Del Ⅰ: Feniletanoidni glikozidi Cistanche Tubulosa inducirajo apoptozo celic hepatocelularnega karcinoma po poteh, ki so odvisne od mitohondrijev in MAPK, ter izboljšajo protitumorski učinek s kombinacijo s cisplatinom

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Pengfei Yuan, Changshuang Fu, Yi Yang, Aipire Adila, Fangfang Zhou, Xianxian Wei, Weilan Zhang, Jie Lv, Yijie Li, Lijie Xia, Jinyao Li

Povzetek

Cistanche tubulosaje vrsta kitajskega zeliščnega zdravila in izvaja različne biološke funkcije. Prejšnje študije so to dokazaleFeniletanoidni glikozidi Cistanche tubulosa (CTPG)kažejo protitumorske učinke na različne tumorske celice. Vendar so protitumorski učinki CTPG na celice HepG2 in BEL-7404 hepatocelularnega karcinoma (HCC) še vedno nedosegljivi. Naša študija je pokazala, da je CTPG znatno zaviral rast celic HepG2 in BEL-7404 z indukcijo zaustavitve celičnega cikla in apoptoze, kar je bilo povezano z aktivacijo poti MAPK, za katere je značilna povečana fosforilacija p38, JNK, in ERK1/2 in od mitohondrijev odvisna pot, za katero je značilno zmanjšanje potenciala mitohondrijske membrane. Sproščanje citokroma c in cepitev kaspaze-3, -7, -9 in PARP sta bila nato povečana z zdravljenjem s CTPG. Poleg tega je CTPG znatno zaviral migracijo HepG2 z zmanjšanjem ravni matrične metaloproteinaze-2 in vaskularnih endotelijskih rastnih faktorjev. Zanimivo je, da CTPG ni le povečal proliferacije splenocitov, ampak tudi zmanjšal apoptozo splenocitov, ki jo povzroča cisplatin. Pri mišjem modelu tumorja H22 je CTPG v kombinaciji s cisplatinom dodatno zaviral rast celic H22 in zmanjšal stranske učinke cisplatina. Skupaj je CTPG zaviral rast HCC z neposrednim protitumorskim učinkom in posrednim učinkom krepitve imunskega sistema ter izboljšal protitumorsko učinkovitost cisplatina.

Ključne besede

Cistanche tubulosafeniletanoidni glikozidi, apoptoza, MAPK pot, od mitohondrijev odvisna pot, cisplatin, imunska okrepitev.

Uvod

Leta 2018 naj bi bil rak na jetrih šesti najpogosteje diagnosticiran rak in četrti vodilni vzrok smrti zaradi raka po vsem svetu, s približno 841 000 novimi primeri in 782 000 smrtnimi primeri letno v jugovzhodni Aziji (Mongolija, Kambodža in Vietnam). .1 Na Kitajskem je bil leta 2015 rak jeter tretji najpogostejši vzrok smrti zaradi raka.2 Več kot 90 odstotkov primarnih rakov jeter predstavlja hepatocelularni karcinom (HCC) po vsem svetu. Trenutno so glavne metode zdravljenja HCC hepatektomija, presaditev jeter in perkutana ablacija. Na žalost so ta zdravljenja učinkovita pri 30 odstotkih bolnikov z zgodnjo diagnozo raka na jetrih, medtem ko se morajo bolniki z diagnozo napredovalega raka na jetrih (kar predstavlja 40 odstotkov) zanašati na paliativno zdravljenje za podaljšanje časa preživetja.3,4 Sorafenib v kombinaciji z jetrnimi arterijska kemoembolija je pomembna in pogosta paliativna terapija za večino bolnikov z napredovalim HCC v azijsko-pacifiški regiji.5 Sorafenib, ki ga je leta 2006 odobrila FDA za zdravljenje napredovalega raka jeter, je multipli kinazni zaviralec, ki zavira proliferacijo tumorskih celic in vaskularno proizvodnjo in spodbuja apoptozo tumorskih celic. Sorafenib bistveno podaljša čas preživetja bolnika za 3 do 5 mesecev, vendar ima resne stranske učinke in je tesno povezan s pojavom odpornosti na zdravila.6 Zato je nujno treba razviti nova zdravila ali strategije za HCC.

