1. del: Geraniol blaži z doksorubicinom posredovano ledvično poškodbo s spremembo statusa antioksidantov, vnetja in apoptoze: možne vloge NF-kB in Nrf2/Ho-1

Za več informacij. stiktina.xiang@wecistanche.com

Povzetek: Posreduje doksorubicinokvara ledvicje resen problem pri zdravljenju raka. V skladu s tem je to delo raziskalo sposobnost geraniola, da modulira z doksorubicinom povzročenopoškodbe ledvicz uporabo podganjega modela. Podgane so bile naključno razporejene v štiri skupine: kontrolna, doksorubicin (20 mg/kg, intraperitonealno, ip), doksorubicin plus 100 mg/kg geraniola in doksorubicin plus 200 mg/kg geraniola. Enkratna injekcija doksorubicina je sprožila okvaro ledvic, kar dokazujejo spremenjene vrednosti serumskega kreatinina, dušika sečnine v krvi in ​​albumina; povzročila je tudi histološke spremembe v arhitekturi ledvic. Poleg tega je doksorubicin okrepil peroksidacijo lipidov, medtem ko je zmanjšal zmanjšan glutation, aktivnost katalaze in izražanje glutation peroksidaze in superoksid dismutaze. Zanimivo je, da je predhodno zdravljenje z geraniolom rešilo z doksorubicinom povzročene spremembe v ledvičnih antioksidativnih parametrih, encimski aktivnosti ter izražanju vnetnih in apoptoznih genov in proteinov. Poleg tega je profilaktično zdravljenje z geraniolom ohranilo večino histoloških značilnosti ledvic na način, odvisen od odmerka. Te ugotovitve potrjujejo, da bi geraniol lahko zaščitil pred posredovanjem doksorubicinamotnje delovanja ledvic. Vendar so potrebne nadaljnje raziskave za razjasnitev mehanizmov zaščitnih učinkov geraniola proti disfunkciji ledvic, ki jo povzroča doksorubicin.

Ključne besede: doksorubicin; vnetje; oksidativni stres; apoptoza; poškodba ledvic; geraniol

1. Uvod

Od odkritja se antraciklinsko zdravilo proti raku doksorubicin (Dox) v veliki meri uporablja proti solidnim tumorjem in hematološkim malignomom. Med njegovimi najpogostejšimi stranskimi učinki je nefrotoksičnost, opisana kot ledvična disfunkcija z zmanjšano filtracijo, reabsorpcijo in izločanjem, kar je povezano z velikim tveganjem obolevnosti in umrljivosti. Približno 60 odstotkov bolnikov z rakom, ki prejemajo kemoterapijo, razvije nefrotoksičnost, ki omejuje terapevtsko učinkovitost zdravila Dox [5,6]. Medtem ko temeljni procesi, ki povzročajo z Doxom posredovano nefrotoksičnost, ostajajo neznani, literatura kaže, da so verjetni dejavnikioksidativni stres, vnetje, inapoptoza. Zlasti dokazi kažejo, da je zmanjšanje, povezano z Doxomoksidativni stres, vnetje, in apoptotični dogodki lahko pomagajo zmanjšati toksičnost zdravila za ledvice.

Jedrski faktor (eritroidni izpeljan 2) podoben 2 (Nrf2) je transkripcijski faktor, občutljiv na redoks, z antioksidativnimi, protivnetnimi in citoprotektivnimi sposobnostmi, ki podpirajo celične obrambne sisteme. Ob oksidativnem stresu Nrf2 sprosti svoj citoplazemski inhibitorni protein, ki vstopi v jedro in aktivira več genov, ki sodelujejo pri antioksidativni obrambi, kot so heme oksigenaza -1(Ho-1), glutation peroksidaza (GPx), katalaza ( CAT) in superoksid dismutazo (SOD) [14-19]. Pokazalo se je, da zdravljenje z zdravilom Dox zmanjša ekspresijo mRNA in beljakovin Nrf2 in s tem tudi antioksidantnih genov in proteinov na nižji stopnji, kar vodi do toksičnosti za ledvice.

