DEL Ⅰ: Učinki okoljskih razmer na število nefronov
Mar 20, 2022
za več informacij:ali.ma@wecistanche.com
DEL Ⅰ: Učinki okoljskih razmer na število nefronov: modeliranje bolezni matere in epigenetske regulacije pri razvoju ledvic
Lars Fuhrmann, Saskia Lindner, Alexander-Thomas Hauser, Clemens Höse & dr.
1. Uvod
Na razvoj ploda vpliva okolje v maternici, neugodno okolje pa lahko pozneje v življenju povzroči nagnjenost k boleznim, kot so hipertenzija, kardiovaskularne bolezni in kronična ledvična bolezen [1-4]. Vrsta intrauterinih motenj lahko povzroči zmanjšanje nefrona in ogroženo delovanje ledvic pri potomcih. Pri glodavcih stanja, ki vodijo do zmanjšanega števila nefronov ob rojstvu, vključujejo intrauterino zadrževanje rasti (IUGR), materino dieto z nizko vsebnostjo beljakovin, zdravila (vključno s kortikosteroidi ali nesteroidnimi protivnetnimi zdravili), monogenetske mutacije in nizko raven vitamina A ter sladkorno bolezen pri materi. in pomanjkanje železa [5-10]. Pri ljudeh trenutno ni neinvazivne metode za merjenje števila nefronov. Vendar pa so posmrtne študije pokazale negativno korelacijo med številom nefronov in krvnim tlakom [4,11]. Poleg tega je znano, da so intrauterina stanja, povezana z zmanjšanim številom nefronov, kot je IUGR, povezana s povečano stopnjo hipertenzije in kronične ledvične bolezni [12].
Poskusi in vivo, pri katerih so bila neugodna intrauterina stanja umetno izzvana pri brejih živalih, so se izkazali za neprecenljive za odkrivanje in opisovanje ledvičnih sprememb, povzročenih pri potomcih. Vendar pa vsak eksperimentalni poseg med nosečnostjo povzroči zapletene spremembe v fiziologiji matere, placente in ploda, ki lahko same vplivajo na okolje razvijajočih se metanefrojev. Tehnike modeliranja ex vivo se temu izognejo tako, da omogočijo preiskavo razvoja ledvic popolnoma ločeno od vpliva matere živali, posteljice ali drugih organov ploda. Izolirane kulture metanefrojev na vmesniku medij-zrak je prvotno izvedel Trowell leta 1950 [13] in so bile nato izboljšane z gojenjem ledvic na filtrirnih membranah [14], kar je osnova za pogoje gojenja z eno spremenljivko.
Če povzamemo, vedno več je dokazov, ki kažejo, da so prenatalni napadi, povezani z nizkim številom nefronov, pomembni za dejavnike tveganja za hipertenzijo in KLB. Da bi razvili preventivne strategije za zagotovitev ustrezne obdarjenosti nefrona ob rojstvu, je potrebno mehanično razumevanje dejavnikov, ki vplivajo na razvoj ledvic in nefrogenezo. V tem delu je bila kultura metanefričnih organov uporabljena za modeliranje različnih vidikov okoljske regulacije, da bi preučili njihove učinke na rast ledvic in možne posledice za dolgoročno ledvično delovanje ter uporabili za pregledovanje epigenetskih regulatorjev z uporabo majhnih spojin, ki jih je odobrila FDA.
Kliknite za izdelke Cistanche herba za delovanje ledvic
2. Rezultati
2.1. Uporaba metanefričnih organskih kultur za preučevanje vpliva okoljskih razmer na razvoj ledvic
Za modeliranje neugodnih okoljskih razmer so bile ledvice zarodkov (E)12,5 embrionalnega dne kultivirane na vmesniku srednjega zraka (slika 1A). Za lažje spremljanje razvoja nefrona in glomerulov, Six2. Cre in Pod. Uporabljene so bile dvojne fluorescentne reporterske miši Cre (slika 1B, C). Pogosto stanje med nosečnostjo je povišana telesna temperatura, ki prizadene več kot 10 odstotkov nosečnosti v prvih 16 tednih nosečnosti. [15] Vročina je dobro označen teratogen, hipertermija med nosečnostjo pa dokazano vodi do splava ploda, zastoja v rasti, in razvojne okvare, kot so ageneza ledvic, hipoplazija in nizka porodna teža pri več vrstah [16-21]. Da bi ocenili vpliv dolgotrajnih hipertermičnih pogojev z vročino na rast ledvic in tvorbo nefrona, so bile ledvice izolirane in vzdrževane pri 37 ali 40 stopinjah (slika 1D). Po 7 dneh gojenja so bile ledvice, gojene pri 40 °C, v povprečju za 18,36 odstotka manjše od primerkov, gojenih v fizioloških pogojih (slika 1E). Vendar pa med skupinama ni bilo ugotovljene pomembne razlike v številu glomerulov na ledvico (slika 1F). Kljub temu pa zmanjšana splošna rast ledvic kaže negativen učinek povišane temperature na metanefrično rast.