Tradicionalna kitajska medicina (TCM) sama ali v kombinaciji z drugimi strategijami je bila uporabljena za zdravljenje HCC in je pokazala klinične koristi, vključno s podaljšanim časom preživetja, izboljšano kakovostjo življenja, zmanjšanimi neželenimi učinki in tako naprej.7,8Cistancheje TCM, ki vsebuje feniletanoidne glikozide (PhG), iridoide, lignin in polisaharide, ki ima različne biološke funkcije, kot so antioksidacijska, protivnetna, proti staranju, krepitev spomina in krepitev imunskega sistema.9 PhG veljajo za glavne aktivne sestavineCistanche, in imajo več funkcij, vključno z antioksidacijo, proti vnetjem, proti apoptozi, hepatoprotekcijo in nevroprotekcijo.10-12 Naša skupina je poročala, daFeniletanoidni glikozidi Cistanche tubulosa(CTPG) bi lahko zaviral rast celic melanoma B16-F10, celic karcinoma požiralnika Eca-109 in celic HCC H22 prek zunanjih ali notranjih signalnih poti in vitro ali in vivo; poleg tega je imel CTPG imunostimulacijski učinek.13-15

V tej študiji smo raziskali protitumorski učinek in mehanizem CTPG na celice HepG2 in BEL-7404 in vitro, analizirali imunomodulatorno delovanje CTPG in vitro in in vivo ter nadalje ovrednotili terapevtski učinek CTPG v kombinaciji s kemoterapijo zdravilo cisplatin na HCC H22 tumorskih miših in vivo. Ugotovili smo, da lahko CTPG zavira rast celic HepG2 in BEL-7404 prek mitohondrijsko odvisne apoptoze in signalne poti MAPK. CTPG je znatno zaviral migracijo celic HepG2 z zmanjšanjem ravni matrične metaloproteinaze-2 (MMP-2) ​​in vaskularnega endotelijskega rastnega faktorja (VEGF). Poleg tega je CTPG spodbujal proliferacijo in aktivacijo imunskih celic ter okrepil imunost miši. Pomembno je, da lahko CTPG v kombinaciji s cisplatinom dodatno zavira rast celic H22 in vivo in zmanjša stranske učinke cisplatina.

Materiali in metode

Živali

Približno 6 do 8 tednov stari samci miši BALB/c, Kunming in samice miši C57BL/6 so bili kupljeni pri Animal Laboratory Center, Xinjiang Medical University (Urumqi, Xinjiang, Kitajska) in nastanjeni v živalskem objektu Univerze Xinjiang pri sobni temperaturi (RT) 25±3 stopinje in 12/12 ur svetlo-temno obdobje.

Celične linije in celične kulture

Mišje celice H22 so bile kupljene pri Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Kitajska), človeške celice HCC HepG2 in BEL-7404 pa so bile pridobljene iz Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering Univerza Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, Kitajska) in gojeni v gojišču RPMI 1640 (Gibco, ZDA) ali Dulbeccovem modificiranem Eagleovem gojišču (DMEM) (Gibco), ki vsebuje 10 odstotkov toplotno inaktiviranega fetalnega govejega seruma (MRC, Kitajska), 1 odstotek L -glutamin (100 mM), 100 U/mL penicilina in 100 ug/mL streptomicina pri 37 stopinjah v vlažnem ozračju s 5 odstotki CO2.

Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC)

Glavne spojine CTPG (Upbio Tech Co., Ltd., Šanghaj, Kitajska) so bile kvalificirane in kvantificirane s HPLC, kot smo že poročali.13 Uporabljena je bila kolona ZORBAX SB-C18 (250×4,6 mm; 5 μm). mobilna faza pa je bila sestavljena iz 0,2-odstotne raztopine mravljinčne kisline in metanola z gradientom od 23 do 31 odstotkov. Vbrizgali smo skupno 10 μL vzorca in ga detektirali pri 330 nm. Za analizo komponent CTPG smo uporabili standarda ehinakozid in akteozid (Yuanye, Šanghaj, Kitajska).