Nuklearni faktor-kB (NF-kB) je transkripcijski faktor, ki uravnava izražanje številnih vnetnih genov; kot osrednja figura poti NF-kB, ki jo aktivirajo reaktivne kisikove vrste (ROS), lahko sproži vnetni odziv in posledično poškodbo tkiva [8,22,23]. Številne študije so poročale, da Dox povzroča vnetje in povečuje proizvodnjo provnetnih citokinov, kot so interlevkin-6(IL-6), interlevkin-1 beta (L-1), in faktor tumorske nekroze alfa (TNF-)[11,13]. Poleg tega se je pokazalo, da ima povečana proizvodnja ROS po poškodbi ledvic, ki jo povzroča Dox, ključno vlogo pri aktiviranju intrinzične apoptotične poti skozi mitohondrijsko nestabilnost. Ključni determinanti te poti sta z mitohondriji povezana proteina Bax in Bcl-2; uravnoteženo razmerje med Bcl-2 in Bax preprečuje apoptozo, medtem ko neravnovesje povzroči povečano prepustnost membrane in uhajanje citokroma c v citosol, kar aktivira kaspazo-9(Casp-9) in kaspazo{ {21}} (Casp-3). Takšna aktivacija na splošno vodi do fragmentacije DNA in celične smrti.

Zelo zanimivo je čim bolj povečati klinično uporabo kemoterapevtskih zdravil, hkrati pa zmanjšati njihove negativne učinke. V skladu s tem so bila izvedena raziskovalna prizadevanja, da bi raziskali uporabo različnih sredstev v povezavi z Doxom za ublažitev njegovih neželenih učinkov [13,30,31]. Zeliščni izvlečki in njihove bioaktivne sestavine so že dolgo priznani zaradi svoje sposobnosti zmanjšanja toksičnosti, ki jo povzročajo zdravila. Geraniol je aciklični monoterpenski alkohol, ki ga najdemo v skoraj vseh eteričnih oljih, kot so tista iz ingverja, vrtnice, pomaranče, sivke in limone [32,33]. Številne študije so poročale, da ima geraniol različne koristne lastnosti, kot so proti razjedam, proti raku [35], antidepresiv [36], protivnetno [33] in poleg tega lahko olajša diabetično nefropatijo [37] .

Kolikor nam je znano, trenutno ni posebnih informacij o preventivnih učinkih geraniola proti nefrotoksičnosti, ki jo povzroča Dox. Zato smo proučevali učinke in verjetne mehanizme delovanja geraniola na poškodbe, ki jih povzroča Dox preko signalnih poti NF-kB in Nrf2/Ho-1 v ledvicah podgan Wistar.

2. Material in metode

2.1.Živali

Samci podgan Wistar so bili pridobljeni iz centra za oskrbo živali King Saud University (KSU) v Riadu v Savdski Arabiji. Živali so bile vzdrževane v nadzorovanih pogojih, na primer pri sobni temperaturi (25 ± 1 stopinja) z 12-urnim ciklom svetloba/tema in so imele neomejen dostop do vode in standardne prehrane, kot je odobril Odbor za etiko lokalnih institucionalnih študij KSU (REC) pod številko avtorizacije KSU-SE-19-122.

2.2. Eksperimentalno načrtovanje

Ta preiskava je pregledala skupaj 32 samcev podgan Wistar, težkih 190-210 g, ki so bili razdeljeni v štiri skupine. Podgane so imele teden dni časa, da so se prilagodile okolju pred študijo. Skupino nosilca, znano tudi kot kontrolno skupino, so sestavljale podgane, ki so jim dajali peroralno formulacijo fiziološke raztopine. Skupino II so sestavljale podgane, ki so 17. dan dobivale Dox (20 mg/kg ip enkratni odmerek) [11]. Podgane skupine ⅢI in IV so 18 dni prejemale profilaktične odmerke geraniola (oralno) pri 100 oziroma 200 mg/kg, 17. dan pa so bile prav tako podvržene Doxu (20 mg/kg, ip). Na 18. dan so podgane evtanazirali s kombinacijo ketamin/ksilazin v nadzorovanem okolju. Zbrali so kri in izolirali serum ter odstranili obe ledvici in takoj hitro zamrznili v tekočem dušiku. Na zamrznjenih tkivih so izvedli biokemijske, genske in proteinske ekspresijske teste. Za histološko preiskavo smo vzorce ledvičnega tkiva sprali v PBS in nato shranili v 4-odstotni raztopini formaldehida. Ves čas preiskave ni bilo nobenih znakov stiske ali pogina pri poskusni živali.