Približno 19 odstotkov nosečnic, ki trpijo za anemijo zaradi pomanjkanja železa [22], je pomanjkanje železa eno najbolj razširjenih stanj, ki lahko moti razvoj ledvic [23]. Podatki in vivo so pokazali, da se med nosečnostjo zaradi pomanjkanja železa pri materi zmanjšajo rast ledvic, število glomerulov in privzem železa v ledvicah [24]. Da bi ocenili vpliv zmanjšane oskrbe železa, vezanega na transferin, na rast ledvic in nefrogenezo, smo eksplante gojili v mediju, ki je vseboval 50 ug/ml holo-transferina, nasičenega z železom, ali 50 ug/ml apo-transferina, osiromašenega z železom, oz. Ledvice z omejenim vnosom železa so ostale veliko manjše od svojih primerkov z zadostno količino železa in so pokazale povečano apoptozo v popkih sečevodov ter zmanjšano razvejanje in proliferacijo popkov sečnice (slika 1G, dodatna slika S1A-F). Medtem ko je bila populacija nefrona morfološko nespremenjena, je bilo mogoče opaziti zmanjšanje razvijajočega se distalnega dela nefrona in distalnih tubulov (slika 1H,I, dodatna slika S1G-J). Ledvice s pomanjkanjem železa so bile v povprečju 47,9 odstotka velikosti svojih primerkov, gojenih s holotransferinom (slika 1) in so pokazale zmanjšanje skupnega števila glomerulov na ledvico za 69,9 odstotka po 7 dneh v kulturi (slika 1K). . Tako je izčrpavanje železa zaradi apo-transferina pokazalo resne učinke na rast ledvic s fenotipom proksimalne nefrogeneze.
Slika 1. Uporaba metanefričnih organskih kultur za preučevanje vpliva okoljskih razmer na razvoj ledvic.(A) Urogenitalni greben iz mišjih zarodkov E12.5 (leva plošča) je bil mikrokirurško ekstrahiran (druga plošča), ledvice pa so bile izolirane (tretja plošča) in nameščene na vstavke Transwell (desna plošča). Lestvice∶ 1 mm （leva plošča）, 500 μm（tretja plošča）. (B) Transgene miši z dvojno ekspresijo Tomato/EGFP so bile uporabljene za pogojno označevanje Six2-pozitivnih celic in njihovih potomcev z uporabo Six2. Cre ali (C) podocin pozitivne celice z uporabo Pod. Cre miške. (D) Eksplantate iz istega zarodka smo gojili 7 dni pri 37 ali 40 stopinjah. Lestvice ∶ 500 μm. （E） Površinske površine eksplantatov, gojenih 7 dni pri 37 ali 40 stopinjah .n=40 parov, parni t-test, povprečje±SD.(F) Število glomerulov v skupinah eksplantatov po 7 dneh.n{{ 17}} parov, parni t-test, povprečje ±SD. （G） Eksplantate iz istega zarodka smo gojili 7 dni v mediju, ki je vseboval holo-Tf ali apo-Tf. Lestvice ∶ 500 μm. (H) Širokopoljske slike holo-Tf in apo-Tf kultiviranega para eksplantatov, obarvanega proti SIX2 in E-kadherinu po 48 urah kulture, kažejo normalen skupek matičnih celic in napake v zgodnji morfologiji nefrona. Merilna vrstica∶100 μm.（I） Slike širokega polja holo-Tf in apo-Tfkultiviranega para eksplantatov, obarvanih proti WT1 in JAG1. Lestvica ∶100 μm. （） Površinske površine gojenih eksplantatov holo-Tf in apo-Tf po 7 dneh.n=30 parov, parni t-test, povprečje ± SD.(K) Število glomerulov v skupinah eksplantatov po 7 dneh.n =17 parov, parni t-test, povprečje ± SD.