Analiza sposobnosti preživetja celic

Protitumorske učinke CTPG na celice HepG2 in BEL-7404 so ocenili z uporabo MTT (3-(4, 5-dimetil-2-tiazolil)-2, {{7 }}difenil-2-H-tetrazolijev bromid). Celice HepG2 in BEL-7404 smo nasadili na 96-plošče z vdolbinicami (5 × 104 celic/vdolbinico) in obdelali z 0, 200, 400 oziroma 600 ug/mL CTPG 24 oziroma 48 ur po 24 urah inkubacije pri 37 stopinjah. Kot pozitivno kontrolo smo uporabili približno 35 ug/ml cisplatina (Yuanye). Nato smo v vsako vdolbino dodali 100 μL MTT (0,5 mg/mL, razredčeno z medijem brez medija FBS) in gojili 3 ure pri 37 stopinjah in 5 odstotkih CO2. Po inkubaciji smo plošče centrifugirali pri 1200 obratih na minuto 7 minut, medij odstranili in v vsako vdolbino dodali 200 ug/mL DMSO, da smo raztopili nastale kristale formazana. Vrednosti OD490 so bile izmerjene z 96-bralnikom mikroplošč (Bio-Rad Laboratories, CA, ZDA). Za ovrednotenje učinkov CTPG na splenocite smo celice izolirali iz miši C57BL/6 in jih nasadili v 96-plošče z vdolbinicami z gostoto 1 × 105 celic/vdolbinico. Splenocite smo zdravili z 0, 200, 400 in 600 ug/mL 24, 48 oziroma 72 ur. Viabilnost celic je bila izračunana po naslednji formuli: Viabilnost celic (odstotki)=(ODtretirana/ODnezdravljena) × 100 odstotkov.

Zaznavanje Ki-67

Odkrivanje Ki{{0}} je bilo izvedeno v skladu z našo prejšnjo študijo.16 Na kratko, celice BEL-7404 smo obdelali z različnimi koncentracijami (0, 200, 400 in 600 ug/mL) CTPG ali cisplatin (35 ug/ml). Po 24 urah smo celice pobrali in sprali s PBS, nato fiksirali in permeabilizirali s Foxp3 Staining Buffer Set (eBioscience, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Znotrajcelično obarvanje smo izvedli s FITC konjugiranim Ki-67 protitelesom (BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA) 15 minut pri RT. Vzorce smo analizirali s pretočno citometrijo (BD FACSCalibur, CA, ZDA).

Analiza celične apoptoze in celičnega cikla

Celice HepG2 in BEL-7404 so bile posejane z gostoto 2,5 × 105 celic/posodo in inkubirane pri 37 stopinjah čez noč. Celice so bile tripsinizirane in pobrane s centrifugiranjem po obdelavi z različnimi koncentracijami CTPG ali predhodno obdelane z zaviralcem kaspaze (Z-VAD-FMK) ali zaviralcem kaspaze-3 (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, Kitajska) 2 ure pred zdravljenjem s CTPG. Po 24 urah je bila apoptoza odkrita s pretočno citometrijo. Na kratko, zbrane celice smo sprali s hladnim PBS (Gibco) in resuspendirali v pufru za vezavo aneksina z 2,5 μL aneksina V-FITC in 5 μL raztopine za barvanje PI-PE (Solarbio, Peking, Kitajska), nato pa celice inkubirali pri sobni temperaturi. v temi 15 minut. Za analizo porazdelitve celičnega cikla smo celice pobrali po obdelavi s CTPG in jih 30 minut fiksirali v hladnem 70-odstotnem etanolu pri 4 stopinjah. Celice smo obarvali s PI (BD Biosciences) v temi 30 minut. Vzorce smo analizirali s pretočnim citometrom (BD FACSCalibur). Stopnje ekspresije celične apoptoze in beljakovin, povezanih s ciklom, so bile odkrite z Western blotom.

