Del Ⅰ Pomanjkanje Smad3 izboljša zdravljenje sladkorne bolezni in diabetične poškodbe ledvic na osnovi otočkov s spodbujanjem celične proliferacije preko mehanizma, odvisnega od E2F3-.
May 25, 2023
Povzetek
1. Utemeljitev
Slaba celična proliferacija je eden od škodljivih dejavnikov, ki ovira nadomestno zdravljenje s celicami otočkov pri bolnikih s sladkorno boleznijo. Smad3 je pomemben transkripcijski faktor TGF-signalizacije in dokazano spodbuja diabetes z zaviranjem celične proliferacije. Zato domnevamo, da so lahko otočki s pomanjkanjem Smad{2}} novo celično nadomestno zdravljenje sladkorne bolezni.
2. Metode
To hipotezo smo preučili pri miših s sladkorno boleznijo tipa -1, ki jih povzroča streptozocin, in miših s sladkorno boleznijo tipa -2 db/db s presaditvijo izločenih (KO) Smad3 oziroma divjih (WT) otočkov pod ledvično kapsulo. Preučevali so učinke Smad3KO v primerjavi z nadomestno terapijo z otočki WT na sladkorno bolezen in diabetično poškodbo ledvic. Poleg tega je bil RNA-seq uporabljen za identifikacijo spodnjega ciljnega gena, na katerem temelji Smad3-regulirana celična proliferacija v mišjih otočkih Smad3KO-db/db v primerjavi s Smad3WT-db/db.
3. Rezultati
V primerjavi s terapijo z otočki Smad3WT je zdravljenje z otočki Smad3KO doseglo veliko boljši terapevtski učinek pri sladkorni bolezni tipa -1 in tipa -2, saj je znatno znižalo serumske ravni glukoze v krvi in HbA1c ter zaščitilo pred diabetičnimi poškodbami ledvic s preprečevanjem zvišanje serumskega kreatinina in razvoj proteinurije, širjenje mezangialnega matriksa in fibroza. Te so bile povezane s pomembnim povečanjem proliferacije cepljenih celic in ravni insulina v krvi, kar je povzročilo izboljšano intoleranco za glukozo. Mehansko gledano je RNA-seq razkril, da je v primerjavi z mišjimi otočki Smad3WT-db/db izbris Smad3 iz mišjih otočkov db/db izrazito povečal E2F3, ključni regulator vstopa G1/S celičnega cikla. Nadaljnje študije so pokazale, da se lahko Smad3 veže na promotor E2F3 in tako zavira celično proliferacijo preko E2F3-odvisnega mehanizma, saj je utišanje E2F3 razveljavilo proliferativni učinek na celice Smad3KO.
4. Sklep
Nadomestno zdravljenje s pomanjkanjem otočkov Smad{0}} lahko bistveno izboljša sladkorno bolezen tipa-1 in tipa-2 ter zaščiti pred diabetično poškodbo ledvic, ki je posledica novega mehanizma, odvisnega od3-E2F celična proliferacija.
Ključne besede
Smad3, presaditev otočkov, diabetes, E2F3, celični cikel.
Kliknite tukaj za pridobitevKoristi Cistanche
Uvod
diabetes mellitus tipa -1 in 2 (DM1 in T2). Presaditev celic ali otočkov je privlačna terapija in se uspešno uporablja pri bolnikih s T1DM. Otočki ali celice, ki se uporabljajo za presaditev, so običajno iz kadveričnih darovalcev ali induciranih pluripotentnih matičnih celic (iPSC) [1, 2]. Več kot 1500 primerov klinične presaditve otočkov je bilo opravljenih pri bolnikih s T1DM po dobro uveljavljenem Edmontonskem protokolu [1]. Čeprav je približno 50 odstotkov bolnikov neodvisnih od insulina 5 let po presaditvi, je neuspeh presadka pogosta klinična skrb. Eden od dejavnikov, ki ovira presaditev otočkov, je izredno nizka proliferativna stopnja celic cepljenih otočkov [3]. Poleg tega lahko nevarni dražljaji iz mikrookolja presadka, kot so vnetje, imunska zavrnitev alogenskega presadka in presnovni stres, povzročijo apoptozo in nekrozo presajenih celic, kar povzroči progresivno izgubo presadka [1]. Zato je izboljšanje proliferacije presajenih celic ključnega pomena za uspeh zdravljenja sladkorne bolezni na podlagi presaditve otočkov.
