Del 1: Homoarginin lajša diabetično nefropatijo neodvisno od sintaze dušikovega oksida-3

Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Povzetek

Nedavno smo pokazali, da dodajanje homoarginina zagotavlja zaščito ledvic pri modelih diabetičnih miši. V tej študiji smo testirali, ali je zaščitni učinek homoarginina pri diabetični nefropatiji (DN) neodvisen od sintaze dušikovega oksida -3 (NOS3). Poskusi so bili izvedeni na miših s pomanjkanjem NOS3 (NOS3-7) in njihovih divjih sorodnikih iz legla z uporabo večkratnih nizkih odmerkov nosilca ali streptozotocina in zdravljenih s homoargininom s pitno vodo 24 tednov. Dodatek homoarginina 24 tednov pri diabetičnih NOS3-/ miših je v primerjavi z diabetičnimi NOS, zdravljenimi z vehiklom, znatno oslabil albuminurijo, povečan dušik sečnine v krvi, histopatološke spremembe in ledvično fibrozo, ledvične fibrozne markerje in rekrutacijo ledvičnih makrofagov3- / miši. Poleg tega je dodajanje homoarginina obnovilo delovanje mitohondrijev ledvic po sladkorni bolezni. Pomembno je, da med vsemi skupinami ni bilo pomembnih sprememb v izražanju mRNA NOS1 ali NOS2 v ledvicah. Poleg tega je dodatek homoarginina izboljšal delovanje srca in zmanjšal srčno fibrozo po sladkorni bolezni. Ti podatki kažejo, da je zaščitni učinek homoarginina neodvisen od NOS3, kar bo na koncu spremenilo naše razumevanje mehanizmov, s katerimi homoarginin inducira zaščito ledvic in srca pri DN. Zaščitni učinek homoarginina pri DN je lahko posredovan z izboljšanjem mitohondrijske funkcije.

Ključne besede: delovanje srca, diabetična nefropatija, homoarginin, NOS3

Kliknite, če želite izvedeti, za kaj se uporablja cistanche

1. UVOD

Sladkorna bolezenje resen in vedno pogostejši vzrok obolevnosti in umrljivosti v Združenih državah, pri čemer je po ocenah 12-14 odstotkov odraslih diabetikov, s še višjimi stopnjami med etničnimi manjšinami (Gao et al, 2016; Menke et al, 2015) . Gospodarske izgube in izgube produktivnosti zaradi diabetičnih zapletov znašajo več kot 245 milijard dolarjev in povzročajo fiziološke in psihološke učinke, vključno s sistemskimi.vnetje, ledvična in srčna disfunkcija, depresija in socialna anksioznost (Jha et al., 2018; Menke et al., 2015; Moreno et al., 2018; Tao et al. 2015; Vanstone et al., 2015). Diabetična nefropatija (DN) je kronična progresivna motnja, ki vodi do hitrega upada in končne odpovedi ledvic. V zadnjem desetletju se je pojavnost odpovedi ledvic zaradi sladkorne bolezni podvojila. Tradicionalne terapije, vključno z uravnavanjem krvnega tlaka in glukoze ter drugimi spremembami življenjskega sloga, so le skromno uspešne pri upočasnitvi napredovanja odpovedi ledvic. Zato je pomembno prepoznati mehanizme, ki sodelujejo pri razvoju in napredovanju sladkorne boleznibolezni ledvic. Cistanche deserticolaspada v tradicionalno kitajsko medicino in je zdravilo za tonificiranje ledvic. Uporablja se predvsem pri pomanjkanju ledvičnega janga, kot so bolečine v hrbtu, bolečine v hrbtu, impotenca itd. Vendar ima večina diabetičnih bolnikov pomanjkanje jina in če imajo pomanjkanje janga, ga lahko ustrezno jemljejo. Vendar pa ga je treba uporabljati previdno pri manifestacijah negativne vročine, kot so strah pred vročino in nočno potenje ter suha usta. V vsakem primeru se najprej posvetujte z zdravnikom.