Western Blot

Western blot je bil narejen v skladu z našo prejšnjo študijo.17 HCC smo zdravili s CTPG 24 ur. Po dvakratnem izpiranju z ledeno mrzlim PBS smo vse adherentne in lebdeče celice zbrali in lizirali v liznem pufru RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) 20minuti na ledu. Po 10-minutnem centrifugiranju pri 12000 obratih na minuto pri 4 stopinjah smo določili koncentracijo beljakovin z uporabo kompleta za analizo bicinhoninske kisline (Thermo Fisher Scientific, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Enaka koncentracija proteinov je bila ločena z 12 odstotki SDS-PAGE in prenesena na PVDF membrane. Po izpiranju s pufrom PBST (PBS z 0,05 odstotki Tween-20) so bile membrane blokirane s 5 odstotki nemastnega mleka pri 37 stopinjah za 1 uro in nato inkubirane s primarnimi protitelesi (Cell Signaling Technology, MA, ZDA). ) pri ustreznih razredčitvah čez noč pri 4 stopinjah. Po 3-kratnem izpiranju s PBST je bila membrana inkubirana z ustreznimi sekundarnimi protitelesi, konjugiranimi s HRP (eBioscience), 2 uri pri 37 stopinjah. Ciljne beljakovine so bile odkrite s kompletom za testiranje ECL (Beyotime). Podatke skeniranja v sivinah je pridobil Image J.

Analiza mitohondrijskega membranskega potenciala (Δψm)

Δψm smo določili z membransko prepustnim barvilom JC-1 (Beyotime). Na kratko, celice HepG2 in BEL-7404 so bile 24 ur obdelane z različnimi koncentracijami CTPG (0, 200, 400 in 600 ug/mL). Vse celice smo zbrali in sprali s pralnim pufrom JC-1. Celice smo obarvali s fluorescenčno sondo JC-1 v skladu z navodili proizvajalca 20 minut pri sobni temperaturi. Po dvakratnem izpiranju s PBS smo vse vzorce analizirali s pretočno citometrijo (BD FACSCalibur).

Hoechst 33342 Barvanje

Barvanje s Hoechst 33342 je bilo izvedeno v skladu z našo prejšnjo študijo.16 Morfološke spremembe jeder smo pregledali z uporabo membransko prepustnega barvila, ki veže DNA, Hoechst 33342 (Beyotime). Na kratko, celice smo inokulirali v 6-ploščo z vdolbinicami pri koncentraciji 1 × 105 celic/vdolbinico v 2 ml medija. Ko so dosegli 70- do 80-odstotno sotočje, so celice 24 ur zdravili z 200, 400 in 600 ug/mL CTPG ali cisplatina. Celice smo sprali s PBS in fiksirali s 4 odstotki ledeno mrzlega paraformaldehida pri 4 stopinjah 10 minut. Po izpiranju s PBS smo celice obarvali s Hoechst 33342 pri 4 stopinjah 10 minut. Vzorce smo opazovali s fluorescenčnim invertnim mikroskopom (Nikon Eclipse Ti-E, Japonska).

Migracijski test

Migracija celic HCC je bila odkrita s testom celjenja ran. Na kratko, celice HepG2 (2×104 /vdolbinico) smo zasejali v 24-ploščo z vdolbinicami. Ko smo dosegli 80-odstotno sotočje, smo sredino vsake vdolbinice enkrat opraskali s konico 20 μL pipete. Po izpiranju s PBS smo celice obdelali s cisplatinom (35 ug/mL) ali različnimi koncentracijami (0, 200, 400 in 600 ug/mL) CTPG pri 37 stopinjah. Po 24 urah so bile slike vsakega vzorca posnete pod mikroskopom (Nikon Eclipse Ti-E). Povprečne razdalje celične migracije so bile analizirane s sliko J. Odstotek celjenja ran je bil izračunan z enačbo: celjenje ran ( odstotki )=(1−območje praske na navedeni časovni točki/območje praske pri 0 urah)×100 odstotkov. Stopnje ekspresije proteinov MMP-2 in VEGF, povezanih s celično migracijo, so bile odkrite z Western blotom.

Proliferacija in apoptoza splenocitov

Za analizo proliferacije smo splenocite izolirali iz 3 miši C57BL/6 in jih obarvali s CFSE (eBioscience). Celice, označene s CFSE, smo nacepili v 24-plošče z vdolbinicami z gostoto 2 × 106 celic v 1 ml medija na vdolbino in obdelali z različnimi koncentracijami CTPG (200, 400 in 600 ug/mL) ali v kombinaciji s 35 ug /ml cisplatina 72 ur. Analizo s pretočno citometrijo smo izvedli po barvanju s CD3-APC in CD19-PE (BD Biosciences). Za analizo apoptoze smo splenocite inokulirali v 24-plošče z vdolbinicami z gostoto 2 × 106 celic v 1 ml medija na vdolbinico in jih obdelali z različnimi koncentracijami CTPG (200, 400 in 600 ug/ml) ali kombinirali z cisplatina 24 ur. Analizo s pretočno citometrijo smo izvedli po barvanju z 2,5 μL Annexin V-FITC in 5 μL raztopine PI-PE.