Signalizacija transformirajočega rastnega faktorja beta (TGF-) igra pleiotropno vlogo v številnih bioloških procesih. Transdukcija signala se začne z vezavo liganda TGF na njegov receptor tipa 2 TGFBR2. Slednji rekrutira in aktivira receptor tipa 1 TGFBR1 s fosforilacijo. Aktivirani TGFBR1 nadalje fosforilira receptorsko regulirane proteine Smad (R-Smads), Smad2 in Smad3. R-Smadi tvorijo kompleks s Smad4, ki se translocira v jedro za transkripcijsko uravnavanje ciljnih genov [4, 5]. Poroča se, da otoček trebušne slinavke vzdržuje univerzalno aktivirano TGF-signalizacijo, kar je razvidno iz relativno visoke ravni fosforiliranega Smad2/3 v fizioloških pogojih. Vendar pa se kot odgovor na potrebo po insulinu TGF-signalna aktivnost zmanjša, spremlja pa jo povečana celična proliferacija [6]. Poleg tega farmakološka inhibicija signalizacije TGF spodbuja celično proliferacijo in vitro in in vivo [7, 8]. Še pomembneje je, da izbris Smad3 povzroči močnejšo celično proliferacijo v primerjavi z izbrisom Smad2 pri miših z delno pankreatektomijo, kar kaže, da je Smad3, ne pa Smad2, primarni efektor za signalizacijo TGF za uravnavanje celične proliferacije [6]. Kasnejše študije kažejo, da Smad3 zavira celično proliferacijo z indukcijo izražanja inhibitorjev ciklin-odvisne kinaze (CDKI), vključno s p16, p21 in p57 [7, 8].
Naše nedavno delo je tudi pokazalo, da izbris Smad3 pri miših db/db (Smad3KO-db/db) preprečuje nastanek očitnega diabetesa brez debelosti, hiperglikemije, insulinske rezistence in intolerance za glukozo. Zanimivo je, da miši Smad3KO-db/db kažejo hiperplazijo otočkov z znatno povečano celično proliferacijo in vztrajno hiperinzulinemijo [9]. To pomeni, da je Smad3 patogen pri sladkorni bolezni in ciljanje na Smad3 v celicah lahko predstavlja novo nadomestno terapijo celic ali otočkov za sladkorno bolezen. To je bilo preučeno v tej študiji z uporabo presaditve otočkov Smad3 knockout (Smad3KO) pri diabetičnih miših tipa -1, ki jih povzroča streptozocin (STZ), in pri miših s sladkorno boleznijo db/db tipa -2.
Cistanche dodatki
Rezultati
1. Presaditev otočkov Smad3KO je dala boljši terapevtski učinek na sladkorno bolezen tipa -1, ki jo povzroča STZ
Za primerjavo terapevtske učinkovitosti otočka Smad3KO v primerjavi s otočkom Smad3WT pri sladkorni bolezni smo najprej izvedli singensko presaditev otočkov pod ledvično kapsulo diabetičnih miši, ki jih povzroča STZ, kjer hiperglikemijo povzroča pomanjkanje celic. Diabetične miši 7. dan po injiciranju STZ so bile presajene s 3 odmerki otočkov (50, 100 in 200 otočkov na miš), ki so bili sveže izolirani iz miši Smad3WT ali Smad3KO. Tako naključno raven glukoze v krvi (RBG) kot na tešče (FBG) so spremljali tedensko 16 tednov. Odmerki za presaditev so bili izbrani na podlagi predhodnih ugotovitev, da presaditev 300 otočkov zadostuje za hitro obnovitev evglikemije pri miših z osiromašenimi celicami [10]. Kot je prikazano na slikah 1A do D, so diabetične miši z lažno operacijo razvile vztrajno hiperglikemijo v 16 tednih. Presaditev z majhnim odmerkom (50 otočkov) otočkov Smad3KO ali WT ni uspela zmanjšati ravni RBG in FBG. Vendar so miši s sladkorno boleznijo, ki so prejele 100 otočkov Smad3KO, vendar ne enakega odmerka otočkov Smad3WT, postopoma obnovile normalno RBG in FBG, podobno tistim, ki so prejele 200 otočkov Smad3KO ali WT. Ugotovili smo tudi, da se učinek znižanja glukoze v krvi pripisuje izključno presajenim otočkom, saj se je hiperglikemija ponovila takoj, ko je bila ledvica, ki nosi otoček, odstranjena od 16. tedna dalje (puščica, slika 1A).
