Feniletanoidni glikozidi inducirajo apoptozo v celicah Eca-109 po od mitohondrijev odvisni poti

Uvod

Rak požiralnika je ena najpogostejših vrst raka z 11. najvišjo stopnjo obolevnosti in 6. najvišjo stopnjo umrljivosti na svetu in je leta 2015 povzročil ~439000 smrtnih primerov. Incidenca raka požiralnika se med različnimi regijami precej razlikuje, z vzhodnimi Azija ter vzhodna in južna Afrika so imele najvišje stopnje incidence, zahodna Afrika pa najnižje stopnje v letu 2012. Na Kitajskem je bilo ocenjenih primerov raka požiralnika 477000 in 375000 umrljivosti. , leta 2015. Čeprav se je stopnja obolevnosti za rakom požiralnika med letoma 2005 in 2015 zmanjšala v državah s srednjim in visoko-srednjim sociodemografskim indeksom, stopnja umrljivosti ostaja visoka zaradi slabe prognoze. Za zdravljenje raka požiralnika so uporabljali kombinacijo kirurške resekcije s kemoterapijo ali radioterapijo, vendar so poročali, da je med letoma 2003 in 2014 5-letna stopnja preživetja ostala<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studydokazal, daFeniletanoidni glikozidi Cistanche tubulosa(CTPG) bi lahko zaviral rast celic melanoma B16-F10 in vitro in in vivo (24). Vendar pa slaba topnost CTPG, ki je bil prej uporabljen, omejuje razvoj zdravila. Zato smo uporabili vodotopni CTPG (CTPG-W) in raziskali protitumorski učinek na rakave celice požiralnika (Eca-109). Ugotovljeno je bilo, da lahko CTPG-W odvisno od odmerka zavira sposobnost preživetja celic Eca-109 z indukcijo apoptoze po poti, odvisni od mitohondrijev.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiali in metode

Živali.

Samice miši C57BL/6 (6-8 tednov, ~25 g) so bile kupljene v pekinškem raziskovalnem centru za laboratorijske živali (Peking, Kitajska) in nameščene v temperaturno nadzorovani (25˚C) svetlobno ciklični (12/ 12) Zavod za živali Univerze Xinjiang (Urumqi, Kitajska). Vse živali so prejele vodo in hrano brez patogenov.

Celična linija in kultura.

Celično linijo karcinoma človeškega požiralnika (Eca-109) je ohranil Ključni laboratorij za biološke vire in genski inženiring v Xinjiangu (Koledž za znanost o življenju in tehnologijo, Univerza Xinjiang, Urumqi, Kitajska) in gojil v RPMI{{1} } medij (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, ZDA), dopolnjen z 10 % toplotno inaktiviranega fetalnega govejega seruma (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Kitajska), 1 % L -glutamin (100 mM), 100 U/ml penicilina in 100 µg/ml streptomicina pri 37˚C v vlažni atmosferi, ki vsebuje 5 % CO2.

Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC).

CTPG-W (kat. št. SGJG20170410) je bil kupljen pri Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Šanghaj, Kitajska). Glavne spojine CTPG so bile kvalificirane in kvantificirane s HPLC v skladu z našo prejšnjo študijo (24). Na kratko, HPLC smo izvedli na koloni ZORBAX SB‑C18 (250x4,6 mm; 5 µm) pri 30˚C in eluirali z 0,2 % raztopino mravljinčne kisline in gradientom metanola, ki se je začel pri 23 %, saj smo vsako minuto dodajali 1 ml. 45 minut, dokler ne dosežete 31 %. Vbrizgali smo skupno 10 µl vzorca in ga detektirali pri 330 nm. Standard ehinakozida je bil kupljen pri Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Šanghaj, Kitajska), standard akteozida pa pri Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija). Standardi so bili uporabljeni za analizo komponent CTPG-W.

MTT test.

Proliferacijo celic smo izmerili z MTT testom. Celice Eca{{0}} so bile inokulirane v 96-plošče z vdolbinicami z gostoto 5x103 celic v 100 µl RPMI{{5 }} medij/jamico in gojimo pri 37˚C 24 ur, nato obdelamo z različnimi koncentracijami (0, 200, 400, 600 in 800 µg/ml) CTPG-W ali 0,4 % dimetil sulfoksida (DMSO) 24 ur, 48 in 72 h. DMSO smo uporabili kot kontrolo topila (800 µg/ml CTPG-W, ki vsebuje 0,4 % DMSO). Kot pozitivno kontrolo smo uporabili cisplatin (20 µg/ml). Nato smo supernatant zavrgli po centrifugiranju pri 225 xg 5 minut pri sobni temperaturi in v vsako vdolbinico dodali 100 µl raztopine MTT (0,5 mg/ml v mediju RPMI-1640 brez FBS) in inkubirali pri 37˚C 3 h. Nastale kristale formazana smo raztopili v 200 µl DMSO. Vrednosti optične gostote (OD) so bile izmerjene pri valovni dolžini 490 nm z 96-bralnikom mikroplošč (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ZDA). Relativno viabilnost celic smo izračunali po formuli: Viabilnost celic (%)=(ODtretirane/ODnezdravljene)x100%. Morfologijo celic Eca‑109 smo opazovali z invertnim fluorescenčnim mikroskopom (povečava, x200) (Nikon Eclipse Ti‑E; Nikon Corporation, Tokio, Japonska).

