Del Ⅰ Učinki prehranskih beljakovin in vlaknin na rast, pojav protina, črevesne mikrobne skupnosti in imunoregulacijo v črevesni osi goslingov

Povzetek

Sedanja študija je ovrednotila učinke prehranskih beljakovin in vlaknin na rast, pojav protina, črevesne mikrobne skupnosti in imunoregulacijo v osi črevesje-ledvice gosičkov. Popolnoma randomizirana faktorska zasnova 2 £ 3 je bila sprejeta z 2 ravnema CP (180 [18 CP] in 220 [22 CP] g/kg) in 3 ravnmi surove vlaknine (CF) (30 [nizka CF], 50 [srednja CF], in 70 [visok CF] g/kg). Diete z visokim CP ali nizkim CF so goske nagnile k protinu. Diete z visoko vsebnostjo beljakovin so poslabšale delovanje ledvic; serumske koncentracije UA in Cr ter aktivnost XOD pri 9-dnevnih goskah, hranjenih z 22-odstotno hrano CP, so se znatno povečale. Čeprav ravni CF od 3 do 7 odstotkov niso neposredno vplivale na zdravje ledvic, lahko zvišanje ravni CF pospeši povečanje probiotikov v cekumu gosk in zadrži škodljive bakterije, kar ublaži črevesno disbiozo, ki jo povzročajo diete z visoko vsebnostjo beljakovin. Analiza cekalne mikrobiote s sekvenciranjem 16Sr RNA je pokazala, da je bila številčnost Enterococcusa v skupini 22CP višja kot v skupini 18CP, vendar se je zmanjšala z naraščanjem ravni CF na dan 9. Številčnost Lactobacillus se je povečevala z naraščanjem ravni CF. Poleg tega so višje serumske koncentracije LPS in proinflamatornih citokinov ter povečane ravni ekspresije mRNA v cekumu, tonzilah in tkivih ledvic pokazale, da lahko diete z visoko vsebnostjo beljakovin aktivirajo pot TLR4/MyD88/NFkB in inducirajo črevesno in ledvično vnetje pri mladih goskah. Ugotovljeno je bilo, da se serumske koncentracije LPS na d 9 zmanjšujejo z naraščajočo CF, čeprav spreminjanje prehranskih ravni CF ni neposredno vplivalo na serumske imunske indekse gosk. Skratka, prehrana z visokim CP je imela negativen učinek na pojav protina, mikrobne skupnosti in imunoregulacijo v osi črevesje-ledvice pri goskah, medtem ko je ustrezno povečana raven prehranskih vlaknin pomagala vzdrževati črevesno ravnovesje in zmanjšala koncentracijo LPS v serumu. Kot optimalno kombinacijo za krmo gosi predlagamo prehrano z 18 odstotki CP v kombinaciji s 5 odstotki CF.

Ključne besede

surove vlaknine, beljakovine, goslji protin, črevesne mikrobne združbe, črevesje-ledvična os,Koristi Cistanche.

Kliknite tukaj, če želite izvedetikakšni so učinki zdravila Cistanche na ledvice

Uvod

Gosi, ki so rastlinojede, so za opravljanje običajnih dejavnosti odvisne od prehranskih vlaknin. Znano je, da zmerne ravni surovih vlaken (CF) v prehrani povečujejo odpornost proti boleznim in spodbujajo rast pri perutnini z moduliranjem črevesnega mikroekološkega ravnovesja in krepitvijo imunskih funkcij (Jha in Mishra, 2021) Wils-Plotz et al. (2013). poročali, da je vključitev prehranskega pektina povečala ekspresijo IL- 12 v sluznici ileuma in povečala proizvodnjo interferona-g v tonzilah cekuma. Več študij je pokazalo, da dieta z nizko vsebnostjo CF zmanjša mikrobno raznovrstnost kot tudi relativno številčnost koristne mikrobiote v cecah gosi na dan 70, s čimer negativno vpliva na rast, izrabo hranil in imunost črevesne sluznice teh gosi (Li et al., 2017; Li et al., 2018a). Prehranski CF lahko pomaga vzdrževati funkcijo črevesne pregrade s krepitvijo strukture in delovanja sluznice ter s povečanjem populacije in raznolikosti komenzalnih bakterij v prebavnem traktu. Še pomembneje je, da so mlade ptice domnevno bolj občutljive na spremembe prehranskih hranil in črevesnih mikrobnih skupnosti kot odrasle (Gao et al., 2017). Vendar pa je študij o vplivu prehranskih ravni CF na črevesno mikrobioto in odpornost na bolezni pri goskah malo.

