Del 3: Z dereplikacijo vodena izolacija novih s fenilpropanoidom substituiranih diglikozidov iz Cistanche Salsa in njihova zaviralna aktivnost na proizvodnjo NO v makrofagih
Mar 04, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com
3-metilbutenilna skupina, podstruktura aglikona, je bila predlagana s korelacijami COSY H-2 s H-1a in H-1b ter korelacijami HMBC med H{{ 4}} in H-5 ter olefinski ogljiki, pri kC 120,7 (C-2) in 136,4 (C-3). Z analizo spektrov NMR in analizo spektrov HPLC kislega hidrolizata smo ugotovili dva sladkorna dela z vzorcem MS fragmentov. Njihova absolutna konfiguracija je bila določena kot D-glukoza in L-ramnoza z analizo HPLC kislega hidrolizata [17]. Ti sladkorni deli so bili definirani kot -glukoza in a-ramnoza s sklopitvenimi konstantami anomernih protonov. 1H-1H COSY spekter je pokazal zaporedne korelacije od H-13 do H-63 in od H-133 do H-633 (slika 4).
Proton glukoze s prestavljenim navzdol pri kH 4,70 (H -43) je nakazal acil-substituent na glukozi. Iz spektra HMBC je korelacija med H-43 in C-9333 potrdila položaj kofeoilnega substituenta. Korelacije HMBC med H-13 in C-1 (kC 64,5) ter med H-33 (kH 3,68) in C-133 (kC 101,2) so predlagale položaje vsakega substituenta . V skladu s tem je bila struktura 6 določena kot 3-metilbutenil-O- -L-ramnopiranozil-(1→3)-4-O-(E)-kafeoil- -D- glukoza-piranozid in imenovan cistansalzid B.
Cistansalside C (12), rjavi amorfni prašek, je imel molekulsko formulo C26H38O13 z (plus)-HR-ESI-QTOF-MS, ki je pokazala vrh pri m/z 581,2213 [M plus Na] plus (izrač. za C26H38O13Na, 581.2205). Značilen ion pri m/z 163 je nakazal, da je v strukturi obstajal kofeoilni substituent. Ioni fragmentov pri m/z 325 in m/z 471 kažejo na obstoj enote ramnoze in enote glukoze.
Primerjava NMR spektrov 12 s spektri 6 je pokazala, da sta si podobna, razen aglikonske strukture. V NMR spektrih 12 sta bila namesto dveh olefinskih ogljikov pri kC 12{{16 opažena dva parafinska ogljika pri kC 38.0 (C-2) in 24,4 (C-3). }}.7 (C-2) in 136.4 (C-3) v aglikonu 6. Zarodne metilne skupine (kH 0.88) v aglikonu 12 so bile pomaknjene navzgor glede na H-4 in H-5 (kH 1,71 in 1,63) v aglikonu 6 (tabela 2). Predlagano je bilo, da je aglikon 12 3-metil butilna skupina, kar sta potrdila 1H in COSY NMR spektra. Vrhove 3-metil butilne skupine so opazili pri 3,81 (1H, m, H-1a), 3,48 (1H, m, H-1b), 1,71 (1H, m , H-3), 1,44 (2H, m, H-2) in 0,88 (H-4, 5).
Dva sladkorna dela sta bila ponovno potrjena s HPLC analizo kislega hidrolizata in analizo NMR spektrov ter vzorcem MS fragmentov. Absolutne konfiguracije sladkorjev so bile identificirane kot D-glukoza in L-ramnoza z uporabo HPLC analize kislega hidrolizata [17]. -glukozni del in a-ramnozni del sta bila potrjena s sklopitvenimi konstantami anomernih protonov. 1H-1H COSY spekter je pokazal zaporedne korelacije od H-13 do H-53, od H-133 do H-333 in od H{{11} } v H-433 (slika 4).
Položaj substituentov je bil potrjen z analizo HMBC. V spektru HMBC so korelacije med H-13 in C-1 (kC 67,2), med H-33 (kH 3,68) in C-133 (kC 101,2) ter med Zaznali smo H-43 (kH 4,70) in C-9333 (kC 165,7). Posledično je bilo ugotovljeno, da je struktura 12 3-metil butil-OaL-ramnopiranozil-(1→3)-4-O-(E)-kafeoil- -D-glukoza-piranozid in imenovan cistansalside C.
Cistansalside D (17), amorfni rjavi prašek, je imel molekulsko formulo C31H38O14 z ESI-QTOF-MS pozitivnega načina visoke ločljivosti, ki je pokazala adukcijski ionski vrh pri m/z 657,2147 [M plus Na] plus (izrač. za C31H38O14Na, 657,2154). Fragmentni ioni, vključno z [M plus H x Aglycone x Rha x Acetyl Glc] plus ion pri m/z 147, [M plus H x Aglycone x Rha] plus ion pri m/z 351 in [M plus H x Aglycone] zaznali so tudi plus ion pri m/z 497. Značilen ion pri m/z 147 je nakazal, da je v njegovi strukturi prisoten kumaroilni substituent. Ioni fragmentov pri m/z 351 in m/z 497 kažejo na obstoj enote ramnoze in enote glukoze, substituirane z acetilom.