2.2. Ex Vio izpostavljenost visoki glukozi vodi do sprememb v razvijajočih se ledvicah, povezanih z diabetično nefropatijo
Diabetes pri materi je drugo pogosto stanje med nosečnostjo, z globalno razširjenostjo hiperglikemije v nosečnosti ~ 17 odstotkov in več kot 20 milijoni živorojenih vsako leto [25]. Pokazalo se je, da sladkorna bolezen, povzročena pri modelih miši in podgan, vodi do potomcev z nižjim številom nefronov [10,26,27]. Kulturo metanefričnih organov so že uporabljali za preučevanje učinka visoke glukoze na razvoj ledvic [27-29]. Prej smo poročali o zmanjšanju velikosti, števila nefronov in metilacije DNA pri visokih koncentracijah glukoze 55 mM[30]. V nasprotju z objavljenimi podatki [28] v naših vzorcih pri gojenju v različnih 30 mM glukoznih medijih v primerjavi s 5 mM kontrolnimi pogoji po 7 dneh ni bilo opaziti vpliva na velikost eksplantata ali število glomerulov (dodatna slika S2A, B). Poleg tega ni bilo mogoče zaznati zmanjšanja metilacije DNA na LINE-1 in glavnih satelitskih mestih (dodatna slika S2C, D). Učinek 55 mM visoke glukoze na razvoj ledvic po 7--dnevni kulturi je bil nadalje analiziran, kar je pokazalo zmanjšanje stopnje rasti od 3. dne v kulturi (slika 2A, B). Imunofluorescenčno barvanje ni pokazalo nobenih morfoloških napak skupine SIX2-pozitivnih matičnih celic (slika 2C), vendar je pokazalo zmanjšano obarvanje podocitnega markerja podokaliksina (PODXL, slika 2D). Ugotovljeno je bilo, da glomeruli vsebujejo odebeljen glomerulni osnovni matriks, viden v histoloških barvah (slika 2E). Podobne ugotovitve so bile narejene z elektronsko mikroskopijo, ki je pokazala povečanje debeline glomerularne bazalne membrane (slika 2F), enega najzgodnejših označevalcev preddiabetesa in diabetične nefropatije (DN) [31, 32], pri petih od šestih ledvic in pri nobeni sedmih kontrolnih ledvic sorodnikov. Za nadaljnje razkritje sprememb v transkriptomu je bila izvedena parna analiza diferencialne genske ekspresije (DGE) kultur ledvic iz treh legel, pri čemer je bila ena ledvica vsakega zarodka gojena z visoko vsebnostjo glukoze, druga pa s kontrolnim medijem, ledvice pa so bile združene za analizo ( n=3).DGE je potrdil regulacijo komponent zunajceličnega matriksa kot primarni reguliran biološki proces (dodatna tabela S1). Znižano regulirani geni so bili v glavnem vključeni v (imunsko) celično aktivacijo in eksocitozo/izločanje (dodatna tabela S1). Ontologija fenotipa sesalcev je pokazala nenormalno morfologijo ledvične skorje in ledvičnih telesc zaradi znižanih genov, kot so Pdgfb, Podxl, Ren, Ptpro, Mafb in Vegfa (dodatna tabela S1). Ledvična ekspresija več genov, kot so Angptl4, Spon2 (Mindin), Pappa in Txnip, za katere se je izkazalo, da so povečani pri diabetični nefropatiji [33-36], je bila povečana v hiperglikemičnih pogojih. Za primerjavo profila ekspresije genov kulture ledvic z visoko vsebnostjo glukoze in človeškega DN so bili podatki DGE primerjani s podatki o ljudeh iz mikrodiseciranih glomerulov in tubulov iz biopsij bolnikov z diabetično nefropatijo iz Evropske banke ledvične cDNA (ERCB). Od 216 različno reguliranih genov, ki so bili usklajeni po šaržni analizi, je bilo 94 genov ustrezno različno reguliranih v glomerularni in/ali tubularni frakciji (slika 2G). Prekrivanje našega modela in človeških DNgenov je pokazalo 40 od 95 genov, reguliranih navzgor v glomerulih in 34 genov v tubulih (25 skupnih genov) (slika 2H). Geni so bili večinoma vključeni v organizacijo zunajceličnega matriksa (COL4A5, COL4A6, COL8A2, LAMB3, LAMC3) in celično adhezijo (ITGBL1, CLDN15). Poleg tega so bili geni, povezani s sladkorno boleznijo, kot so TXNIP, SPON2 in PAPPA, povečani. Od 120 znižano reguliranih genov iz ledvičnih kultur je bilo 22 znižano reguliranih tudi v glomerulih, 39 pa tudi znižanih v tubulih (16 skupaj (slika 2I). Ti geni so bili vključeni v odgovor na endogene dražljaje (BMP2, KLF15, JUNB, CTSB), razvoj epitelija nefrona (PTPRO, PODXL, VEGFA) in pozitivna regulacija kemotakse endotelijskih celic (LGMN, P2RX4, VEGFA).Poleg tega so bili geni, povezani s sladkorno boleznijo, kot so RASGRP3, SIRPA, GATM in ESM1, znižani [ 37-39]. Diferencialno regulirani geni, ki se ne prekrivajo s podatki ERCB, so odražali tudi spremembe, povezane s sladkorno boleznijo, kot je zunajcelični matriks (ANGPTL4, TNN, DPT, COL9A2) ali gestacijski diabetes (LAT2, HP, CXCL10, CD{{76} }, CD68, REN, SLC2A3, VCAM1). Tako je razvoj ledvic v pogojih visoke glukoze pokazal izjemne podobnosti z diabetično nefropatijo pri odraslih.