2.3. Določanje označevalcev delovanja ledvic

Za izolacijo seruma iz krvi, zbrane v času žrtvovanja, smo vzorce krvi centrifugirali 10 minut pri 2000 × g v predhodno ohlajeni centrifugi. Dobljeni serum smo nato analizirali za kvantificiranje albumina, dušika sečnine v krvi (BUN) in kreatinina. Vrednotedelovanje ledvicmarkerji so bili izračunani z uporabo Siemensovega avtomatskega analizatorja Dimension RXL MAXTM, Siemens, Washington, DC, ZDA.

2.4. Ocena lipidne peroksidacije

Lipidna peroksidacija je bila ovrednotena v ledvičnih tkivih, kot so prej opisali Ohkawa et al., z rahlimi spremembami.

2.5. Kvantifikacija reduciranega glutationa

Ravni reduciranega glutationa (GSH) v ledvičnem postmitohondrijskem supernatantu (PMS) so bile izmerjene po metodi, ki sta jo opisala Sedlak in Lindsay, z manjšimi modifikacijami.

2.6. Kvantifikacija aktivnosti katalaze

Aktivnost CAT pri ledvičnem PMS je bila določena po metodi, ki jo je opisal Claiborne, z manjšimi spremembami.

2.7. Analiza izražanja genov (RT-qPCR)

Reagent TRIzolTM (Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA) je bil uporabljen za ekstrakcijo celotne RNA iz ledvičnih tkiv v skladu s smernicami proizvajalca. Čistost in količino ekstrahiranih vzorcev RNA smo določili s spektrofotometrom NanoDropTM 8000 (Thermo Scientific, ZDA). Izolirano RNA smo nato reverzno prepisali v cDNA z uporabo cDNA Synthesis SuperMix (Bimake, Houston, TX, ZDA), izražanje genov pa smo kvantificirali s SYBR Green Master Mix (Bimake, Houston, TX, ZDA) na Applied Biosystems 7500 Fast Real- Čas PCR sistem. Pristop AACt je bil nato uporabljen za določitev relativne ekspresije različnih genov med skupinami, pri čemer je bil GAPDH uporabljen kot gospodinjski gen. Tabela 1 navaja sekvence primerjev, uporabljene v tej študiji (IDT, Leuven, Belgija).

2.8. Imunoblot analiza

Western blot analiza je bila izvedena, kot so opisali Alasmari et al. [41]. Na kratko, izolirane beljakovine (30-50 ug) smo podvrgli elektroforezi na SDS-PAGE gelih in nato prenesli na PVDF membrane. Po 60-minutnem blokiranju s 5-odstotnim nemastnim suhim mlekom so blote čez noč testirali pri 4 stopinjah s selektivnimi primarnimi protitelesi (proti Ho-1, Nrf2, TNF-, I6, NF-kB-p65, cepljeno kaspazo{{ 14}}, Bcl-2, Bax in GAPDH, razredčitev 1:1000). Membrane smo nato sprali in nato inkubirali 60 minut pri sobni temperaturi s primernimi sekundarnimi protitelesi, konjugiranimi s HRP (razredčitev: 1:5000). Komplet reagentov ECL in oprema za slikanje z gelom (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA) sta bila uporabljena za odkrivanje prisotnosti proteinov na membrani.

2.9.Histopatološke študije

Ledvična tkiva so bila naknadno fiksirana v 4-odstotnem formaldehidu, nato obdelana za parafinsko rezanje in barvanje. Mikrotom je bil uporabljen za rezanje parafinskih odsekov v debelini 3 μm. Odrezane dele smo nato obdelali, da smo odstranili vosek, in jih obarvali z barvilom hematoksilin in eozin (H&E) za histopatološko preiskavo. Histološke slike ledvic so bile pridobljene s kamero DP72, povezano z mikroskopom Olympus BX.

2.10. Analiza podatkov

Podatki so bili analizirani z računalniško podprtim programom Graph Pad Prism 5 (San Diego, CA, ZDA), rezultati pa so predstavljeni kot srednje vrednosti in standardne deviacije (povprečje ± SD). Razlike med skupinami so bile ovrednotene z uporabo enosmerne ANOVA, ki ji je sledil Tukeyjev primerjalni test, z vrednostjo p manj kot 0.05, kar kaže na statistično pomembnost (p<>