Cistansalside izzelišče cistanche
13C-NMR spekter je pokazal prisotnost 31 ogljikovih atomov. V spektrih 1H in HSQC sta bila opažena dva anomerna protona pri kH 4,61 (1H, m, H-13) in 4,60 (1H, s, H{{10}}). . 1H-NMR spekter je pokazal prisotnost metilne skupine pri 1,97 (3H, s, acetil-CH3), trans-olefin pri kH 7,55 (1H, d, J=15.9 Hz, H{{ 25}}) in 6,34 (1H, d, J=15.9 Hz, H-8333) in dva para-substituirana benzenova obroča pri kH 7,53 (2H, d, J=6. 9 Hz, H-3333, 5333) in 6,79 (2H, d, J=6.9 Hz, H-2333, 6333)/kH 6,98 (2H, d, J {{5) 0}.0 Hz, H-2, 6) in 6,65 (2H, d, J=8.0 Hz, H-3, 5) (tabela 2) . Iz spektra HMBC NMR so korelacije med karbonilnim ogljikom pri kc 165,5 (C-9333) in H-8333 ter med H-2333, 6333 in C-7333 (kc 145.4) predlagal (E)-kumaroilno skupino. Korelacija HMBC med vrhom metilnega protona in karbonilnim ogljikom pri kc 169,0 je potrdila prisotnost acetilne skupine.
4-hidroksifenilna skupina je bila predlagana na podlagi korelacije HMBC med H-3, 5 in kvarternimi aromatskimi ogljiki pri kC 155,6 (C-4) in 128,6 (C-1) . Hidroksilirano etilno skupino smo potrdili s signali COSY NMR pri kH 2,66 (2H, t, J=6.1 Hz, H-7), 3,90 (1H, m, H-8a ) in 3,54 (1H, m, H-8b). Korelacije HMBC med H-7 in C-1 (kC 128,6) ter C-2, 6 (kC 129,7) kažejo na 4-hidroksifeniletilno skupino kot aglikonsko podstrukturo.
Dva sladkorna dela, predlagana iz vzorca MS fragmentov, sta bila ponovno potrjena s HPLC analizo kislega hidrolizata in NMR spektrom. D-glukozo in L-ramnozo smo pojasnili s HPLC analizo kislega hidrolizata [17]. -glukozni del in a-ramnozni del sta bila ugotovljena s sklopitvenimi konstantami anomernih protonov. 1H-1H COSY spekter je pokazal zaporedne korelacije od H-13 do H-53 in od H-133 do H-633 (slika 4).
Iz 1H-NMR spektra je premik navzdol za H-23 (kH 4,69) in H-43 (kH 4,80) nakazal acilno substituiran položaj na glukozi. Povezave med glukozo in dvema acilnima skupinama so bile potrjene s korelacijami HMBC med H-43 (kH 4,80) in C-9333 ter med H-23 in karbonilnim ogljikom acetilne skupine (kC 169,0). ). Položaja aglikona in ramnoze sta bila podana s korelacijami HMBC med H-33 (kH 3,95) in C-1333 ter med H-8 in C-13. V skladu s tem je bila struktura 17 označena kot 4-hidroksifeniletil-2-O-acetil-O- -L-ramnopiranozil-(1→3)-4-O-(E)- kumaroil- -D-glukopiranozid in imenovan cistansalzid D.
Cistansalside E (18) smo izolirali kot amorfen rjav prah. S podatki 13C-NMR in vrhom visoke ločljivosti ESI-QTOF-MS pozitivnega načina pri m/z 657,2166 [M plus Na] plus (izračunano za C31H38O14Na, 657,2154) je bilo ugotovljeno, da je njegova molekulska formula C31H38O14. Poleg tega so bili odkriti tudi fragmentni ioni, vključno s kofeoilnim ionom pri m/z 163, [M plus H x Aglycone x Rha] plus ion pri m/z 367 in [M plus H x Aglycone]ion pri m/z 513. Ioni fragmentov so nakazovali obstoj enote ramnoze in enote glukoze, substituirane z acetilom.
1H-NMR spekter je pokazal prisotnost dveh anomernih protonov pri kH 4,63 (1H, d, J=8.2 Hz, H-13) in 4,60 (1H, s, H-133 ) in dva z acilom substituirana protona glukoze pri kH 4,71 (1H, dd, J=8,9, 8,2 Hz, H-23) in 4,81 (1H, dd, J=9,7 , 9,5 Hz, H-43). Spektri 1H in HMBC kažejo na obstoj acetilne skupine pri kH 1,94 (3H, s, acetil-CH3), (E)-kafeoilnega dela pri kH 7,48 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7333), 7,02 (1H, d, J=1,6 Hz, H-2333), 6,98 (1H, dd, J=8,1, 1,6 Hz, H-6333), 6,76 (1H,d, J=8,1 Hz, H-5333) in 6,21 (1H, d, J=15,9 Hz, H{ {67}}) in monosubstituiran benzenov obroč pri kH 7,29 (2H, m, H-3, 5), 7,21 (2H, m, H-2, 6) in 7,20 (1H, m, H-4) (tabela 2). Fenilmetilna skupina, podstruktura aglikona, je bila predlagana s korelacijami HMBC med H-7 (2H, kH 2,80, m) in C-1 (kC 138,8) ter med H-7 in C -2, 6 (kC 128,9) in COSY NMR signali H-7 s H-8a (1H, kH 3,99, m) in H-8b (1H, kH 3,63, m).