Motena toleranca za glukozo se je razvila tudi pri navidezno operiranih diabetičnih miših, ki se je znatno zmanjšala s presaditvijo visokega odmerka (200) otočkov Smad3KO ali WT in 100 otočkov Smad3KO, ne pa tudi z nizkim odmerkom 50 otočkov Smad3KO ali WT in 100 Otočki Smad3WT (slika 1E in G). Kot je bilo pričakovano, diabetične miši, ki jih povzroča STZ, niso razvile insulinske rezistence.
V nasprotju s tem so pri hiperglikemičnih miših z lažno operacijo ali neučinkovito terapijo s 50 otočki Smad3WT ali KO in 100 otočki Smad3WT opazili podaljšan odziv na insulin (slika 1F in H). V skladu z obnovljeno evglikemijo in izboljšano intoleranco za glukozo so diabetične miši, ki so jim dali 200 otočkov Smad3KO ali WT in 100 otočkov Smad3KO, vendar ne 50 otočkov Smad3KO ali WT in 100 otočkov Smad3WT, pokazale znižano raven HbA1c v krvi, ki jo je spremljala povišana raven insulina (slika 1 I in J). Poleg tega je sladkorna bolezen, ki jo povzroča STZ, povzročila zastoj rasti, ki je bila delno obnovljena pri miših, ki so jim bile presajene 200 otočkov Smad3KO ali WT in 100 otočkov Smad3KO (slika S1). Poleg tega se je pri miših s sladkorno boleznijo, ki jih povzroča STZ, po 16 tednih razvila tudi diabetična nefropatija, kar je razvidno iz mezangialne ekspanzije, intersticijske fibroze, proteinurije in povečanega serumskega kreatinina (slika 2). Zanimivo je, da je zdravljenje s 100 otočki Smad3KO, vendar ne s 100 otočki Smad3WT, povzročilo zaščito pred razvojem diabetične bolezni ledvic, čeprav je bilo to opazno tudi pri diabetičnih miših, zdravljenih z visokim odmerkom 200 otočkov Smad3KO ali WT (slika 2). Te ugotovitve kažejo boljšo terapevtsko učinkovitost otočkov Smad3KO pri sladkorni bolezni, ki jo povzroči STZ, in kažejo na približno 50-odstotno zmanjšanje otočkov, ki je potrebno za doseganje kompetentnega nadzora glikemije in zaščite pred diabetično poškodbo ledvic z uporabo nadomestne terapije s pomanjkanjem Smad{34}}otočkov za diabetes.
2. Presaditev otočkov Smad3KO je povzročila boljši terapevtski učinek na sladkorno bolezen tipa -2 pri miših db/db
Poročali so, da presaditev otočkov izboljša T2DM pri modelu miši, hranjenih z visoko vsebnostjo maščob, ki so bile izzvane z nizkim odmerkom STZ [11]. Nato smo raziskali, ali ima presaditev otočkov Smad3KO tudi boljši terapevtski učinek na T2DM z zdravljenjem miši db/db z 250 otočki Smad3KO ali WT od preddiabetične starosti od 4. do 12. tedna. Ugotovili smo, da presaditev s Smad3KO ali WT otočki niso vplivali na rast prejemnih miši db/db (slika S2). Čeprav so miši db/db, ki so prejele presaditev otočkov Smad3WT, pokazale trend zmanjšanja RBG in FBG v primerjavi z navidezno operiranimi db/db mišmi, so miši db/db, presajenim z enakovrednim odmerkom otočkov Smad3KO, pokazale znatno zmanjšanje RBG in FBG (slika 3A in B). Intoleranca za glukozo, ki se je razvila pri miših db/db, se je znatno izboljšala s presaditvijo otočkov Smad3KO, ne pa tudi s presaditvijo otočkov Smad3WT, čeprav insulinska rezistenca ni bila spremenjena (slika 3C-F). Dosledno, v primerjavi s presaditvijo otočkov Smad3WT ali navidezno operacijo, so miši db/db, zdravljene s presaditvijo otočkov Smad3KO, prav tako pokazale znatno znižanje ravni HbA1c v krvi, ki ga je spremljalo opazno povečanje ravni insulina v krvi (slika 3G in H). Poleg tega je zdravljenje z 250 otočki Smad3KO znatno oslabilo glomerularno mezangialno ekspanzijo (slika 4). Ker pa pri miših db/db pri starosti 12 tednov niso opazili pomembnih sprememb serumskega kreatinina, proteinurije in ledvične fibroze, pri miših db/db, zdravljenih z otočki Smad3KO ali WT, niso našli očitnih sprememb teh parametrov (slika 4). Skupaj ti podatki znova kažejo, da presaditev otočkov Smad3KO povzroči boljše zdravljenje kot otočki Smad3WT pri diabetičnih db/db miših tipa -2.