Slika 2. Ex vivo visoka izpostavljenost glukozi povzroči spremembe v razvijajoči se ledvici, povezane z diabetično nefropatijo.(A) Zarodne ledvice iz Pod.Cre; Paradižnik/EGFP živali, gojene 7 dni v pogojih z nizko vsebnostjo glukoze (LG, 5,5 mM -D-glukoza, 55 mM manitol) ali visoko glukozo (HG, 55 mM -D-glukoza). Lestvica: 500 um. (B) Površina ledvic pri pogojih HG in LG.*,p=0.0474;*,p=0.0052;*,p<0.0001.paired t-test,="" mean="" ±="" sd.(c)="" confocal="" immunofluorescent="" stainings="" of="" day="" 7="" kidney="" cultures="" against="" six2="" and="" (d)="" podocalyxin="" with="" pan-cytokeratin="" and="" hoechst.scale="" bar:="" 100="" um.="" (e)="" stainings="" of="" 6="" um="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" scale="" bar:="" 20="" um.="" (f)transmission="" electron="" microscopy="" of="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" glomerular="" basement="" membranes="" are="" thickened="" in="" kidneys="" exposed="" to="" high="" glucose="" conditions.="" left="" column:="" magnification="" showing="" podocyte="" foot="" processes.="" scale="" bars:="" 500="" nm="" (left="" panels),100="" nm="" (right="" panels).(g)="" fold="" change="" of="" rna-seq="" data="" from="" hg="" compared="" to="" lg="" kidneys="" and="" ercb="" diabetic="" nephropathy="" (dn)patient="" microarray="" data="" from="" microdissected="" glomeruli="" and="" tubules="" showing="" differentially="" expressed="" genes.="" (h)="" genes="" upregulated="" in="" the="" kidney="" cultures(kc)overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="" highlighted.="" (i)genes="" downregulated="" in="" the="" kidney="" cultures="" (kc)="" overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="">
2.3. Ex vivo visoka izpostavljenost glukozi vpliva na oblikovanje dolgoročnega spomina prek metilacije DNA
Za nadaljnje razumevanje molekularnih sprememb, ki jih povzroča hiperglikemično okolje, so ledvične kulture gojili pri visokih glukoznih pogojih 3,5 dni in nato spremenili v nizke glukozne pogoje za enak čas (slika 3A). Zanimivo je, da inkubacija v fizioloških pogojih po krajšem inkubacijskem obdobju v mediju z visoko vsebnostjo glukoze ni obrnila zmanjšanja rasti po 7 dneh v kulturi, pri čemer so kulture rasle z enako hitrostjo kot pri neprekinjenem zdravljenju z visoko vsebnostjo glukoze (slika 3B). Poleg tega je metilacija DNA pokazala hipometilacijo elementa LINE-1 in glavnih satelitskih lokusov (slika 2C, D), kot tudi trajno hipermetilacijo DNA promotorja Ppargcla, tako pri visoki glukozi kot pri obratnih pogojih (slika 3E), kar kaže na tvorba presnovnega spomina preko metilacije DNK zaradi prejšnjih neugodnih okoljskih pogojev kot sredstva za programiranje ploda.