Dva sladkorna dela sta bila ponovno potrjena s HPLC analizo kislega hidrolizata in analizo NMR spektrov. Absolutne konfiguracije sladkorjev so bile pojasnjene s HPLC analizo kislinskega hidrolizata, za katerega je bilo potrjeno, da sta D-glukoza in L-ramnoza [17]. -glukozni del in -ramnozni del sta bila ugotovljena s sklopitvenimi konstantami anomernih protonov. 1H-1H COSY spekter je pokazal zaporedne korelacije od H-13 do H-53, od H-133 do H-233 in od H{{11} } v H-333 (slika 4).
Iz spektra HMBC so korelacije med H{{0}} in C-8 (kC 69,4), med H-23 in karbonilnim ogljikom acetilne skupine (kC 169,1), med H-33 (kH 3,95) in C-133 (kC 102,0) ter med H-43 (kH 4,81) in C-9333 (kC 165,6) je potrdil položaj substituentov v strukturo. Zato je bilo ugotovljeno, da je struktura 18 feniletil-2-O-acetil-OaL-ramnopiranozil-(1→3)-4-O-(E)-kafeoil- -D-glukopiranozid in imenovan cistansalside E.
Večina trans-cinamoilnih substituentov je bila in vitro izomerizirana v cis-izoformo. Poročali so, da svetloba pretvori derivate trans-cimetove kisline v cis-izooblike [18,19]. Opazili so, da ravnovesje trans-cis pretvorbe cinamoilnih substituentov ohranja približno 70 odstotkov izolatov v trans-izoformi. Za olefinske protone cis oblike doseže vrhove pri približno 6,90 ppm (d, J=12~13 Hz, H-7333) in 5,80 ppm (d, J=12~13 Hz, H-8333) je bilo mogoče dodeliti v 1H-NMR spektrih, medtem ko so vrhovi pri približno 7,55 ppm (d, J=15.8 Hz, H-7333) in 6,40 ppm (d, J { {28}}.8 Hz, H-8333) so opazili za transformacijo [20]. V 1H-NMR spektru trans-cis mešanic smo opazili vrhove za dva olefinska protona (H-7333 in H-8333) v razmerju 7:3 (trans:cis). Vrhovi 13C-NMR cis oblike so bili podobni tistim pri transformaciji.
Učinkovite sestavine iz cistanhe: akteozidi
Vsi izolati so bili testirani na njihove inhibitorne učinke na LPS-inducirano proizvodnjo NO v RAW
Vsi izolati so bili testirani na njihove inhibitorne učinke na LPS-inducirano proizvodnjo NO v celicah RAW 264.7. Deksametazon je bil uporabljen kot pozitivna kontrola in njegov IC50 je bil 7.0 uM. Od testiranih spojin so spojine 5 (IC50 42.7 o 6,6 uM), 11 (IC50 37.3 o 2,2 uM), 13 (IC50 40.{{2{{ 24}}}} o 4.0 uM) in 18(IC50 27.9 o 0,8 uM) sta pokazala zmerne inhibitorne aktivnosti na inducibilno NO sintazo, medtem ko so bile druge spojine v tem testu neaktivne (IC50 vrednosti > 100 uM). Da bi preverili, ali so imele te spojine citotoksičnost, smo izmerili viabilnost celic z uporabo MTT testa. Posledično nobeden od njih ni pokazal pomembne citotoksičnosti (dodatna slika S6-1). Te štiri spojine so bile izbrane za oceno njihove inhibitorne aktivnosti proti poti NF-λB v celicah RAW 264.7, stimuliranih z LPS. Stimulacija celic RAW 264.7 z LPS je povzročila fosforilacijo I入B in NF-入B (p65) po 0,5 h inkubacije. Fosforilacija NF-入 B (p65) je bila znatno zmanjšana s predobdelavo s spojinami 11, 13 in 18, kot je prikazano z Western blot analizo (slika 5). Zato lahko spojine 11, 13 in 18 izvajajo protivnetne učinke preko inhibicije NF-入B v makrofagih.
Slika 5.Učinek štirih spojin na fosforilacijo I入B in NF-入B (p65) v celicah RAW 264.7, stimuliranih z LPS. (A) Western bloti so bili izvedeni v celicah RAW 264.7, obdelanih z LPS in vzorcem; (B, C) Imunoblot signali so bili kvantificirani s programsko opremo za denzitometrijo Molecular Analyst/PC (Bio-Rad, Richmond, CA, ZDA). Poroča se o denzitometrični analizi fosforiliranih izoform. NF- 入 B v celici RAW 264.7 je bil normaliziran na vsebnost -aktina.