Homoarginin, endogeni analog arginina, ki ni vključen v sintezo beljakovin, se je pojavil kot nov igralec pri zdravju in boleznih (Pilz et al., 2015). Homoarginin sintetizira mitohondrijska arginin: glicin amidinotransferaza (AGAT) v ledvicah z uporabo L-arginina in L-lizina kot substratov (Choe et al., 2013; Ryan & Wells, 1964) in kataboliziran z uporabo alanina: glioksilat aminotransferaze 2 (AGXT2). (Rodionov et al. 2016). Plazemske koncentracije homoarginina so v obratni korelaciji s tveganjem za srčno-žilne bolezni in splošno umrljivostjo (Jud et al., 2018; Marz et al, 2010), povečanim tveganjem za smrtno kap (Haghikia et al., 2017), kongestivnim srčnim popuščanjem in hipertrofija levega prekata (Atzler et al., 2013, 2017; Bahls et al., 2018; Pilz, Edelmann et al., 2014), staranje (Atzler, Schwedhelm et al., 2014; Marz et al., 2010) , kajenje (Atzler, Gore in sod., 2014; Sobczaket sod., 2014; Vogler in sod., 2015; Zwan in sod., 2013), indeks telesne mase (Atzler, Gore in sod., 2014; Marz in sod., 2010). ; Pilz, Teerlink, et al., 2014) in nosečnost (Valtonen et al, 2008). Nizke ravni homoarginina delujejo kot indikator srčne disfunkcije s povezanimi visokimi ravnmi asimetričnega dimetilarginina (ADMA) (Atzler, Schwedhelm et al., 2014; Jud et al., 2018; Kayacelebiet al., 2014; Pilzet al., 2015 ; Vogler al, 2015). Učinke nizke količine homoarginina na proizvodnjo/delovanje dušikovega oksida (NO) povezujejo s povečanim tveganjem za možgansko kap in aterosklerozo (Haghikia et al, 2017). Endotelijska sintaza dušikovega oksida (NOS3) je konstitutivno izražena v endotelijskih celicah in deluje tako, da prilagodi znotrajcelične ravni NO kot odgovor na ravni kalcija (Zanchi et al., 2000). Homoarginin lahko prispeva k sintezi NO tako, da služi kot substrat za NOS, ker se homoarginin, tudi s svojo šibkejšo afiniteto do NOS v primerjavi z argininom, lahko presnovi v NO in homocitrulin (Drechsler et al., 2011). V ledvicah je homoarginin nizek. je močan dejavnik tveganja za nenadno srčno smrt in smrt zaradi srčnega popuščanja pri bolnikih na hemodializi (Drechsler et al., 2011). Poleg tega so nizke ravni homoarginina povezane s povečanim srčno-žilnim tveganjem pri bolnikih s presaditvijo ledvic (Kayacelebi et al., 2017). Tako pri živalih (Banchaabouchi et al., 2001; Tofuku et al., 1985) kot pri ljudeh (Drechsler et al. 2013) s kroničnimi poškodbami ledvic so ravni homoarginina znižane in nizke ravni homoarginina v plazmi so bile pomembno povezane z zmanjšano hitrostjo glomerularne filtracije (GFR) in proteinurijo (Ravani et al., 2013). Čeprav so epidemiološki podatki pokazali, da so znižane ravni homoarginina povezane s povečano umrljivostjo zaradi bolezni ledvic in srca in ožilja (Drechsler et al., 2015; Jud et al., 2018; Marz et al., 2010; Ravani et al., 2013), neposredni fiziološki mehanizmi homoarginina ostajajo nejasni. Prej smo pokazali, da je homoarginin učinkovito zdravilo za DN (Wetzel et al., 2019). Vendar pa mehanizem delovanja homoarginina pri motnjah delovanja ledvic in srca ni znan.

V trenutni študiji smo testirali hipotezo, da je zaščitni učinek homoarginina na delovanje ledvic in srca pri sladkorni bolezni neodvisen od NOS3. Naši rezultati kažejo, da homoarginin posreduje pri zaščiti ledvic in srca pri diabetičnih miših NOS3-一, kar bo na koncu spremenilo naše razumevanje mehanizmov, s katerimi homoarginin izboljša diabetično poškodbo ledvic. Zaščitni učinek homoarginina pri DN bi se lahko posredoval z izboljšanjem mitohondrijske funkcije.

