PRVI DEL Ehinakozid poveča količino sperme pri podganah tako, da cilja na hipotalamične androgene receptorje

Kako ehinakozid stimulira estrogen in poveča število semenčic?

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 & Xiaoying Zhang1,2

Moška neplodnost je velik zdravstveni problem z ocenjeno razširjenostjo 4,2 odstotka moških neplodnosti po vsem svetu. Naše zgodnje delo je pokazalo, da izvlečki Cistanche ščitijo pred poškodbami sperme pri miših in toehinakozid(ECH) je ena glavnih aktivnih sestavin. Tukaj poročamo o bistveni vlogi zaECH, naravni izdelek, ki obrne ali ščiti pred oligo kot aspermijo pri podganah.ECHtestirali s HPLC, ovrednotili količino in kakovost sperme ter določili raven hormonov z radioimunskim sorbentom. ECH znižal ravni androgenega receptorja (AR) in ključs steroidogenimi povezanimi geni, kot je določeno z analizo Western blot in qPCR. Interakcija medECHin AR je bil ovrednoten z indirektnim testom ELISA in molekularnim spajanjem. Rezultati kažejo, da ECH v kombinaciji s hipotalamičnim AR v žepu Met-894 in Val-713 zavira prenos AR izcitoplazme do jeder v hipotalamusu. Medtem ko so bile negativne povratne informacije regulacije spolnih hormonov zavrte, so bile pozitivne povratne informacije stimulirane za povečanje izločanja luteinizirajočega hormona in testosterona, kar je posledično povečalo količino sperme. Ti podatki skupaj kažejotoECHblokira aktivnost AR v hipotalamusu za povečanje količine sperme in zaščito pred oligo aspermijo pri podganah.

Za več informacij se obrnite na:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola ima številne učinke, kliknite tukaj za več informacij

Proizvodnja testosterona v celicah testisov je močno regulirana s hipotalamus-hipofizno-gonadno osjo (HPG) z oblikovanjem homeostatske povratne zanke1. Gonadotropin-sproščujoči hormon (GnRH), ki ga izloča hipotalamus, lahko spodbudi izločanje luteinizirajočega hormona (LH) iz hipofize, ki dodatno spodbudi proizvodnjo testosterona v Leydigovih celicah testisov. Testosteron se biosintetizira z vrsto steroidogenih encimov. Kot ena od glavnih poti lahko steroidogeni akutni regulatorni protein (StAR) prenaša holesterol iz znotrajceličnih virov v mitohondrije2, kjer je izpostavljen encimu za cepljenje stranske verige holesterola (CYP11A1), 3 -hidroksisteroid dehidrogenazi (HSD3), { {10}}hidroksilaze (CYP17A1) in 17-hidroksisteroid dehidrogenaze (HSD 17), ki katalizirata pretvorbo holesterola v testosteron3,4. Testosteron se nato negativno vrne k elementu HPG, da zniža nadaljnje izločanje LH na način, ki je odvisen od odmerka.

Učinek testosterona na povratno zanko osi HPG se pojavi z vezavo na androgeni receptor (AR), ki ga najdemo v hipotalamusu in hipofizi5. Pri miših ablacija AR in minimalna proizvodnja testosterona povzročita zvišanje ravni LH in folikle stimulirajočega hormona (FSH)6, kar nakazuje, da AR sodeluje pri regulaciji negativne krmne zanke. Klasični genomski mehanizem signalizacije testosterona se pojavi, ko testosteron difundira v celico in se veže na AR. Ta kompleks ligand-receptor se nato premakne v jedro, kjer se veže na elemente androgenega odziva (ARE) v regulativnih regijah genov, ki se odzivajo na testosteron, da spremeni njihovo translokacijo. Testosteron inducira tudi neklasično pot delovanja steroidnih hormonov, za katero so značilni hitri dogodki, ki vodijo do aktivacije citosolnih signalnih kaskad, ki jih običajno sprožijo rastni faktorji7,8. Klasične in neklasične poti testosterona prispevajo k ohranjanju spermatogeneze in plodnosti. Vendar pa je funkcija AR pomembnejša pri klasični poti, saj testosteron poveča kakovost sperme.