3. Materiali in Metode
3.1. Splošni poskus Postopek
Optične rotacije so bile izmerjene z digitalnim polarimetrom Jasco P-2000 (Jasco, Tokio, Japonska). UV spektri so bili posneti na spektrometru Chirascan plus Circular Dichroism (Chirascan, APL, UK). IR spektri so bili posneti s spektrofotometrom Jasco FT/IR-4200. Visokoločljiva elektrosprejna ionizacijska kvadrupolna časovno-časovna masna spektrometrija (HR-ESI-qTOF-MS) je bila izvedena na Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS, opremljenem s serijo Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc. , Palo Alto, CA, ZDA), uporabljeni stolpec pa je bil stolpec Jasco SFCpak Crest C18T-5 (id 150 4.6 mm, 5 um). Za pridobivanje podatkov je bila uporabljena programska oprema MassHunter Workstation.
1D (1H in 13C) in 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) NMR spektri so bili pridobljeni z Jeol LA 300 (Jeol, Tokio, Japonska), Bruker AVANCE-400, Bruker Spektrometri AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 in Bruker AVANCE 800 HD, povezani s kriosondo (Bruker, Ettlingen, Nemčija). DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, Cistanche Andover, MA, ZDA) smo uporabili kot NMR topilo in referenčne vrhove (kH 2,50 in kC 39,5). Kolonska kromatografija (CC) je bila izvedena z uporabo Sephadex LH-20 (25–100 um; Pharmacia, Uppsala, Švedska) ali Kieselgel 60 silikagel (40–63 um, 230–400 mesh, Art. 9385; Merck, Darmstadt , Nemčija). Tankoplastno kromatografijo (TLC) smo izvedli na predhodno prevlečenih ploščah s silikagelom Kieselgel 60 F254 (Art. 5715; Merck). Pike na TLC smo zaznali z UV žarnico pri 254 nm in 365 nm (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, Francija). Srednjetlačna tekočinska kromatografija (MPLC) je bila izvedena na bliskovni koloni silicijevega dioksida RediSep 120 g (Isco, Lincoln, NE, ZDA) in silikagelu Kiesegel 60 (40–63 um, 230–400 mesh, Art. 9385; Merck) z uporabo Combiflash companion (Isco). Sistem visokotlačne tekočinske kromatografije (HPLC) je bil Gilson HPLC, opremljen s črpalko Gilson 321 in detektorjem UV.VIS 151 (Gilson, Middleton, WI, ZDA), z uporabo polpreparativnih kolon ODS (Luna 5 um C18 (2) 100 Å, notranji premer 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, ZDA; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, notranji premer 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf, Nemčija; Inno C18 stolpec 120 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Koreja). Analitični sistem RP-HPLC je bil sistem Waters 2695 Alliance z detektorjem a996 Photodiode Array (PDA) (Waters Corp, Milford, MA, ZDA), uporabljena kolona pa je bila kolona Hypersil™ BDS C18 (130 Å, id 150: 4,6). mm, 5 um, Thermo Scientific™). Mravljinčna kislina je bila kupljena pri Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Seul, Koreja). Topila stopnje HPLC so bila kupljena pri Fisher Scientific Korea Ltd. (Seul, Koreja). H2SO4, Na2CO3 in topila prvega razreda za ekstrakcijo, frakcioniranje in izolacijo so bila kupljena pri Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Seul, Koreja). L- in D-cistein metil ester hidroklorid in o-tolilizotiocianat sta bila kupljena pri Tokyo Chemical Industry (Tokio, Japonska).
3.2. Rastlina Material
Celotne rastlineCistanche salsa, ki so bili zbrani iz Shinjang Uyghur, so bili uvoženi prek Daerim Pharmaceutical Wholesale Company (Cheongju, Koreja). Identificiral jih je prof. dr. Jehyun Lee (Univerza Dongguk, Seul, Koreja). Vzorec vavčerja (SNUPH2016-03) je bil deponiran v Herbariju vrta zdravilnih rastlin, Fakultete za farmacijo, Nacionalne univerze v Seulu.
3.3. Ekstrakcija in Izolacija
Posušene cele rastlineCistanche salsa(5,7 kg) smo sesekljali in trikrat ekstrahirali z MeOH (2 0 L) pri sobni temperaturi z ultrazvočno obdelavo 99 minut. Po odstranitvi topila v vakuumu smo surovi ekstrakt (1,35 kg) suspendirali v H2O (5 L), nato porazdelili z EtOAc (5 L). Preostanek EtOAc (55,3 g) smo ločili na 16 frakcij (E01-16) s kromatografijo na silikagelu z eluiranjem s CHCl3/MeOH (50:1–0:1, sistem stopenjskega gradienta).