Učinkovitost rasti pri pticah je manj občutljiva na spremembe ravni beljakovin kot na spremembe prehranske energije v krmi, da se zadovolji njihova prvotna voljna narava (Shi et al., 2006). Poročali so, da pri goskah z vsebnostjo beljakovin v prehrani med 16 in 22 odstotki ni bilo opaziti pomembne razlike v povečanju telesne mase, kar se zdi preveč splošno (Summers et al., 1986). Nasprotno pa koncentracije prehranskih beljakovin močno vplivajo na ravnovesje črevesne flore in odpornost perutnine na bolezni (Lee et al., 2020). Visceralni protin, ki se pojavlja predvsem pri pticah, je presnovna bolezen, ki nastane zaradi okvarjenega delovanja ledvic, čemur sledi kopičenje uratnih kristalov v različnih organih (Zhang et al., 2018). Naša prejšnja študija je pokazala, da so diete z visoko vsebnostjo beljakovin vpletene v poškodbo ledvic in disbiozo črevesne mikrobiote, povezano s protinom pri goskah (Xi et al., 2020a). Rezultati te študije so pokazali, da so v primerjavi z gosi, hranjenimi s 16- in 18-odstotnimi surovimi beljakovinami (CP), gosi, hranjenimi z 22-odstotnimi dietami CP, utrpeli poškodbo črevesnih epitelijskih celic in disbiozo cekalne mikrobiote, kar je povzročilo poškodbo ledvic ali celo gosji protin. Zdi se, da imajo mikrobiota prebavnega trakta in njeni metaboliti osrednjo vlogo pri krepitvi imunosti osi črevesje-ledvice pri perutnini (De Cesare et al., 2019; Xi et al., 2020b). Tako lahko določitev ustreznega prehranskega programa, ki se osredotoča na učinke prehranskih ravni CF in CP, pomaga zmanjšati incidenco protina in okrepiti imunost z vzdrževanjem mikroekološkega ravnovesja črevesja in izboljšanjem relativne imunske regulacije pri goskah.

Črevesni mikrobiom močno vpliva na imunsko regulacijo črevesja, kar vpliva na sistemsko imunost in prispeva k imunskemu ravnovesju. Spremembe v sestavi prehrane, vključno z ravnmi CP in CF, vplivajo na sestavo in presnovne aktivnosti mikrobiote, ki se prilagaja črevesnemu okolju (Liu et al., 2014). Pri perutnini lahko vsaka motnja mikrobioma povzroči neravnovesje v sistemski imunosti, kar prispeva k zmanjšanju odpornosti proti boleznim. V naši prejšnji študiji smo ugotovili, da je disbioza črevesne mikrobiote povečala tveganje za visceralni protin pri goskah s povečanjem vnetja in translokacijo iz črevesja pridobljenega lipopolisaharida (LPS) v osi črevesje-ledvice. V tej zapleteni kaskadi ligacija LPS aktivira jedrski faktor, ojačevalec kapa-lahke verige aktivirane B-celične (NF-kB) poti in proizvodnjo protivnetnih citokinov, kot sta interlevkin 1b (IL1b) in faktor tumorske nekroze a (TNFa), s čimer spodbuja razvoj imunološke tolerance tako v črevesju kot v ledvicah gosk (Xi in sod., 2019). Ta študija se je osredotočila na preiskovanje mikrobnih skupnosti, ki živijo v cekumu gosk, hranjenih z različnimi ravnmi prehranskega CP in CF, in merila spremembe v pojavnosti protina z analizo imunoregulacije in vnetnih odzivov, povzročenih v osi črevesje-ledvice.

Standardizirana Cistanche

Materiali in metode

1. Etična odobritev

Študijo je odobril raziskovalni odbor Jiangsu Academy of Agricultural Sciences in je bila izvedena v skladu s predpisi uprave za zadeve v zvezi s poskusnimi živalmi (odredba št. 63 Jiangsu Academy of Agricultural Science z dne 8. julija 2014). Vsi poskusi so bili izvedeni po smernicah ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments).