3. Pomanjkanje Smad3 pospešuje celično proliferacijo v cepljenih otočkih pri diabetičnih miših, ki jih povzroča STZ, in db/db miših.
Nato smo raziskali možne mehanizme, s katerimi presaditev otočkov Smad3KO povzroči boljši terapevtski učinek na T1DM in T2DM. Najprej smo pregledali celično maso v cepljenih otočkih z imunskim barvanjem z insulinom. Pri sladkorni bolezni, ki jo povzroča STZ, nismo uspeli odkriti obstoja inzulinsko pozitivnih celic pod ledvično kapsulo pri miših, ki so jim cepili 50 otočkov Smad3KO ali WT v 16. tednu po presaditvi, kar kaže na izgubo celic. Nepričakovano so diabetične miši, ki so prejele 100 otočkov Smad3WT, pokazale le nekaj razpršenih celičnih grozdov, ki proizvajajo insulin, vendar se je to močno povečalo pri diabetičnih miših, zdravljenih s 100 otočki Smad3KO, kar je povzročilo skoraj 17--kratno povečanje celične mase (slika 5A in B). Zanimivo je, da so diabetične miši, ki so prejele visok odmerek 200 otočkov Smad3KO ali WT, pokazale podobno celično maso (sliki 5A in B). Te ugotovitve so bile skladne z od odmerka odvisnim učinkom presaditve otočkov na hiperglikemijo, kot je prikazano na slikah 1A in B.
Nato smo raziskali, ali je povečana celična masa v presadkih otočkov Smad3KO povezana s povečano celično proliferacijo. Dvobarvna imunofluorescenca je pokazala, da so miši, zdravljene s 100 otočki Smad3WT, v 16. tednu po presaditvi otočkov pokazale nezaznavne ali redke celice PCNA plus insulin plus, kar je bilo predvsem povečano pri tistih, ki so prejele 100 otočkov Smad3KO ali visok odmerek 200 Smad3KO ali WT otočki (sliki 5C in D). Nato smo raziskali, ali Smad3 nadzoruje zgodnjo celično proliferacijo v cepljenih otočkih v progresivnih diabetičnih stanjih z označevanjem BrdU 7. dan po presaditvi otočkov, ko so ravni glukoze v krvi ostale visoke. Označevanje BrdU je razkrilo 3-kratno povečanje BrdU plus insulin plus celice v 100 presadkih otočkov Smad3KO v primerjavi z enakim odmerkom presadkov otočkov Smad3WT (sliki 5E in F). Ta ugotovitev kaže, da pomanjkanje Smad3 v veliki meri spodbuja celično proliferacijo skozi S-fazo celičnega cikla v hiperglikemičnih pogojih, kar prispeva k 17-kratnemu povečanju celične mase, kot je razvidno v 16. tednu po presaditvi otočkov (sliki 5A in B) . Vse te ugotovitve skupaj kažejo, da pomanjkanje Smad3 v veliki meri spodbuja celično proliferacijo in s tem obnovi evglikemijo pri sladkorni bolezni tipa -1, ki jo povzroči STZ.
Podobno so bile odkrite tudi visoke celične proliferativne aktivnosti v presadkih otočkov Smad3KO pri miših s sladkorno boleznijo tipa -2 db/db, kar je razvidno iz 5-kratnega povečanja celične mase v primerjavi s tistimi z presadki otočkov Smad3WT na starosti 12 tednov po presaditvi otočkov (sliki 6A in B), kar je bilo povezano z 25-kratnim povečanjem insulina plus PCNA plus celic (sliki 6C in D). Z uporabo označevanja z BrdU smo zaznali tudi 3-kratno povečanje inzulina in BrdU plus celic v presadkih otočkov Smad3KO 7. dan po presaditvi pri 12-teden starih db/db miših (slika 6E in F). Ta ugotovitev ponovno potrjuje, da so celice brez Smad3 odporne na hiperglikemijo in ostajajo visoko proliferativne za vzdrževanje celične mase za izboljšanje T2DM.