Slika 3. Ex vivo visoka izpostavljenost glukozi vpliva na nastanek dolgoročnega spomina prek metilacije DNA.(A) Slikanje E12.5 embrionalnih ledvic od dne 0 do 7. dne v mediju z nizko vsebnostjo glukoze (5,5 mM), mediju z visoko vsebnostjo glukoze (55 mM) ali mediju z visoko vsebnostjo glukoze za 3,5 dni in preusmeritev na medij z nizko vsebnostjo glukoze za preostale dni. Merilo: 500 um. (B) Površina ledvic v 7 dneh. Srednja vrednost ± SD. n=36 ledvic. LG, zdravljenje z nizko vsebnostjo glukoze; HG, zdravljenje z visoko glukozo; HG do LG, 3,5-dnevno zdravljenje z visoko in 3,5-dnevno zdravljenje z nizko glukozo.***,LG-HG (neparni t-test):p=0.0004;**,LG-HG do LG (parni t-test) ):str<0.0001.(c) analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" line-1="" and(d)major="" satellite="" loci="" shows="" continuous="" dna="" hypomethylation="" in="" high="" glucose="" treated="" conditions.**,p-value="0.0022.*,p-value=0.0357.(E)" analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" the="" ppargcla="" locus="" shows="" continuous="" dna="" hypermethylation="" in="" high="" glucose="" conditions.="" mean="" ±="" sd.="" *,p-value="">
2.4 Ex Vivo Small Compound Screen identificira epigenetske regulatorje razvoja ledvic
Rezultati tega dela in prejšnjih del kažejo, da imajo epigenetski mehanizmi vlogo pri razvoju ledvic [30, A40-45]. Zato smo želeli sistematično ovrednotiti učinek epigenetskih modulatorjev različnih razredov encimov na razvoj ledvic. Za to smo izbrali knjižnico 22 majhnih spojin, ki jih je odobrila FDA, z dokazano inhibitorno aktivnostjo [46-56] (slika 4A). Z uporabo miši Six2.Cre-reporter za oceno razvoja nefrona so ledvične strukture gojili 3 dni z inhibitorji v mediju. Velikost se je sčasoma povečala v primerjavi z nadzornimi organi sorodnikov iz legla, morfologija pa je bila preverjena glede nepravilnosti v razvoju (slika 4B). Dokazano je, da več zaviralcev moti normalen ex vivo razvoj ledvic. Zaviralec HDAC entinostat, zaviralec benzamid histon deacetilaze z visoko afiniteto za HDAC1, 2 in 3 [57], je pokazal dosledno zmanjšanje rasti ter pomanjkanje diferenciacije in proliferacije po 3 dneh (slika 4C). TH39 se je razvil kot selektivni zaviralec HDAC8 (IC50). HDAC8 88 nM, 26-kratno selektiven proti HDAC1,28-kratno selektiven proti HDAC6[56]), je pokazal podobno resno zaviranje rasti v primerjavi s kontrolnimi organi iz legla. Poleg tega so kelatorji železa in zaviralci deferasiroksa in deferoksamina JmJC pokazali zmanjšanje rasti, podobno kot medij s pomanjkanjem železa. Poleg tega je zaviralec SET7/9 ciproheptadin [58, 59] pokazal zmanjšanje rasti ter pomanjkanje diferenciacije in proliferacije v primerjavi s kontrolnimi ledvicami (slika 4D), vendar se je zdelo tudi, da moti signalizacijo Wnt (dodatna slika S3). Drugi zaviralci HDAC, HAT, HDM in HMT ter zaviralec DNMT 5-azacitidin niso pokazali zmanjšanja rasti ali razvojnih anomalij v izmerjenem časovnem okviru (slika 4A).
Slika 4. Ex vivo majhen sestavljeni zaslon identificira modulatorje ledvičnega razvoja.(A) Seznam majhnih spojin, njihovih epigenetskih ciljev in uporabljenih koncentracij kaže zmanjšanje ledvične rasti z entinostatom, TH39, deferasiroksom, deferoksaminom in ciproheptadinom v več kot ali enako 3 neodvisnih poskusih po 3 dneh v kulturi. Kontrolne kulture smo obdelali z DMSO. ***, p-vrednost<0.0001. (b)examples="" of="" two="" sets="" of="" embryonic="" kidney="" cultures="" with="" pictures="" taken="" from="" day="" 0="" until="" day="" 3="" showing="" growth="" reduction="" and="" morphological="" differences="" in="" kidneys="" treated="" with="" th39,="" deferasirox,="" and="" deferoxamine="" compared="" to="" littermate="" control="" kidneys.="" scale="" bar∶="" 500="" μm.="" (c）entinostat="" showed="" growth="" reduction="" at="" 5="" and="" 10="" μm="" concentrations,="" no="" nephron="" differentiation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" (d)cvproheptadine="" showed="" growth="" reduction="" at="" 100="" and="" 50="" μm="" concentrations,="" lack="" differentiation,="" ureter="" dilation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" in="" culture.="" scale="" bar:="" 500="" um.="" panck,="" pan-cytokeratin.="" cc3,="" cleaved="" caspase-3.="" pcna,="" proliferating="" cell="" nuclear="">