E08 (611,7 mg) izpostavimo srednjetlačni tekočinski kromatografiji s silikagelom (25 g) in eluiramo s CHCl3/MeOH (18:1–0:1, sistem stopenjskega gradienta) in dal 11 ulomkov (E08a-k). Iz E08g smo spojini 13 (0,7 mg) in 18 (0,6 mg) očistili z uporabo kolone Luna 5 um HPLC in izokratskega eluiranja z 28-odstotno vodno raztopino. MeCN. Čiščenje s HPLC (Hypersil GOLD, 25-odstotni vodni MeCN) E08h (138,5 mg) je dalo spojine 7 (10,6 mg), 8 (17,2 mg), 14 (13,4 mg) in 17 (4,9 mg).
E09 (1,15 g) smo nadalje očistili na koloni silicijevega dioksida-MPLC (20 g) z eluiranjem s CHCl3/MeOH (10:1–0:1, korak- gradientni sistem), da dobimo 11 podfrakcij (E09a-k). E09e (398,7 mg) smo izpostavili Sephadex LH-20 (MeOH) in dali osem podfrakcij (E09e1-8). E09e6 smo nato očistili z uporabo kolone Hypersil GOLD HPLC (22-odstotni vodni MeCN), da smo dobili spojino 11 (0,4 mg). Iz E09e7 smo spojino 5 (0,6 mg) očistili z izokratsko elucijo iz kolone Luna 5 um HPLC s 40 odstotki vodne raztopine. MeOH.
E10 (1,20 g) smo ločili na devet frakcij (E10ai) na koloni Sephadex LH-20 z eluiranjem z MeOH. Iz E10g (147,5 mg) izoliramo spojine 4 (13,4 mg), 9 (8,0 mg) in 15 (5,0 mg) z ločevanjem HPLC (Inno, 23-odstotna vodna raztopina MeCN). Frakcijo E10h (470,0 mg) smo očistili na koloni Hypersil GOLD z izokratskim eluiranjem (40-odstotni vodni MeOH), da smo dobili spojine 1 (3,8 mg), 10 (42,1 mg) in 16 (3,0 mg).
E11 (2,96 g) smo izpostavili Sephadex LH-20 z eluiranjem z MeOH, da smo dobili devet frakcij (E11a-i). E11e smo ločili s kartušo Sep-Pak C18 s postopnim eluiranjem z 10 odstotki, 20 odstotki, 30 odstotki, 50 odstotki in 100 odstotki vodne raztopine. MeOH, da dobimo sedem frakcij (E11e1-7), čemur sledi Luna 5 um HPLC (28-odstotni vodni MeCN), da dobimo spojine 3 (3,4 mg), 6 (1,4 mg) in 12 (1,2 mg).
E12 (19.0 g) smo izpostavili silicijevemu dioksidu MPLC (120 g) z uporabo sistema stopenjskega gradienta CHCl3/MeOH, da smo dobili šest frakcij (18:1–0:1). , E12a-f). E12f smo kromatografirali na koloni Sephadex LH-20 (MeOH), pri čemer smo dobili sedem frakcij (E12f1-7). Čiščenje s HPLC (Hypersil GOLD, 25-odstotni vodni MeCN) E12f7 je dalo spojino 2 (3,3 mg). Vsa topila, uporabljena za HPLC, so bila 0,05-odstotni pufer mravljinčne kisline. Skupna hitrost pretoka za HPLC in MPLC kromatografijo je bila 3 oziroma 40 ml/min.
3.4.Karakterizacija
Cistansalside A (5): rjav amorfen prah; [ |20 x 33,7 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 332 (3,18); IR (čist) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 cmx1; Podatki 1H-NMR (800 MHz) in 13C-NMR (200 MHz) glej tabelo 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 645,2146 (izrač. za C30H38O14Na, 645,2154).
Cistansalside B (6): rjav amorfen prah; [ |20 x 72,9 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 333 (3,32); IR (čisto) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1; Podatki 1H-NMR (500 MHz) in 13C-NMR (125 MHz) glej tabelo 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 579,2054 (izrač. za C26H36O13Na, 579,2048).
Cistansalside C (12): rjav amorfen prah; [ |20 x61,6 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 337 (3,25); IR (čisto) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; Podatki 1H-NMR (800 MHz) in 13C-NMR (200 MHz) glej tabelo 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 581,2213 (izrač. za C26H38O13Na, 581,2205).
Cistansalside D (17): rjav amorfen prah; [ |20 x 51,1 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 221 (3,53), 315 (3,52); IR (čist) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmx1; Podatki 1H-NMR (400 MHz) in 13C-NMR (75 MHz) glej tabelo 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 657,2147 (izrač. za C31H38O14Na, 657,2154).