2. Eksperimentalno načrtovanje

Ta študija je bila izvedena od 2. do 17. novembra, 2020, v Eksperimentalnem živalskem centru Akademije kmetijskih znanosti Jiangsu (Nanjing, Kitajska). Skupaj 1,620 enodnevnih gosi Taizhou (Anser domestica, 100 odstotkov,), ki jih je dobavilo podjetje Tianzhijiao Breeding Geese Limited Company (Chuzhou, Kitajska), je bilo naključno dodeljenih 6 poskusnih skupin. Vsako zdravljenje je imelo 6 ponovitev in vsaka ponovitev je vsebovala 45 ptic. Za poskus je bil uporabljen popolnoma randomiziran faktorski načrt 2 £ 3. Pripravljenih je bilo šest diet z 2 stopnjama CP in tremi stopnjami CF (tabela 1). 2 ravni CP sta bili 180 (18CP) in 220 (22CP) g/kg, tri ravni CF pa so bile 30 (nizka CF), 50 (srednja CF) in 70 (visoka CF) g/kg. Vse gosi so vzrejali v termostatski hiški s kletkami iz nerjavečega jekla enake velikosti (1,20 £ 1,00 £ 0,50 m3, 9 goskov na kletko, gostota naselitve: 7,5 ptic/m2), ki so bile postavljene 0,50 m nad tlemi. Gosi so bili hranjeni v standardnih pogojih vodenja s krmo v peletih in ad libitum vodo. Število visečih krmilnic in nastavkov za pitje v vsaki kletki je bilo zadostno skozi celotno študijo. Temperaturo okolja smo vzdrževali pri 30 stopinjah od d 0 do 3, 29 stopinjah od d 4 do 6, 28 stopinjah od d 7 do 9 in 26 stopinjah od d 10 do konca poskusa. Relativna vlažnost v celotnem poskusnem obdobju 21-d je bila približno 60 odstotkov. Viri svetlobe (bela svetloba, 400 −760 nm) so bili izenačeni z osvetljenostjo 15 § 0,3 luksa na ravni ptičje glave, s svetlobnim razporedom 22 ur svetlobe od d 0 do 3, 18 ur svetlobe od d 4 do 14 in 16 h svetlobe od d 15 do 21 v ciklu 24-h.

The basal diet was formulated to meet or exceed National Research Council (NRC, 1994) nutrient requirements for growing geese. The composition of experimental diets is presented (Table 1). Dietary samples (>1 odstotek sveže krme), naključno pridobljene s 5 lokacij, smo zmešali za analizo. CP in CF sta bila izmerjena v skladu z GB/T6432 (kitajski nacionalni standard: določanje surovih beljakovin v krmi) in GB/T6434 (kitajski nacionalni standard: določanje surove vlaknine v krmi).

ADFI in BW (živa teža) goskov sta bila zabeležena z elektronsko tehtnico (YP60001, Hengji, Šanghaj, Kitajska) pred hranjenjem med preskusom, ADG in razmerje pretvorbe krme (FCR) pa sta bila izračunana na koncu poskusa. Poleg tega je bila kumulativna obolevnost za protinom vseh ponovitev (vsaka ponovitev je vsebovala 45 ptic) med različnimi zdravljenji po poskusnem obdobju seštevana. Izbirni standard za protin je bil opredeljen kot gosling, ki kaže velike ledvične lezije in koncentracijo sečne kisline (UA) v serumu nad mejno vrednostjo prenasičenosti urata (samec, 416 mmol/L in samica, 357 mmol/L). Tipične prevladujoče velike poškodbe ledvic so blede, lisaste in otekle, ledvični tubuli in ureterji pa so napihnjeni s presežkom uratov (Xi et al., 2020a).