Ocena varnosti in imunostimulacijske dejavnosti CTPG in vivo

Za ovrednotenje in vivo imunostimulatornih aktivnosti CTPG smo 6 do 8 tednov stare samce miši Kunming naključno razdelili v 7 skupin (5 miši/skupino). Subkutano injiciranje (sc, 200, 400 mg/kg), intraperitonealno injiciranje (ip, 200, 400 mg/kg) in intragastrično dajanje (ig, 200, 400 mg/kg) je bilo uporabljeno vsaka 2 dni, skupno 7-krat. , medtem ko kontrolna skupina ni prejela nobenega zdravljenja. Miši so tehtali vsak drugi dan in vsak dan opazovali status miši. Po zdravljenju s CTPG smo organe miši ločili in stehtali. Organske indekse smo izračunali po formuli: organski indeks=teža organa (mg)/telesna teža (g). Splenociti so bili zbrani, prešteti in obarvani z anti-CD3-APC, anti-CD19-PE, anti-CD49b FITC ali anti-CD4-APC, anti-CD{{ 22}}PE, anti-CD8-FITC (BD Biosciences). Vzorce smo odkrili s pretočno citometrijo (BD FACSCalibur).

Protitumorska učinkovitost CTPG v kombinaciji s cisplatinom pri miših s tumorjem H22

Približno 6 do 8 tednov starim samcem miši BALB/c so subkutano injicirali celice H22 (1.0 × 106 na miš v 100 μL PBS). Ko je volumen tumorja dosegel približno 60 mm3, smo miši s tumorjem naključno razdelili v 4 skupine (6 miši na skupino) in jim dali cisplatin (4 mg/kg), CTPG (400 mg/kg), cisplatin (4 mg/kg) in CTPG ( 400 mg/kg) ali brez zdravljenja (kontrolna skupina). Tumorskim mišim smo intraperitonealno injicirali CTPG 5., 7., 9., 11. oziroma 13. dan. Cisplatin smo intravensko injicirali 7. in 11. dan. Volumen tumorja in telesno maso smo merili vsak drugi dan. Volumen tumorja je bil izračunan kot sledi: Volumen tumorja (V)=a × b2 /2, pri čemer a in b predstavljata najdaljši in najkrajši premer tumorja, izmerjen s pomično kalibrom. 20. dan so bili organi in tumorji izolirani in obteženi. Splenocite smo zbrali, prešteli in obarvali z anti-CD3-APC in anti-CD19-PE ali anti-CD4-FITC in anti-CD8-APC oz. anti-CD11b-PE in anti-Gr{40}}APC ali anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC in anti-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Nato smo frekvence in število celic analizirali s pretočno citometrijo (BD FACSCalibur).

Statistična analiza

Vsi podatki so bili izraženi kot povprečje ± standardna napaka povprečja (SEM). Statistična analiza je bila izvedena z eno/dvosmerno analizo variance (ANOVA) z uporabo programske opreme Prism5.0. p<.05 was="" considered="" statistically="">

Rezultati

CTPG je zaviral proliferacijo celic HCC in vitro

Komponente CTPG so bile kvalificirane in kvantificirane s HPLC z uporabo standardov ehinakozida in akteozida (dodatna slika 1A), ki sta bili glavni sestavini feniletanoidnih glikozidov iz Cistanche. 18 Glede na največje retenzijske čase in površine vrhov je CTPG vseboval 28 odstotkov ehinakozida in 9,9 odstotka akteozida. Poleg tega je bila vsebnost polisaharidov v CTPG 34,8 odstotka po metodi fenol-žveplova kislina.19 Test MTT je pokazal, da je CTPG znatno zmanjšal sposobnost preživetja celic BEL-7404 in HepG2 na način, ki je odvisen od odmerka in časa ( Slika 1A). Dosledno je bila proliferacija celic BEL-7404 znatno zavirana z zdravljenjem s CTPG, kar je bilo analizirano z barvanjem Ki-67 (slika 1B). Učinek CTPG na proliferacijo splenocitov in vitro je bil analiziran tudi s testom MTT. Opazili smo, da je CTPG povečal proliferacijo splenocitov na način, ki je odvisen od odmerka (slika 1C).