4. Pomanjkanje Smad3 spodbuja celično proliferacijo in vitro
Poročali so, da farmakološka inhibicija TGFBR1 spodbuja celično proliferacijo in vitro [7, 8]. Zato smo raziskali, ali genetska delecija Smad3 spodbuja tudi celično proliferacijo z gojenjem celic otočkov Smad3KO in WT, ki jim sledi označevanje BrdU. Dvojna imunofluorescenca je pokazala, da imajo otočne celice brez Smad3 znatno višjo raven BrdU-pozitivnih celic (5,7 odstotka) v primerjavi s celicami otočkov Smad3WT (2,4 odstotka) (sliki 7A in B). Povečana proliferacija celic Smad3KO je bila dokazana tudi s povečano ekspresijo PCNA, kot je pokazala Western blot analiza (slika 7C), kar potrjuje ključno regulativno vlogo Smad3 pri celični proliferaciji.
5. RNA-seq identificira E2F3 kot ciljni gen Smad3, ki uravnava celično proliferacijo
Da bi odkrili spodnji mehanizem Smad3 pri uravnavanju celične proliferacije, smo izvedli RNA-seq v otočkih, izoliranih iz db/m ali db/db miši z ali brez delecije gena Smad3, vključno s Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT -db/m in miši Smad3KO-db/m, kot je opisano prej [9]. Analiza obogatitve poti je bila izvedena med diferencialno izraženimi geni (DEG) med otočki Smad3WT in Smad3KO v ozadju db/m ali db/db. V genetskem ozadju db/db je Smad3KO povzročil znatne spremembe v genih ali poteh, povezanih s celičnim ciklom, kot je razkrila analiza GO in KEGG (slika 8A in slika S3). Glede na posamezne gene je analiza RNA-seq pokazala povečanje izražanja genov, ki vključujejo ciklin, od ciklina odvisne kinaze (CDK) in družino beljakovin cikla celične delitve (CDC) v otočkih Smad3KO-db/db v primerjavi s Smad3WT-db /db otočkov, kar je bilo nadalje potrjeno v gojenih celicah otočkov Smad3KO z RT-PCR (slika S4 A in C). Nasprotno pa v genetskem ozadju db/m Smad3KO ni povzročil opaznega vpliva na gene ali poti, povezane s celičnim ciklusom (slika S3B in C). Poročajo, da signalizacija TGF-/Smad3 negativno uravnava celični cikel z indukcijo od ciklina odvisnih kinaznih inhibitornih genov (CDKI) [7, 8, 12]. Presenetljivo je, da nobeden od teh genov CDKI ni bil potlačen v otočkih Smad3KO-db/db in vivo in gojenih celicah otočkov Smad3KO, kot sta razkrila RNA-seq oziroma RT-PCR (slika S4B in C). V nasprotju s tem so bile stopnje izražanja več genov CDKI, kot so p16, p18 in p57, celo povečane v kultiviranih celicah otočkov Smad3KO (slika S4C). To pomeni, da v Smad3-regulirani celični proliferaciji obstaja alternativni mehanizem.
Tako smo analizirali potencial vezave Smad3 za promotorske sekvence 224 DEG v izrazu GO celičnega cikla s programsko opremo brskalnika ECR (slika 8A). Med njimi je en gen z imenom E2F3 pritegnil našo pozornost, saj je ključni in terminalni izvajalec, ki uravnava vstop G1/S v celični cikel [13, 14]. Našli smo potencialno mesto vezave Smad3 v promotorju mišjega lokusa E2F3, ki je ohranjen tudi pri ljudeh (slika 8B).
Cistanche tubulosa
Da bi raziskali, ali je E2F3 bistven za Smad3-regulirano celično proliferacijo, smo preučili povezavo med E2F3 in Smad3 v otočkih. V skladu z RNA-seq je imunohistokemija odkrila, da je bila ekspresija E2F3 močno zmanjšana v otočkih miši Smad3WT-db/db, vendar močno povečana pri miših Smad3KO-db/db (slika 8C). Poleg tega so povečano izražanje E2F3 opazili tudi v gojenih celicah otočkov Smad3KO na ravni RNA in beljakovin (slika 8 DF). Nasprotno pa je z adenovirusom posredovana tišina E2F3 razveljavila proliferativno aktivnost celic (insulinplusBrdUplus) v celicah otočkov Smad3KO (slika 9), kar razkriva bistveno vlogo E2F3 pri Smad3-regulirani celični proliferaciji.