Herba Cistanche

3. Merjenje metabolitov v serumu

Šestintrideset goslingov (n=6 goslings/zdravljenje) je bilo naključno izbranih za takojšnje odvzem krvi (5 mL/gosling), po dekapitaciji, preko epruvet za odvzem krvi brez antikoagulanta na dan 9 oziroma 18. Vse vzorce krvi smo inkubirali pri 37 stopinjah 2 uri po odvzemu in centrifugirali pri 1,5{{10}}0 £ g 15 minut. Dobljene serume smo shranili v 0,6 ml Eppendorfovih epruvetah pri 80 stopinjah do nadaljnje analize. Serumske ravni UA so bile določene s kolorimetrijo fosfovolframove kisline. Koncentracije kreatinina (Cr) in sečninskega dušika (UN) ter aktivnost ksantin oksidaze (XOD) so bile določene z encimsko kolorimetrijo z uporabo mikroploščnega spektrofotometra (Promega Corporation, Madison, WI). Te komplete je dobavil Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kitajska); kode so bile C012 (UA), C011-2 (Cr), C013-2 (UN) in A002 (XOD). Serumske koncentracije IgM, IgA in IgG pri poskusnih gosi so bile izmerjene s kompleti ELISA za gosji imunoglobulin, kupljenimi pri Shanghai J&I Biotechnology Co., Ltd (Šanghaj, Kitajska). Imunski kompleksi v serumu (CIC), IL-1b in koncentracija TNF-a so bili določeni s komercialnim kompletom ELISA za gosi (Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kitajska). Aktivnost diamin oksidaze (DAO) je bila izmerjena z encimsko kolorimetrijo z uporabo avtomatskega biokemičnega analizatorja (Hitachi, Tokio, Japonska). Serumski LPS je bil izmerjen s tradicionalnim testom Limulus (Limulus Assay Biotechnology Company Ltd., Xiamen, Kitajska). Območja detekcije LPS v testu Limulus so bila od 0,015 do 0,6 EU/mL. Vsi materiali, uporabljeni za odvzem krvi in ​​merjenje endotoksinov, so bili brez pirogenov. Vsi testi so bili izvedeni po navodilih proizvajalca. Vzorci seruma so bili testirani v treh izvodih. Intra- in inter-testni koeficienti variacije za teste so bili<10% and <15%, respectively.

4. Histomorfološko opazovanje

Ceca (dolžine {{0}} cm) 36 goslinov (n=6 goslingov/zdravljenje) so bile zbrane po odvzemu vzorca krvi 9. in 18. dne za histološko analizo. Vzorce, zbrane pri goski, smo fiksirali v 4-odstotnem paraformaldehidu, vdelali v parafin in razrezali (debelina rezine: 3 mm; 4 rezine na gosko). Patološke spremembe v cekumu (približno 7 cm distalno od sfinktra pilorusa) smo pregledali pod svetlobnim mikroskopom (OLYMPUS, Tokio, Japonska) po barvanju s hematoksilinom in eozinom (HE). Višina resic in globina kripte cekuma sta bili izmerjeni s programsko opremo ImageJ (različica 1.8.0; Nacionalni inštitut za zdravje, Bethesda, MD). Zabeleženih je bilo osem meritev različnih nedotaknjenih resic na rezino (8 meritev v 3 zaporednih vidnih poljih). Statistične analize histoloških meritev so bile izvedene na podlagi povprečno 32 meritev na gosko (4 rezine na gosko in 8 meritev na rezino). Gostota vrčastih celic je bila izračunana kot število vrčastih celic, deljeno z ustrezno dolžino resic, ki je bila nato povprečena in izražena kot število vrčastih celic na 100 mm dolžine resic.

Cistanche tubulosa

5. 16S rRNA Sekvenciranje vsebine cekuma

Vsebino cekuma gosi (6 gosov/zdravljenje £ 6 skupin £ vzorčenje dvakrat=72 goslinov) smo zbrali 9. in 18. dan v 2 ml sterilne kriogene viale z notranjim navojem in takoj shranili v tekoči dušik za analizo 16S rDNA . DNK iz vzorcev vsebine cekuma smo ekstrahirali z uporabo kompleta MicroElute Genomic DNA Kit (D3096-01, Omega Biotek Inc., Norcross, GA) po navodilih proizvajalca. Slepi vzorci, sestavljeni iz neuporabljenih brisov, so bili obdelani z ekstrakcijo DNK in preverjeni so bili, da ne proizvedejo amplikona 16S. Celotno DNK smo eluirali v 50 ml elucijskega pufra z uporabo modificiranega postopka, ki ga je opisal proizvajalec (QIAGEN, Dusseldorf, Nemčija), in shranili pri 80 stopinjah.