Signalna pot protein kinaze, aktivirane z mitogenom (MAPK), ima ključno vlogo pri preživetju, diferenciaciji in odpornosti človeških rakavih celic na zdravila.20 Da bi raziskali, ali je bila signalna pot MAPK vključena v zaviralni učinek CTPG na proliferacijo, celic HCC so bile analizirane ravni fosforilacije različnih proteinov iz signalne poti MAPK v celicah HepG2 po zdravljenju s CTPG pri različnih koncentracijah in različnih časovnih točkah. Fosforilacija JNK (P-JNK) in p38 (P-p38) je bila odvisno od odmerka povečana z zdravljenjem s CTPG. Fosforilacija ERK (P-ERK) je bila znižana z zdravljenjem z 200 in 400 ug/mL CTPG, medtem ko je bila P-ERK regulirana navzgor pri zdravljenju s 600 ug/mL CTPG (slika 1D). Poleg tega so bile ravni P-JNK, P-p38 in P-ERK povečane na časovno odvisen način (slika 1D). Ti rezultati kažejo, da bi CTPG lahko zaviral proliferacijo celic HCC prek signalne poti MAPK

CTPG inducirana zaustavitev celičnega cikla HCC v fazi S

Nadalje smo analizirali, ali je CTPG zaviral proliferacijo celic HCC z indukcijo ustavitve celičnega cikla. Po zdravljenju s CTPG so opazili kopičenje celic BEL-7404 v S-fazi v odvisnosti od odmerka. Podobno je CTPG povzročil tudi zaustavitev celičnega cikla HepG2 v S-fazi in frekvence so se povečale s 40,66 odstotka v kontrolni skupini na 61,90 odstotka v skupini, zdravljeni s 600 ug/ml CTPG (slika 2A). Ciklini in od ciklina odvisne kinaze (CDK) igrajo pomembno vlogo pri nadzoru in razvoju celične delitve,21 ki so bili povezani s fazo G2/M.22 Raven ekspresije ciklina D1 je bila odvisno od odmerka zmanjšana z zdravljenjem s CTPG, vendar je pospešila G1 v Napredovanje faze S. Ravni izražanja ciklina B1, CDK1 in CDK2 so bile prav tako zmanjšane; ti proteini so bili povezani s fazo G2/M (slika 2B). Ti rezultati kažejo, da je CTPG zaviral proliferacijo celic HCC z induciranjem zaustavitve celičnega cikla.

CTPG aktivirana od mitohondrijev odvisna apoptozna pot v celicah HCC

Odkrili smo tudi, ali je CTPG sprožil apoptozo v celicah HCC, in ugotovili, da je CTPG povzročil apoptozo v celicah HepG2 in BEL-7404 na način, ki je odvisen od odmerka (slika 3A). Poleg tega sta bili ravni izražanja Bax in Bcl-2 povečani oziroma zmanjšani z zdravljenjem s CTPG na način, ki je odvisen od odmerka (slika 3B). Apoptozo celic HepG2 smo nadalje določili z barvanjem s Hoechst 33342 po zdravljenju s CTPG 24 ur. Jedrno morfologijo smo opazovali z invertnim fluorescenčnim mikroskopom. Kot je prikazano na sliki 3C, so bile kontrolne celice HepG2 homogeno obarvane, medtem ko so celice HepG2, obdelane s CTPG, pokazale kondenzacijo in fragmentacijo kromatina na način, odvisen od odmerka, kar je bilo podobno celicam HepG2, zdravljenim s cisplatinom. Ti rezultati so pokazali, da je CTPG povzročil apoptozo celic HCC.