Za nadaljnjo potrditev napovedane vezave Smad3 v promotorju E2F3 smo izvedli kromatinsko imunoprecipitacijo (ChIP) v izoliranih mišjih otočkih (slika 10A). Specifičnost protitelesa Smad3, uporabljenega za ChIP, je bila prvotno potrjena z imunoprecipitacijo v mišjih otočkih (slika 10B). ChIP PCR je potrdil vezavo Smad3 na promotor E2F3 kot protitelo proti Smad3, vendar noben nespecifični izotip IgG ni uspešno oboril fragmenta kromatina, ki ustreza promotorju E2F3 (slika 10C). Kvantitativna RT-PCR je pokazala 6-kratno obogatitev zaporedja promotorja E2F3 v testu ChIP s protitelesom Smad3 v primerjavi z izotipom IgG (slika 10D), kar dokazuje, da se lahko Smad3 veže na regijo promotorja genomskega lokusa E2F3 .
Da bi potrdili funkcionalni pomen vezave Smad3 na promotor E2F3, smo izdelali reporterski vektor luciferaze, ki ga poganja mišji promotor E2F3, ki vsebuje mesto vezave Smad3 ali njegovo mutirano obliko (slika 10E). Test dvojne luciferaze v celicah HEK293T je razkril močno transkripcijo luciferaze, ki jo poganja klonirani promotor E2F3, ki je bil znatno inhibiran s prekomerno ekspresijo Smad3. Vendar pa je mutacija vezavnega mesta Smad3 razveljavila inhibitorni učinek Smad3 (slika 10F). Te ugotovitve so zagotovile neposredne dokaze za supresivno vlogo Smad3 pri transkripciji E2F3 z vezavo na njegov promotor.
V tej študiji smo dokazali, da ima presaditev otočkov s pomanjkanjem Smad3- boljši terapevtski učinek na sladkorno bolezen in diabetično poškodbo ledvic pri miših s sladkorno boleznijo, ki jih povzroča STZ, in miših db/db. Pri sladkorni bolezni, ki jo povzroča STZ, je presaditev 100 otočkov Smad3KO, ne pa tudi 100 otočkov Smad3WT, povzročila 17-kratno povečanje celične mase, kar je bilo povezano z znatnim povečanjem ravni insulina v krvi in s tem izboljšano intoleranco za glukozo in povrnitev evglikemije, kar je povzročilo za zaščito pred diabetično poškodbo ledvic.
Podobne rezultate so našli tudi pri T2DM pri miših db/db, pri katerih je presaditev z 250 otočki Smad3KO, vendar ne z enakim odmerkom otočkov Smad3WT, prav tako povečala 5-kratno celično maso in povzročila boljši nadzor glikemije. Te ugotovitve kažejo, da je pomanjkanje Smad3 odporno na diabetična mikrookolja in v veliki meri spodbuja širjenje celic cepljenih otočkov in proizvodnjo insulina, da se pokaže boljši nadzor glikemije. Zanimivo je, da smo tudi ugotovili, da lahko zdravljenje s 100 otočki Smad3KO povzroči enako kontrolo glikemije kot uporaba 200 otočkov Smad3WT ali KO pri sladkorni bolezni, ki jo povzroči STZ. Ta ugotovitev nakazuje, da lahko pomanjkanje Smad3 v veliki meri zmanjša (vsaj 50 odstotkov) število otočkov, potrebnih za uspešno vzpostavitev neodvisnosti od insulina pri nadomestni terapiji celic otočkov za T1DM. Te ugotovitve so v skladu s prejšnjim poročilom, da predobdelava otočkov s SB-431542, zaviralcem TGFBR1, spodbuja proliferacijo in delovanje celic po presaditvi [15]. Ker pa ima Smad2 tudi bistveno vlogo pri z glukozo stimuliranem sproščanju insulina v celicah [16], je lahko ciljanje na Smad3, ne pa navzgor na TGFBR1 v otočkih (celicah), bolj ugodno za nadomestno celično zdravljenje sladkorne bolezni. Tako lahko presaditev otočkov s pomanjkanjem Smad3- predstavlja klinično novo terapijo tako za T1DM kot T2DM. Poleg tega bi zdravljenje z otočki Smad3KO lahko zaščitilo tudi pred diabetično poškodbo ledvic pri 16 tednih T1DM, čeprav to ni globoko pri T2DM zaradi minimalne diabetične poškodbe ledvic, ki se pojavi pri miših db/db pri starosti 12 tednov.