Cistansalside E (18): rjav amorfen prah; [ |20 x 59,2 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 336 (3,22); IR (čist) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; Podatki 1H-NMR (800 MHz) in 13C-NMR (200 MHz) glej tabelo 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 657,2166 (izrač. za C31H38O14Na, 657,2154)
3.5.HPLC-QTOF-MS Analiza
Kromatografsko-masno spektrometrično analizo smo izvedli na sistemu LC Agilent 1260 Infinity series (Agilent Technologies, Inc., ZDA). Analitična kolona je bila kolona SFCpak Crest C18T-5 (id 15{{10}} : 4,6 mm, 5 um, Jasco, Japonska). Mobilna faza je bila sestavljena iz 0.1 odstotka (v/v) mravljinčne kisline v MeCN (A) in vodi (B) z uporabo gradientne elucije 0–35 minut (23 odstotkov A), 35–45 minut ( 23–28 odstotkov A), 45–75 minut (28 odstotkov A) in 75–80 minut (90 odstotkov A). Hitrost pretoka smo vzdrževali pri 0,3 ml/min. Absorbanco smo izmerili pri 320 nm. Pogoji vira ESI so bili naslednji: pretok sušilnega plina (N2), 10 L/min; temperatura sušilnega plina, 350 stopinj; nebulator, 30 psig; hitrost pretoka plaščnega plina, 12,0 L/min; temperatura plaščnega plina, 350 stopinj; kapilarna, 4000 V; skimmer, 60 V; osmopolni RF, 750 V; napetost fragmentorja, 180 V; pozitivni način. Sistem je deloval s programsko opremo delovne postaje Masshunter. Masno območje je bilo nastavljeno na m/z 50–1000.
3.6.Kislina Hidroliza
Spojine smo hidrolizirali z 1 N H2SO4 (100 uL), ki smo jo 2 uri segrevali z vodno kopeljo pri 90 stopinj, nato nevtralizirali z nasičeno vodno raztopino Na2CO3. Po sušenju raztopin pod tokom N2 produkte in standardne sladkorje (D-Glc, L-Glc, L-Rha) raztopimo v piridinu (100 uL), ki vsebuje L-cistein metil ester hidroklorid (0,5 mg). Vzorec L-ramnoze smo raztopili v piridinu (100 uL), ki je vseboval D-cistein metil ester hidroklorid (0,5 mg). Nato jih segrevamo 1 uro pri 60 stopinjah. Raztopine smo obdelali z 1 uL (1,11 mg) o-tolilizotiocianata in jih ponovno segrevali pri 60 stopinjah 1 uro. Vsako končno mešanico smo neposredno analizirali z analitično RP-HPLC (Hypersil™ BDS C18 kolona, 17-odstotni vodni MeCN, 0,8 ml/min, 40 min, 35 stopinj). tR vrha pri 21,9 in 40,4 min je sovpadal s tistim za tiokarbamoil tiazolidin derivat D-glukoze oziroma L-ramnoze.
3.7. Celica Kultura
Mišji makrofagi, RAW 264.7, so bili pridobljeni s Korejskega raziskovalnega inštituta za bioznanost in biotehnologijo (Daejeon, Koreja) in gojeni v gojišču RPMI, ki je vseboval 10 odstotkov fetalnega govejega seruma in 100 U/mL penicilin/streptomicin sulfata. Celice so bile inkubirane v navlaženi atmosferi s 5 odstotki CO2 pri 37 stopinjah.
3.8.Droge in kemikalije
RPMI, penicilin in streptomicin so bili kupljeni pri HyClone (Logan, UT, ZDA). Goveji serumski albumin in LPS sta bila kupljena pri Sigmi (St. Louis, MO, ZDA).
3.9. Merjenje proizvodnje NO
Koncentracijo nitrita v gojišču smo izmerili kot indikator produkcije NO po Griessovi reakciji. Celice so bile zasejane v razmerju 2:105 celic/vdolbinico v 96-plošče za kulturo vdolbinic. Po 18-urni predinkubaciji celic RAW 264.7 so bile celice predhodno obdelane s spojinami (50 uM, 10 uM, 5 uM ali 1 uM) in stimulirane z LPS (500 ng/mL) 24 h. Testne spojine, raztopljene v DMSO. Celice smo obdelali tudi z 0,05-odstotnim DMSO kot kontrolo nosilca. Celice RAW 264.7 (2: 105 celic/jamico) smo gojili v 96-ploščah z vdolbinicami z uporabo RPMI brez fenol rdečega in predhodno obdelali z vzorci 0,5 ure. Celično proizvodnjo NO smo inducirali z dodatkom 500 ng/mL končne koncentracije LPS in 24-urno inkubacijo. Po inkubaciji smo 100 uL kondicioniranega medija zmešali z enakim volumnom Griessovega reagenta in inkubirali 15 minut. Absorbanco zmesi pri 540 nm smo izmerili z bralnikom mikroplošč ELISA (Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, ZDA). Dobljene vrednosti smo primerjali s tistimi za standardne koncentracije natrijevega nitrita, raztopljenega v RPMI, in izračunali koncentracije nitrita v kondicioniranem mediju celic, obdelanih z vzorcem.