Celovitost zunanje mitohondrijske membrane je strogo regulirana z družino Bcl-2 in zmanjšanje Δψm spodbuja sproščanje citokroma c, ki aktivira kaskado kaspaze za induciranje apoptoze. 23, 24 Ko se Δψm zmanjša, JC{{ 3}} polimer (rdeča fluorescenca) razpade na monomere (zelena fluorescenca).25 Zato je bil Δψm celic HCC odkrit z JC-1 barvanjem po 24-urnem zdravljenju s CTPG. Kot je prikazano na sliki 4A, je bila intenzivnost zelene fluorescence kanala FL-1 odvisno od odmerka povečana z zdravljenjem s CTPG, medtem ko se je intenzivnost rdeče fluorescence kanala FL-2 v obeh odvisno od odmerka zmanjšala celice BEL-7404 in HepG2. Opazovanje z obrnjenim fluorescenčnim mikroskopom je pokazalo podoben rezultat (slika 4B), kar kaže, da CTPG zmanjša Δψm celic HCC. Kasneje smo opazili, da so bile ravni citokroma c povečane v celicah BEL-7404 in HepG2 po zdravljenju s CTPG (slika 4C), kar je dodatno potrdilo zmanjšanje Δψm v celicah HCC, zdravljenih s CTPG.

Sproščanje citokroma c lahko aktivira iniciatorsko kaspazo-9, da inducira apoptozo.26 Rezultati testa Western blot so pokazali, da so ravni razcepljene kaspaze-3, -7 in{{4} } so se povečale, medtem ko se raven razcepljene kaspaze-8 ni spremenila (slika 5). Aktivirana kaspaza-3 lahko cepi encim za popravilo DNK poli (ADP-riboza) polimeraze (PARP), da prepreči popravilo DNK in kopiči poškodbe DNK.27 Opazili smo tudi navzgor regulirane ravni odcepljenega PARP. Vloga kaskade kaspaze pri apoptozi celic HCC, ki jo povzroča CTPG, je bila nadalje določena z uporabo inhibitorja kaspaze (Z-VAD-FMK) oziroma inhibitorja kaspaze -3 (Ac-DEVD-CHO). Z-VAD-FMK je pomembno obrnil apoptozo celic BEL-7404 in HepG2, inducirano s CTPG (dodatna slika 1B). Podobno je tudi Ac-DEVD-CHO pomembno obrnil apoptozo celic HepG2, inducirano s CTPG (dodatna slika 1C). Rezultati so pokazali, da je CTPG povzročil apoptozo celic HCC po poti, odvisni od mitohondrijev.

CTPG je zaviral migracijo celic HCC in vitro

Migracija rakavih celic velja za enega od kritičnih procesov pri metastazah tumorja. Da bi ugotovili, ali CTPG vpliva na migracijo celic HCC, smo gibljivost celic HepG2 ocenili s testom celjenja ran. Kot je prikazano na sliki 6A in B, je bila migracija celic HepG2 znatno zavrta z zdravljenjem s CTPG na način, ki je odvisen od odmerka. Družina MMP in VEGF imata ključno vlogo pri migraciji tumorskih celic.28 Po 24-urnem zdravljenju s CTPG so se ravni MMP-2 in VEGF znatno znižale (slika 6C), kar kaže na to, da bi lahko CTPG zaviral invazijo in metastaze HCC.

CTPG je okrepil imuniteto miši

Poročali so, da imajo polisaharidi Cistanche deserticola imunomodulatorne funkcije, vključno s pospeševanjem proliferacije limfocitov in aktiviranjem makrofagov.29 Celice T in celice B so glavni limfociti, ki posredujejo celični oziroma humoralni imunski odziv. CTPG je vseboval 34,8 odstotka vsebnosti polisaharidov. Zato smo preučili učinke CTPG na proliferacijo celic T in celic B. Kot je prikazano na dodatni sliki 2A, je CTPG znatno povečal proliferacijo celic T in celic B na način, odvisen od odmerka, tudi v prisotnosti cisplatina. Zanimivo je, da je CTPG znatno zaviral apoptozo splenocitov, ki jo je povzročil cisplatin (dodatna slika 2B), kar kaže, da bi CTPG lahko izboljšal stranske učinke cisplatina na imunski sistem miši.

Nadaljujte z branjem do Ⅱ dela...