Mehansko smo ugotovili, da Smad3 deluje tako, da zavira E2F3, da zavira celično proliferacijo. To podpirajo dokazi, da promotor E2F3 vsebuje funkcionalno vezavno mesto Smad3, kar je potrjeno s ChIP in reporterskim testom luciferaze. Celice otočkov brez Smad3 so pokazale povečano proliferacijo v mehanizmu, odvisnem od E2F3-, saj je knockdown E2F3 odpravilo to proliferativno aktivnost. E2F3 spada v družino E2F in je kritična komponenta mehanizma Rb-E2F, ki ureja vstop v celični cikel G1/S [13]. E2F so transkripcijski faktorji in končni izvajalci za uravnavanje genov, ki orkestrirajo napredek celičnega cikla [14]. Dokazano je, da prekomerna ekspresija E2F3 spodbuja celično proliferacijo v otočkih glodalcev in ljudi [17]. Ugotovitve, da Smad3 transkripcijsko cilja na E2F3 za zatiranje celičnega cikla v celicah, zagotavljajo nov regulativni mehanizem za celično proliferacijo. Tako motnje Smad3 v celicah otočkov spodbujajo celično proliferacijo, odvisno od E2F3-, kar dokazuje izrazito povečanje števila celic PCNA plus ali BrdU plus, ki proizvajajo inzulin, kar kaže, da zdravljenje s subterapevtskim odmerkom otočkov Smad3KO zadostuje za razširitev celic maso in zavira tako T1DM pri STZ-induciranih miših kot T2DM pri db/db miših.
Herba CistancheinIzvleček Cistanche
Poročajo, da ima signalizacija TGF ključno vlogo pri razvoju in delovanju celic otočkov trebušne slinavke, zaustavi celični cikel in povzroči celično apoptozo z indukcijo CDKI [7, 8, 18]. Na naše presenečenje so poskusi in vivo in in vitro pokazali, da transkripcija CDKI ni bila spremenjena ali celo povečana na otočkih Smad3KO (slika S4). To neskladje je mogoče pripisati različnim poskusnim pogojem. Rezultati v trenutni študiji so bili pridobljeni iz miši Smad3KO (otočki). Vendar prejšnje študije temeljijo na farmakološki inhibiciji TGFBR1, ki bo vplivala na celotno signalizacijo TGF [7, 8]. Poleg tega smo uporabili vzorce otočkov iz mladih odraslih miši (starost 8-10 tednov), medtem ko so bili otočki iz relativno starih živali ali darovalcev trupel starejših ljudi uporabljeni v prejšnjih študijah [7, 8]. Ker celice otočkov kažejo s starostjo povezano kopičenje CDKI [19], so lahko CDKI v starih celicah bolj občutljivi na inhibicijo signalizacije TGF.
V tej študiji je bilo več omejitev. Prvič, učinkovitost presaditve otočkov je raziskana v modelu miši s sladkorno boleznijo, ki jo povzroča STZ, brez avtoimunske reakcije. Zato je treba prednost Smad3KO pred zdravljenjem z otočki Smad3WT za sladkorno bolezen v prihodnosti preveriti tudi v avtentičnem modelu T1DM. Drugič, ugotovitve iz te študije temeljijo na celični terapiji Smad3KO, ki zajema celoten otoček, ne pa na celici. Ni jasno, ali bi druge vrste celic, razen celic v otočku, izvajale vlogo, odvisno od Smad3-, za modulacijo celične proliferacije z medceličnimi preslušavalnimi potmi. Zato so upravičene nadaljnje študije s celično specifičnim Smad3KO. Poleg tega je treba ugotovitve te študije preveriti v vzorcih človeških otočkov, da se dokaže njihov klinični pomen.
Reference
1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Klinična transplantacija otočkov trebušne slinavke. Nat Rev Endocrinol. 2017; 13: 268-77.
2. Jacobson EF, Tzanakakis ES. Diferenciacija človeških pluripotentnih izvornih celic v funkcionalne celice trebušne slinavke za zdravljenje sladkorne bolezni: inovacije, izzivi in prihodnje usmeritve. J Biol Eng. 2017; 11:21.
3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S, et al. Histološka ocena presadka po klinični presaditvi otočkov. Presaditev. 2009; 88: 1286-93.
4. Lan HY. Različne vloge TGF-beta/Smads pri ledvični fibrozi in vnetju. Int J Biol Sci. 2011; 7: 1056-67.
5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. TGF-beta/Smad signalizacija pri ledvični fibrozi. Front Physiol. 2015; 6: 82.
6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K, et al. Smad signalizacijsko omrežje uravnava proliferacijo celic otočkov. Sladkorna bolezen. 2014; 63: 224-36.
7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. Inhibicija signalizacije TGF-beta spodbuja replikacijo beta-celic trebušne slinavke. Sladkorna bolezen. 2016; 65: 1208-18.