2. MATERIALI IN METODE

2.1 Diabetični model miške

Vsi poskusi na živalih so bili izvedeni na mišjih6-teden starih samcih (The Jackson Laboratory, Bar C57BL/6J ali NOS3-1-Harbor, ME). Miši so hranili pri 23 stopinjah C in ciklu svetlo-tema 12:12 s prostim dostopom do standardne hrane in vode. Sladkorna bolezen je bila inducirana z intraperitonealno injekcijo 50 mg/kg streptozotocina (STZ) ali nadzorom fiziološke raztopine po 6--urnem postu 5 zaporednih dni. Vsi postopki so bili opravljeni zjutraj skozi študijo. Ravni glukoze v krvi so bile izmerjene pri miših, ki niso bile na tešče, z glukometrom Contour Next EZ s trakovi Contour Next iz mišje repne vene, pri čemer so miši s sladkorno boleznijo definirali kot tiste, ki imajo raven glukoze v krvi nad 350 mg/dl. L-homoarginin (Sigma, St. Louis MO, kat. št.: H1007) dodali v pitno vodo v koncentraciji 50 mg/L, kot je opisano prej (Wetzel et al., 2019) in zamenjali vsake 4 dni. Na koncu študije (24 tednov) so bili 24-h odvzeti vzorci urina, miši so bile evtanazirane z intraperitonealno injekcijo koktajla ketamin/ksilazin; plazmo smo pridobili s srčno punkcijo, ledvice in srca pa odstranili za nadaljnje študije. Za zbiranje urina smo miši posamično postavili v presnovne kletke za 16 ur s prostim dostopom do pitne vode, urin pa zbrali v zbirne epruvete, ki vsebujejo 200 ul mineralnega olja, ki preprečuje izhlapevanje urina. Kri smo zbrali s srčno punkcijo in centrifugirali pri 3000 g 3 minute pri 4 stopinjah, da smo ločili plazmo. Po zbiranju so bili vsi vzorci do analize shranjeni pri -80 stopinjah C. Število miši na skupino je podano v tabeli 1. Vzorci, pridobljeni iz miši Ins2Aita, so bili pridobljeni, kot je opisano prej (You et al., 2015). Vse poskuse na živalih je odobril Center za zdravstvene znanosti Univerze v Teksasu pri Institucionalnem odboru za nego in uporabo živali San Antonio.

2.2 Imunohistokemija

Tkiva mišjih ledvic so bila fiksirana v 10-odstotnem formalinu in vdelana v parafin ter odrezani 3- μm odseki. Imunohistokemijo smo izvedli na odsekih, vgrajenih v parafin, s protitelesom proti miši Mac-2 (klon M3/38; Cedarlane, Burlington, NC), kot je opisano prej (Youet al., 2013, 2014). Slike so bile posnete z mikroskopom Olympus BX60 in digitalnim fotoaparatom Olympus Q-Color3 z uporabo slikovne programske opreme Q-capture Pro 7. Število glomerulnih makrofagov je bilo prešteto v 20 glomerulih/odsek (število makrofagov v glomerulih, deljeno s številom glomerulov) na slep način pod 40-kratno povečavo in izračunano povprečje, kot je opisano prej (Morris et al., 2011; Wetzel et al., 2019; You et al., 2013, 2014).

2.3 Histopatologija ledvic in srca

Ledvice in srca so fiksirali v 4-odstotnem paraformaldehidu, vdelali v parafin in izrezali rezine 5-µum. Sekcije so bile obarvane z Massonovim trikromom ali periodično kislinsko Schiffovo barvo (PAS), pregledane na slep način in povprečne ocene. Za določitev odstotka površine fibroze so bile Massonove trikromne slike pridobljene pri 10x in analizirane v ImageJ za merjenje odstotka površine fibroze. Reprezentativne slike so bile posnete z mikroskopom Olympus BX60 in digitalnim fotoaparatom Olympus Q-Color3 z uporabo slikovne programske opreme Q-capture Pro 7. Glomerularne značilnosti so bile izmerjene s programsko opremo Bioquant Osteo (Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, TN) in odstotni indeks poškodbe je bil izračunan, kot je opisano prej (Mohan et al., 2008). Za vsako ledvico smo pridobili 12 slik in analizirali glomerule za vsako polje, ki smo jih povprečili za vsako žival za statistično analizo.