3.10.3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid (MTT) Test za sposobnost preživetja celic
Celice so bile posejane v {{0}}plošče z vdolbinicami z gostoto 5:104 celic/vdolbinico in inkubirane z medijem brez seruma v prisotnosti vzorcev. Testne spojine, raztopljene v DMSO. Celice smo obdelali tudi z 0,05-odstotnim DMSO kot kontrolo nosilca. Po 24-urni inkubaciji smo dodali 10 uL MTT (5 mg/mL v fiziološki raztopini) in inkubacijo nadaljevali nadaljnje 4 ure. Mitohondrijska sukcinat dehidrogenaza v živih celicah med inkubacijo pretvori MTT v vidne kristale formazana. Kristale formazana smo nato raztopili v dimetil sulfoksidu in izmerili absorbanco pri 540 nm z uporabo bralnika mikroplošč z encimskim imunosorbentnim testom (ELISA) (Benchmark, Bio-Rad Laboratories). Relativno sposobnost preživetja celic smo izračunali v primerjavi z absorbanco neobdelane kontrolne skupine. Vsi poskusi so bili izvedeni v treh izvodih.
3.11. Imunoblot analiza
Ekspresijo beljakovin smo ocenili z Western blottingom po standardnih postopkih. Na kratko, celice RAW264.7 smo gojili v 6{{20}} mm posodah za kulture (2: 106/mL), čemur je sledila predobdelava 50 uM spojin . Celice smo dvakrat sprali v ledeno mrzlem PBS (pH 7,4), celične pelete resuspendirali v pufru za lizo na ledu 15 minut in celične ostanke nato odstranili s centrifugiranjem. Koncentracijo beljakovin smo določili z reagentom za testiranje beljakovin Bio-Rad v skladu z navodili proizvajalca. Beljakovine (20–30 ug) smo zmešali 1:1 z 2: vzorčni pufer (20 odstotkov glicerola, 4 odstotkov SDS, 10 odstotkov 2- ME, 0,05 odstotka bromofenol modrega in 1,25 M Tris [pH 6,8]), naloženega na 8 ali 15 odstotkov SDS-PAGE gela in delovati pri 150 V 90 minut. Celične proteine smo prenesli na poliviniliden difluoridne membrane Immunoblot (Bio-Rad) s polsuhim prenosnim sistemom Bio-Rad v skladu z navodili proizvajalca. Membrane smo nato čez noč inkubirali z ustreznimi primarnimi protitelesi p-NF-入B, NF-入B, pI入B in -aktinom (Abcam, Cambridge, Združeno kraljestvo) v s Tris pufrom fiziološko raztopino, ki je vsebovala 5 odstotkov posnetega mleka in 0,1 odstotka Tween. 20. Naslednji dan smo madeže trikrat sprali s tris-pufrano fiziološko raztopino (0,1 % Tween 20) in 1 uro inkubirali s HRP-konjugiranim sekundarnim protitelesom proti IgG (razredčenim 1:2000–1). :20.000). Blote smo ponovno trikrat sprali s tris-pufrano fiziološko raztopino (0,1 odstotka Tween 20) in razvili imunoreaktivne trakove z uporabo kemiluminiscenčnega substrata ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, ZDA).
3.12. Statistična analiza
Eksperimentalni podatki so predstavljeni kot povprečje o SEM. Raven statistične pomembnosti je bila določena z analizo variance (ANOVA), ki ji je sledil Dunnettov t-test za več primerjav.p Vrednosti, manjše od 0,05, so veljale za pomembne.
Izvleček Cistanche Salsa
4. Sklepi
V tej študiji smo izolirali in razjasnili strukture petih novih s fenilpropanoidom substituiranih glikozidov, imenovanih cistansalside AE (5, 6, 12, 17 in 18), poleg izolacije in identifikacije 13 znanih spojin z uporabo strategije dereplikacije. Ugotovljeno je bilo, da so znane spojine lipedozid AI (1) [21], 23-acetilakteozid (2) [22], izocistanozid C (3) [15], osmantusid B (4) [21], epimeridinozid A ( 7) [15], cistanozid D (8) [23], salsazid B (9) [6], tubulozid E (10) [16], cistanozid M (11) [15], izomartinozid (13) [24], salsazid C (14) [6], jionosid C (15) [25] in salsazid F (16) [6]. Njihove strukture so bile ugotovljene z analizo obsežnih spektroskopskih podatkov in s primerjavo s podatki, objavljenimi v literaturi. Potrjeno je bilo, da so bile začasno predvidene strukture glikozidov, substituiranih s fenilpropanoidom, pravilno usklajene z njihovimi dejanskimi strukturami.
