjem p62 ter povečano število LC3B puncta, odloženih v celicah. Okvarjena lipofagija v poškodovanih celicah SH-SY5Y je bila obrnjena z zdravljenjem s Ka. Posledično je Ka zmanjšal kopičenje oksidiranih LD, poškodovanih mitohondrijev in nastanek mtROS v celicah SH-SY5Y, zdravljenih z MPP#. Pomembno je, da je inhibicija avtofagije s 3-MA odpravila Ka-posredovano eliminacijo oksidiranih LD in poškodovanih mitohondrijev ter ublažitev poškodbe nevrona DA in vitro. Poleg tega je inhibicija avtofagije s knockdownom Atg5 in vivo obrnila zaščitne učinke nevronske degeneracije Kaon DA v mišjem modelu PD, ki ga povzroči MPTP. Te ugotovitve skupaj kažejo, da Ka zavira poškodbe mitohondrijev, povezane s toksičnostjo LD, s spodbujanjem avtofagije v eksperimentalnem modelu PD.

Kopiči se dokazi, ki kažejo, da je povečano nastajanje mtROS primarna značilnost visokoaktivnih nevronov in da so ga opazili pri številnih NDD, vključno s PD [46]. Poročila o tem, ali je ROS vzrok ali posledica nastanka LD, so protislovna [47, 48]. Zanimivo je, da so naši rezultati in vitro pokazali, da je farmakološka inhibicija peroksidacije LD z o-tokoferolom preprečila nastajanje mtROS in potencialne nenormalnosti mitohondrijske membrane ter ublažila zmanjšanje mitohondrijev, kar dokazuje obarvanje Tomm20 v celicah SH-SY5Y, kar podpira idejo, da ima peroksidacija LD pomembno vlogo. vzročna vloga pri mitohondrijski disfunkciji, ki jo povzroča MPP, in nastajanju mtROS. Vendar pa je možno, da povišan ROS na začetku pospeši tvorbo LD, nato pa LD povzročijo nadaljnjo tvorbo ROS in poslabšajo znotrajcelične in mitohondrijske ravni ROS.

V tej študiji smo pokazali, da so miši s PD, ki jih povzroča MPTP, imele visoko raven kopičenja LD, ki jo je spremljala povečana izguba nevronov DA, pospešen stres, ki ga povzroča ROS, in vedenjski primanjkljaji. Zdravljenje s Ka je preprečilo toksičnost LD in vitro in izboljšalo izgubo nevronov DA in vedenjske pomanjkljivosti v modelu miši PD, ti učinki pa so bili odvisni od avtofagije. Zato je razumno sklepati, da Ka spodbuja avtofagijo in ta okrepljena avtofagija zmanjša kopičenje oksidiranega LD, zmanjša proizvodnjo mtROS in ublaži mitohondrijsko poškodbo v nevronih DA, kar prispeva k zaviranju toksičnosti LD, s čimer se zmanjša patologija PD (slika 9).

financiranje

Ta raziskava je bila podprta z donacijami Nacionalne naravoslovne fundacije Kitajske (št. 81903587), projekta, ki ga financira Kitajska podoktorska znanstvena fundacija (št. 2019M661807), Naravoslovne fundacije province Jiangsu (št. BK20190120) in Odprti projekt kitajske prvorazredne discipline Materia Medica Univerze kitajske medicine v Nanjingu (št. 2020YLXK006) in veliki projekt inovacije zdravil (št. 2018ZX09711001-003-007).

Ta članek je izvleček iz Redox Biology 41 (2021) 101911