Z uporabo celotne DNA vzorcev kot predloge in 16S rDNA primerjev (343F - 50 - TACGGRAGGCAGCAG -30; 798R - 50 - AGGGTATCTAATCCT-30) smo pomnožili regijo V3−V4 bakterijske 16S rRNA. Vse reakcije so bile izvedene v mešanici 25 mL (celoten volumen), ki je vsebovala 25 ng ekstrakta genomske DNA, 12,5 mL predmešanice PCR, 2,5 mL vsakega primerja in vodo za PCR za prilagoditev volumna. Produkti PCR so bili normalizirani z uporabo AxyPrep Mag PCR Normalizer (Axygen Biosciences, Union City, CA), ki je omogočil preskok koraka kvantifikacije, ne glede na količino PCR, predloženo za sekvenciranje. Skupine amplikonov so pripravili za sekvenciranje z uporabo kroglic AMPure XT (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA; izvaja OebioTech Co., Ltd, Šanghaj, Kitajska). Velikost in količina knjižnice pomnožev sta bili ocenjeni z uporabo LabChip GX (Perkin Elmer, Waltham, MA) oziroma Kapa Library Quantification Kit za Illumina (Kapa Biosciences, Woburn, MA). Knjižnica PhiX Control (v3) (Illumina) je bila združena s knjižnico amplikonov (pričakovano 30 odstotkov). Knjižnica je bila združena pri gostoti približno 570 K/mm2. Knjižnice so bile sekvencirane na 300PE MiSeq potekih, kjer je bila ena knjižnica sekvencirana z obema protokoloma z uporabo standardnih primerjev za sekvenciranje Illumina, s čimer je bila odpravljena potreba po tretjem (ali četrtem) branju indeksa. Odčitki so bili filtrirani s filtri kakovosti kvantitativnih vpogledov v mikrobno ekologijo (QIIME;). Cevovod CDHIT je bil uporabljen za izbiro operativnih taksonomskih enot (OTU) s pripravo tabele OTU. Zaporedja s 97-odstotno podobnostjo so bila dodeljena OTU-jem. Za vsako OTU so bile izbrane reprezentativne sekvence, taksonomski podatki pa so bili nato dodeljeni vsaki reprezentativni sekvenci z uporabo klasifikatorja Ribosomal Database Project (RDP). Pristopna številka GenBank teh nukleotidnih zaporedij OTU je SAMN21014082. Za oceno raznolikosti alfa je bila tabela OTU razporejena in izračunane so bile naslednje 4 metrike: metrika Chao1 za oceno bogastva; metrika opazovane vrste kot število edinstvenih OTU, najdenih v vzorcu; Shannonov indeks; in Simpsonov indeks.

6. PCR v realnem času

gosi (n {{0}} gosi/zdravljenje) so bili zbrani 9. in 18. dan za analizo PCR v realnem času (RT-PCR). Celotno RNK smo ekstrahirali iz tkiv z uporabo reagenta TRIzol (Life Technologies, Grand Island, NY) in obratno prepisali z uporabo kompleta Reverse Transcription Levels (TaKaRa, Dalian, Kitajska) v skladu s protokolom proizvajalca. b-aktin je bil uporabljen kot invariantna kontrola. Primerji so bili zasnovani s programsko opremo Primer Premier 5.0 in njihova zaporedja so navedena (tabela 2). RT-PCR je bil izveden z uporabo SYBR Premix Ex Taq (Roche, Basel, Švica). Vse RT-PCR so bile izvedene v treh izvodih. Relativne ravni izražanja ciljnih genov so bile določene z uporabo 2 metod DDCt.

7. Analiza podatkov

Eksperimentalne podatke, pridobljene iz 6 ponovitev na zdravljenje, smo analizirali s programom IBM SPSS Statistics 16 (IBM Corporation, Somers, NY). Vsaka ponovitev je bila obravnavana kot eksperimentalna enota, uporabljeni statistični postopek pa je bila multivariatna analiza variance z uporabo splošnega postopka linearnega modela (GLM). Ko so bile ugotovljene pomembne razlike, so bila povprečja zdravljenja ločena in primerjana z Duncanovim testom več razponov. Dvostranski test je veljal za statistično značilnega pri stopnji verjetnosti manj kot 5 odstotkov (P < 0.05).

Yumeng Xi *, Yuanpi Huang, y Yue Li *, Yunmao Huang #, Junshu Yan * in Zhendan Shi *.

* Ključni laboratorij za integrirano kmetovanje rastlin in živali Ministrstva za kmetijstvo in podeželje, Inštitut za živinorejo, Akademija kmetijskih znanosti Jiangsu, Nanjing 210014, Kitajska;

# College of Animal Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510000, Kitajska.