Korist izvlečka Cistanche salsa
Reference
1. Shimamura, H.; Miyazawa, M.; Enomoto, K.; Nakamura, S.-I.; Kameoka, H. Zatiranje SOS-inducirajoče aktivnosti Trp-P-1 z maščobnimi kislinami iz Cistanche salsa v testu Salmonella Typhimurium TA1535/pSK1002 umu. Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 261–265. [CrossRef]
2. Jeon, E.; Chung, K.-S.; An, H.-J. Protiproliferacijski učinki Cistanches salsa na napredovanje benigne hiperplazije prostate. Lahko. J. Physiol. Pharmacol. 2016, 94, 104–111. [CrossRef] [PubMed]
3.Xu, C.; Jia, X.; Xu, R.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Sun, S. Hitra diskriminacija Herba Cistanches z večstopenjskim infrardečim makroprstnim odtisom v kombinaciji z mehkim neodvisnim modeliranjem razredne analogije (SIMCA). Spectrochim. Acta del A Mol. Biomol. SpectrosCistanche 2013, 114, 421–431. [CrossRef] [PubMed]
4. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Diferenciacija Herba Cistanches po prstnem odtisu s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti z zaznavanjem nizov diod in masno spektrometrijo. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]
5. Kobayashi, H.; Karasawa, H.; Miyase, T.; Fukushima, S. Študije o sestavinah Cistanchis Herba. V. Izolacija in strukture dveh novih fenilpropanoidnih glikozidov, cistanozidov E in F. Chem. Pharm. Bik. 1985, 33, 1452–1457. [CrossRef]
6. Lei, L.; Jiang, Y.; Liu, X.-M.; Tu, P.-F.; Wu, L.-J.; Chen, F.-K. Novi glikozidi iz Cistanche salsa. Helv. Chim. Acta 2007, 90, 79–85. [CrossRef]
7. Kartbaeva, EB; Sakipova, ZB; Ibragimova, LN; Kapsalyamova, EN; Ternynko, II Študija sestave fenolnih spojin Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck, ki raste v Republiki Kazahstan. J. Chem. Pharm. Res. 2015, 7, 120–122.
8. Liu, J.-Y.; Guo, Z.-G.; Zeng, Z.-L. Izboljšano kopičenje feniletanoidnih glikozidov z dovajanjem prekurzorja v suspenzijsko kulturo Cistanche salsa. Biochem. inž. J. 2007, 33, 88–93. [CrossRef]
9. Maruyama, S.; Akasaka, T.; Yamada, K.; Izvleček salse Tachibana, H. Cistanche deluje podobno kot vezan na beljakovine
polisaharida-K (PSK) na različnih vrstah celičnih linij. J. Tradicija. Med. 2008, 25, 166–169.
10. Tian, X.-F.; Pu, X.-P. Feniletanoidni glikozidi iz Cistanches salsa zavirajo apoptozo, ki jo povzroča 1-metil-4-fenilpiridinijev ion v nevronih. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 59–63. [CrossRef] [PubMed]
11. Michel, T.; Halabalaki, M.; Skaltsounis, AL Novi koncepti, eksperimentalni pristopi in strategije dereplikacije za odkrivanje novih fitoestrogenov iz naravnih virov. Planta Med. 2013, 79, 514–532. [CrossRef] [PubMed]
12. De Medeiros, LS; Abreu, LM; Nielsen, A.; Ingmar, H.; Larsen, TO; Nielsen, KF; Rodrigues-Filho, E. Dereplikacijsko vodena izolacija depsides theaflavins ST in lecanora DF iz endofitne glive Setophoma sp. Fitokemija 2015, 111, 154–162. [CrossRef] [PubMed]
13.Rakotondraibe, LH; Rasolomampianina, R.; Park, H.-Y.; Li, J.; Slebodnik, C.; Brodie, PJ; Blasiak, LC; Hill, R.; TenDyke, K.; Shen, Y.; et al. Antiproliferativne in antiplazmodijske spojine iz izbranih vrst Streptomyces. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2015, 25, 5646–5649. [CrossRef] [PubMed]
14. Jiang, Y.; Liu, F.-J.; Wang, Y.-M.; Li, H.-J. Dereplikacijsko vodena izolacija novih hepatoprotektivnih triterpenoidnih saponinov iz semena Celosiae s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti v kombinaciji z elektrosprejno ionizacijsko tandemsko kvadrupolno-časovno masno spektrometrijo. J. Pharm. Biomed. Analno 2017, 132, 148–155. [CrossRef] [PubMed]
15. Zhang, J.; Li, C.; Che, Y.; Wu, J.; Wang, Z.; Cai, W.; Li, Y.; Ma, Z.; Tu, P. Strategija, ki temelji na LTQ-Orbitrap, za tradicionalno kitajsko medicino je usmerjena v odkrivanje razredov, identifikacijo in njene omične raziskave: študija primera o feniletanoidnih glikozidih v treh različnih vrstah Herba Cistanches. RSC Adv. 2015, 5, 80816–80828. [CrossRef]
16. Yoshizawa, F.; Deyama, T.; Takizawa, N.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. Sestavine Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. f. II. Izolacija in strukture novega feniletanoidnega glikozida in novega neolignanskega glikozida. Chem. Pharm. Bik. 1990, 38, 1927–1930. [CrossRef]
17. Tanaka, T.; Nakashima, T.; Ueda, T.; Tomii, K.; Kouno, I. Enostavna diskriminacija aldoznih enantiomerov s HPLCistancheChem z reverzno fazo. Pharm. Bik. 2007, 55, 899–901. [CrossRef] [PubMed]
18. Wong, WS; Guo, D.; Wang, XL; Jin, ZQ; Xia, B.; Li, N. Študija cis-cimetne kisline v Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. Biochem. 2005, 43, 929–937. [CrossRef] [PubMed]
19.Kahnt, G. Trans-Cis-ravnotežje hidroksicinamičnih kislin med obsevanjem vodnih raztopin pri različnih pH. Fitokemija 1967, 6, 755–758. [CrossRef]