Ehinakozid(ECH) je ena od bioaktivnih sestavin, pridobljenih iz vrst zdravilnih rastlin Echinacea9 in Cistanche10. S širokim spektrom farmakoloških aktivnosti so izvlečki ehinaceje eden najbolj priljubljenih zeliščnih dodatkov v Evropi in ZDA predvsem zaradi svojih antioksidativnih lastnosti11 in sposobnosti preprečevanja prehlada12. zanimivo,Cistancheizvlečki inECHso tradicionalno uporabljali kot tonik za zdravljenje reproduktivne disfunkcije in za povečanje moške spolne aktivnosti v tradicionalni kitajski medicini10. Nekateri OTC izdelki z ekstrakcijo Cistanche so bili razviti kot hranilni dodatki in postajajo vse bolj priljubljeni na trgih zdrave hrane na Kitajskem in v nekaterih drugih azijskih državah (Kitajska uprava za hrano in zdravila)13. Vendar pa so osnovni mehanizmiECHukrepi ostajajo nejasni. Moška neplodnost je velik zdravstveni problem z ocenjeno razširjenostjo 4,2 odstotka moških neplodnosti po vsem svetu14. Diagnoza moške neplodnosti trenutno temelji na študiji kakovosti sperme, vključno z analizo parametrov semena, kot so koncentracija, gibljivost in morfologija sperme15. Bisfenol A (BPA), ki posnema estrogen, je zelo razširjen okoljski onesnaževalec, ki so ga preučevali glede vpliva na plodnost samcev pri več vrstah živali in ljudi16. BPA moti hipotalamo-hipofizno-gonadno os, zavira izražanje testikularnih steroidogenih encimov in sintezo testosterona pri mladičih samcev17, kar povzroči stanje hipogonadotropnega hipogonadizma18. V tej študiji raziskujemo učinkeECHna kakovost sperme in raven hormonov. Poleg tega je bil BPA izbran kot modelno sredstvo za poškodbe sperme za nadaljnje proučevanje zaščitnega učinkaECHproti slabi kakovosti sperme.

Rezultati ECH poveča količino sperme. Število semenčic v kavdi epididimisu, sposobnost preživetja semenčic in gibljivost semenčic so predstavljeni v tabeli 1. Zdravljenje z 80 mg/kg ECH in 15 mg/kg testosteron propionata (TP) je znatno povečalo število semenčic v epididimisu. Vendar ni bilo pomembne razlike v sposobnosti preživetja in gibljivosti semenčic.

ECH poveča raven testosterona in LH v serumu, encefalonu in hipofizi ter testisih. Zdravljenje z ECH je opazno povečalo ravni LH v serumu, encefalonu in hipofizi ter testisih (slika 1A). V skupini ECH(H) so se ravni LH znatno povečale za 1.1--krat v serumu, 1.4--krat v encefalonu in hipofizi in 1.2--krat v modih. Testosteron se je po zdravljenju z ECH(H) znatno povečal za 1,5 oziroma 1{10}}krat v encefalonu in hipofizi ter testisih, ne pa tudi v serumu. Po zdravljenju s TP so se ravni testosterona znatno povečale za 1,6, 1,8 in 1.4-krat v serumu, encefalonu in hipofizi ter modih.

ECH increased steroidogenic enzyme gene expression. ECH significantly increased the expressions of key steroidogenic enzymes in the testis (Fig. 1B). The mRNA levels of CYP11A1, CYP17A1, HSD3β1/2, and HSD17β in the ECH(H) group were increased more than 3-fold, while the levels of StAR mRNA showed no significant differences with all ECH treatments (p>0.05). TP ni bistveno spremenil izražanja CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 in HSD17. To se odraža v obsežni analizi toplotnega zemljevida učinka ECH na ekspresijo steroidogenih encimov, ki kaže, da je ECH znatno povečal ravni mRNA CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 in HSD17 ter zlasti HSD3 1/ 2 (slika 1C).

ECH lahko prehaja krvno-možgansko pregrado in v manjši meri pregrado krv-testisi. Za ovrednotenje androgene povratne zanke na osi HPG je bila sposobnost ECH, da vstopi v hipotalamus, ovrednotena v seriji študij farmakokinetike. Koncentracije ECH so bile odkrite v hipotalamusu po 12-urnem enkratnem peroralnem dajanju 30mg/kg ECH in ECH je pokazal izrazito penetracijo hipotalamusa s povprečnim razmerjem hipotalamus/plazma 33,92 odstotka (slika 2A). Vrednosti T1/2 so bile 2,61±0,42 h in 1,88±0,22 h v plazmi oziroma hipotalamusu (slika 2B). Vendar pa je bil s HPLC odkrit zelo omejen dostop ECH v moda. Koncentracije ECH v testisih so bile 0.083 ug/mL, 0.043 ug/mL in 0,028 ug/mL po 0,5 h, 1 h oziroma 1,5 h po zdravljenju. .