2.4 Analitična metodologija

Koncentracija albumina v urinu je bila izmerjena z ELISA z uporabo kompleta Albuwell M (Excell, Philadelphia, PA), kot je opisano prej (Awad, You, Gao, Gvritishvili, et al., 2015). Kreatinin v urinu je bil izmerjen s testom kreatinina Diazyme (Diazyme Laboratories, Poway, CA) (Awad et al, 2011; Awad, You, Gao, Cooper et al., 2015). Dušik sečnine v krvi (BUN) je bil določen s kompletom za testiranje sečnine QuantiChrom (BioAssay Systems, Hayward, CA), kot je opisano prej (You et al., 2017). Mišji sistolični tlak je bil izmerjen s sistemom CODA Non-invasive Blood Pressure (Kent Scientific Corporation, Torrington CT), kot je opisano prej (Awad, You, Gao, Gvritishvili, et al., 2015). Miši so bile aklimatizirane 10 minut pri 26 stopinjah pred začetkom odčitavanja. Odčitki so bili vzeti ob istem času dneva za vse skupine, da bi preprečili kakršne koli dnevne razlike.

2.5 Meritve delovanja srca

Serijsko ehokardiografijo B-Mode in M-Mode smo izvedli z uporabo Vevo 2100 Imaging Platform (VisualSonics, Toronto, Kanada) z uporabo 30-MHz linearnega pretvornika za natančno spremljanje parametrov srčne hemodinamike in oceno strukture srca miši po 22 tednih zdravljenja s homoargininom. Iztisni delež levega prekata (EF) in frakcijsko krčenje levega prekata (FS) sta bila kvantificirana z uporabo M-načina, kot je opisano prej (lorga et al., 2016, 2018).

2.6 Izolacija RNA in PCR v realnem času

RNA je bila izolirana z ekstrakcijo Trizola iz celih delov ledvic in reverzno prepisana v cDNA z uporabo Bio-Rad (Hercules, CA)script kompleta za sintezo DNA. PCR v realnem času je bil izveden na sistemu CFX384 v realnem času (Bio-Rad, Hercules, CA) z uporabo Tagman primerjev za mišji MCU (Mm0116873_m1), fibronektin (Mm01256744_m1), rast tumorja faktor (TGF, Mm01178820_m1), NOS1(Mm00435175_m1), NOS2(Mm00440502_m1) in Rn18S (Mm03928990_gl)(Thermo Fisher, Waltham, MA). Vrednosti Ct so bile normalizirane na 18S in primerjane z vzorci NOS3. Primerji za aktin gladkih mišic (FW:5'-CTGCCGTTTTCCCCCTTCCTG-3', RV:5'-TTGCTTCCTCCTCCTTTG-3'),E-kadherin (FW: 5'-TGAGTGTGTGGGTGCTGA-3',RV:5'-CGGTTTC AATGGCTTACCTTTTCC-3') in -aktin (FW:5'-GC TGGTTGTGTAAGGTAAGGTGTGC-3',RV: 5'-GAGG GGGTTGAGGTGTTGAGG-3) so bili pridobljeni pri Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Vzorci cDNA so bili analizirani z uporabo SYBR Green Master Mix (Thermo Scientific, Rockford IL), kot je opisano prej (Morris et al., 2011), in normalizirani na -actin za primerjavo z vzorci NOS3-/-.

2.7 Western blot

Ledvično tkivo smo homogenizirali v pufru RIPA, ki je vseboval {{0}}.1 odstotkov Tritona X-100, dopolnjenega z zaviralci proteaz (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) in očistili s centrifugiranjem pri 10,{{4} } g 10 minut pri 4 stopinjah in zberemo supernatant. Koncentracijo beljakovin smo določili s testom bicinhonske kisline (BCA) (Thermo Scientific, Waltham, MA). Vzorec 50 ug ledvičnega lizata je bil ločen na 4-12 odstotnem Bis-Tris gelu (Life Technologies, Carlsbad, CA) in prenesen na PVDF membrane pred blokiranjem s 5 odstotnim suhim mlekom. Western bloti so bili izvedeni z uporabo naslednjih protiteles: protitelesa MiCU1 (0,4 ug/ml; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) in -aktin (1:1000; Cell Signaling, Danvers, MA). Western bloti so bili kvantificirani s programsko opremo ImageJ (NIH, Bethesda, MD) in normalizirani na izražanje proteina -aktina.

2.8 Statistična analiza

Primerjave med vsemi skupinami so bile izvedene z uporabo programske opreme GraphPad Prism (različica 7.04, San Diego, CA). Rezultati so izraženi kot povprečje ± SEM. Za primerjavo pomembnosti med skupinami je bila uporabljena enosmerna ANOVA, ki ji je sledil Fisherjev test razlike najmanjše pomembnosti. Vrednost p<0.05 represented="" a="" significant="">