8. Wang P, Karakose E, Liu H, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanic V, et al. Kombinirana inhibicija poti DYRK1A, SMAD in tritoraksa sinergizira, da inducira močno replikacijo v odraslih človeških beta celicah. Cell Metab. 2019; 29: 638-52 e5.
9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH, et al. Pomanjkanje Smad3 spodbuja proliferacijo in delovanje celic beta pri miših db/db z obnavljanjem izražanja Pax6. Teranostika. 2021; 11: 2845-59.
10. Zmuda EJ, Powell CA, Hai T. Metoda za izolacijo mišjih otočkov in subkapsularno presaditev ledvic. J Vis Exp. 2011.
11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH, et al. Presaditev izotransplantata otočkov izboljša občutljivost za insulin pri mišjem modelu sladkorne bolezni tipa 2. Endokrine. 2021; 72: 660-71.
12. Vijayachandra K, Higgins W, Lee J, Glick A. Indukcija p16ink4a in p19ARF s TGFbeta1 prispeva k zaustavitvi rasti in odzivu na staranje v mišjih keratinocitih. Mol Carcinog. 2009; 48: 181-6.
13. Dyer MA, Cepko CL. Regulacija proliferacije med razvojem mrežnice. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 333-42.
14. Dyson N. Regulacija E2F s proteini družine pRB. Genes Dev. 1998; 12: 2245-62.
15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J, et al. Prehodna supresija signalizacije receptorja TGFbeta olajša presaditev človeških otočkov. Endokrinologija. 2016; 157: 1348-56.
16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. Motnje SMAD2 v mišjih beta celicah trebušne slinavke vodijo do hiperplazije otočkov in oslabljenega izločanja inzulina zaradi oslabitve aktivnosti K plus kanala, občutljivega na ATP. Diabetologija. 2014; 57: 157-66.
17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Wang Q, Wang Y, Salmon P, et al. Prekomerna ekspresija E2F3 spodbuja proliferacijo funkcionalnih človeških beta celic brez indukcije apoptoze. Celični cikel. 2013; 12: 2691-702.
18. Zhang Y, Alexander PB, Wang XF. Družinsko signaliziranje TGF-beta pri nadzoru celične proliferacije in preživetja. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017; 9.
19. Wang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Scott DK, Garcia-Ocana A, Stewart AF. Diabetes mellitus--napredek in izzivi pri proliferaciji človeških celic beta. Nat Rev Endocrinol. 2015; 11: 201-12.
20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H, et al. Ciljna motnja SMAD3 povzroči oslabljeno imunost sluznice in zmanjšano odzivnost T-celic na TGF-beta. EMBO J. 1999; 18: 1280-91.
21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. Protokol za izolacijo otočkov iz mišje trebušne slinavke. Nat Protoc. 2009; 4: 1649-52.
22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Presaditev otočkov trebušne slinavke v ledvično kapsulo diabetičnih miši. J Vis Exp. 2007: 404.
23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q, et al. Delecija Smad3 preprečuje ledvično fibrozo in vnetje pri diabetični nefropatiji tipa 2. Presnova. 2020; 103: 154013.
Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 in Hui-Yao Lan2,7
1 Raziskovalni center za integrirano medicino in oddelek za nefrologijo, pridružena bolnišnica tradicionalne kitajske medicine Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Kitajska.
2. Oddelek za medicino in terapevtiko in Inštitut zdravstvenih ved Li Ka Shing, Kitajska univerza v Hong Kongu, Hong Kong, 999077, Kitajska.
3. Skupni laboratorij Guangdong-Hong Kong za imunološke in genetske ledvične bolezni, Ljudska bolnišnica province Guangdong, Akademija medicinskih znanosti Guangdong, Guangzhou, Guangdong, 510080, Kitajska.
4. Državni ključni laboratorij za bioelektroniko, Jiangsu Key Laboratory for Biomaterials and Devices, School of Biological Sciences & Medical Engineering, Southeast University, Nanjing, Kitajska.
5. Ključni laboratorij za preprečevanje in obvladovanje kronične ledvične bolezni mesta Zhanjiang, Inštitut za nefrologijo, pridružena bolnišnica medicinske univerze Guangdong, Zhanjiang, Guangdong, 524001, Kitajska.
6. Nacionalna baza za klinične raziskave tradicionalne kitajske medicine, pridružena bolnišnica tradicionalne kitajske medicine Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Kitajska.
7. CUHK-Guangdong Provincialna ljudska bolnišnica Skupni raziskovalni laboratorij za imunološke in genetske ledvične bolezni, Kitajska univerza v Hong Kongu, Hong Kong, 999077, Kitajska.