ECH zmanjša translokacijo AR hipotalamusa v jedro. Da bi testirali učinek ECH na translokacijo AR, je bila ekspresija AR v citoplazmi in jedru mod in hipotalamusa določena z analizo Western blot. Kot je prikazano na sliki 3A, je ECH znižal AR protein v jedrih hipotalamusa za petkrat v primerjavi s kontrolno skupino. Zdravljenje z enzalutamidom, zaviralcem AR, je znižalo ravni proteina AR v jedrih hipotalamusa za 48-krat. Predvsem je bil citoplazmatski AR višji pri zdravljenju z ECH in zdravljenjem z enzalutamidom kot pri kontrolnih skupinah, kar kaže na to, da ECH blokira transport AR iz citoplazme v jedro v hipotalamusu. Kot je bilo pričakovano, ECH ne zavira transporta AR iz citoplazme v jedro v testisih (slika 3B).

ECH je povečal izražanje genov, povezanih z osjo HPG. ECH je znatno povečal izražanje LH, LHR, GnRH 1 in Gnrhr v mešanici encefalona in hipofize, vendar ni bilo pomembne razlike v ravneh GnRH 1 po zdravljenju s TP. Analiza toplotnega zemljevida kaže, da je bilo izražanje GnRH 1 in LH najvišje med geni, povezanimi z osjo HPG.

AR je tarča ECH. Za potrditev razmerij med ECH in AR je bil uspešno sintetiziran ECH-ovalbumin (ECH-OVA) (sl. 5A, B). Molekulska masa ECH-OVA je večja od OVA, zato imata različne stopnje mobilnosti (slika 5A), vrh absorbance ECH-OVA pa je med ECH in OVA (slika 5B),

kar kaže, da je bil ECH uspešno konjugiran z OVA. Posredni rezultati ELISA (slika 5C) kažejo, da je protitelo proti AR sposobno zaznati protein AR, prisoten v vdolbinicah, ki vsebujejo ECH-OVA (označeno s protitelesom proti OVA), kar nakazuje, da se lahko ECH veže na protein AR. ECH se kombinira z AR žepom Met-894 in Val-713. Spojina ECH je bila pritrjena na mesto AF2 na površini človeškega AR in teoretični način vezave ECH in AR je bil prikazan na sliki 5D. Spojina ECH je sprejela kompaktno konformacijsko vezavo na žepu človeškega AR. Dve fenilni skupini ECH se vežeta na hidrofobno domeno AR žepa in vzdržujeta tesne hidrofobne stike z ostanki Leu-712, Val-716, Met-734, Ile-737 , Met-894 in Ile-898, medtem ko sta bili drugi dve strani ECH nameščeni na vhodu v žep in sta imeli le nekaj stikov. Podrobna analiza je pokazala, da tako Met-894 (dolžina vezi: 2,4Å) kot Val-713 (dolžina vezi: 2,7Å) tvorita vodikove vezi s hidroksilnimi skupinami ECH, kar je bila glavna interakcija med ECH in človeški AR. ECH zmanjša reproduktivno škodo, ki jo povzroči BPA. Da bi raziskali učinek ECH na reproduktivne poškodbe, so kakovost sperme in ravni spolnih hormonov in steroidogenih encimov pregledali pri miših, ki jih povzroča BPA. Kot je prikazano na sliki 6, je zdravljenje z BPA znatno zmanjšalo število semenčic in gibljivost semenčic za 26,5 odstotka oziroma 39,2 odstotka. Dajanje ECH je preprečilo zmanjšanje števila semenčic in gibljivosti semenčic za 35,5 odstotka oziroma 30,1 odstotka. Dajanje BPA je povzročilo tudi znatno zmanjšanje izločanja LH in T, ECH pa je znatno povečal ravni LH in T za 24,1 odstotka oziroma 18,3 odstotka v primerjavi s samim zdravljenjem z BPA (sl. 6A, B). Ravni mRNA StAR, CYP17A1, 3 -HSD in 17 -HSD pri zdravljenju z BPA-ECH so bile znatno povečane v primerjavi z zdravljenjem z BPA (sl. 6C, D).