Za proliferacijo splenocitov so miši C57BL/6 evtanazirali z dislokacijo materničnega vratu in izolirali vranice. Naredili smo suspenzijo ene celice in splenocite zasejali v 96-plošče z vdolbinicami z gostoto 1x105 celic/vdolbinico v 100 µl medija RPMI-1640 in nato obdelali z različnimi koncentracijami (0, 200, 400, 600 in 800 µg/ml) CTPG-W 24, 48 in 72 ur pri 37˚C s 5 % CO2. Proliferacijo splenocitov smo izmerili z MTT testom po prej omenjenem protokolu. Indeks stimulacije=OD zdravljen/OD nezdravljen.

Merjenje apoptoze in celičnega cikla. Celice Eca{{0}} smo gojili v 60 mm posodah pri gostoti 2,5x105 celic/posodo 24 ur in obdelali z različnimi koncentracijami ({{31} }, 200, 400, 600 in 800 µg/ml) CTPG-W ali 0,4 % DMSO 24 ur pri 37 °C s 5 % CO2. Celice so bile zbrane in obarvane s kompletom za odkrivanje apoptoze Aneksin V-fluorescein izotiocianatom (FITC)/propidijevim jodidom (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Šanghaj, Kitajska) v skladu s protokoli proizvajalca. Vzorci so bili zbrani s pretočno citometrijo (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, ZDA) in analizirani s FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, ZDA). Za analizo učinka CTPG-W na celični cikel smo 2,5 x 105 celic Eca-109 posejali v 60 mm posode za kulture in obdelali s CTPG-W (0, 100, 200 in 400 µg/ml) ali 0,4 % DMSO 24 ur pri 37 °C s 5 % CO2. Vse celice so bile pobrane in dvakrat sprane z ledeno mrzlim PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), nato pa 30 minut fiksirane v 70% ledeno mrzlem etanolu pri 4˚C. Po dvakratnem izpiranju z ledeno mrzlim PBS smo celice resuspendirali v 300 µl pufra za barvanje s PI/RNAzo (BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA) 10 minut pri sobni temperaturi. Porazdelitev celičnega cikla smo analizirali s programsko opremo ModFit LT 3.0 s pretočno citometrijo (BD FACSCalibur).

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSAProti utrujenostiZaščita jeter PHGS 75 % ECH 30 % ACT 12 %

Analiza mitohondrijskega membranskega potenciala (Δψm) in reaktivnih kisikovih vrst (ROS).Za analizo Δψm smo celice Eca{{0}} obdelali s CTPG-W (0, 400, 600 in 800 µg/ml) ali 0,4 % DMSO za 24 h pri 37˚C s 5 % CO2 in obarvan s kompletom za analizo potenciala mitohondrijske membrane z JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Šanghaj, Kitajska), v skladu s protokolom proizvajalca, 20 minut pri 37˚ C. Po dvakratnem izpiranju s pralnim pufrom JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology) smo vzorce resuspendirali s 300 µl pralnega pufra JC‑1 in analizirali s pretočno citometrijo (BD FACSCalibur). Fluorescenco barvila JC‑1 v celicah Eca‑109 so opazovali tudi z invertnim fluorescenčnim mikroskopom (povečava, x200; Nikon Eclipse Ti‑E). Za analizo ROS smo celice Eca-109 obdelali s CTPG-W (0, 400, 600 in 800 µg/ml) 2, 4, 6, 12 in 24 ur ter jih obarvali s testom reaktivnih kisikovih vrst kit (Beyotime Institute of Biotechnology), v skladu s protokolom proizvajalca, 20 minut pri 37˚C. Po trikratnem izpiranju z ledeno mrzlim PBS so bili vzorci zbrani s pretočno citometrijo (BD FACSCalibur) in analizirani s programsko opremo FlowJo 7.6.

Slika 1. Kvalificirana kontrola CTPG-W. Komponente CTPG-W smo kvalitativno in kvantitativno analizirali s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti in primerjali s standardoma ehinakozida in akteozida. CTPG-W, vodotopni feniletanoidni glikozidiC. tubuloza.

2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) aktivnost lovljenja radikalov. Aktivnost CTPG-W pri lovljenju prostih radikalov je bila določena s testom prostih radikalov DPPH v skladu z objavljenim protokolom z manjšo modifikacijo, saj je bil metanol nadomeščen z etanolom za raztapljanje DPPH (25, 26). Za meritve v stanju dinamičnega ravnovesja smo 150 µl DPPH (100 mmol/l) v etanolu zmešali z različnimi koncentracijami CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 in 600 µg/ml) v 50 µl PBS in inkubiramo v temi 30 minut pri sobni temperaturi. Absorpcijo pri 517 nm smo zaznali v prisotnosti in odsotnosti CTPG-W. Kot pozitivno kontrolo smo uporabili skupaj 50 µl vitamina C. Aktivnost odstranjevanja radikalov DPPH je bila izračunana po formuli: čiščenje (%)=[1-(Asample-Prazno)/A0] x100, kjer je Ablank absorbanca kontrole (brez DPPH), Asample je absorbanca vzorca in A0 je absorbanca PBS z DPPH.

Western blot analiza. Celice Eca{{0}} smo obdelali s CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) ali 0,4 % DMSO 24 ur pri 37 °C s 5 % CO2. Sledi dvakratno pranje s PBS, celice 

Slika 2. Učinek CTPG-W na rast celic Eca-109 in splenocitov. (A) Celice Eca-109 so bile obdelane z različnimi koncentracijami CTPG-W 24, 48 in 72 ur, nato pa je bila viabilnost celic odkrita s testom MTT. (B) Morfološke spremembe celic Eca-109 po zdravljenju s CTPG-W po 24 urah. (C) Splenociti miši C57BL/6 so bili zdravljeni z različnimi koncentracijami CTPG-W 24, 48 in 72 ur, nato pa je bila proliferacija analizirana z MTT testom.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubuloza.

so lizirali v pufru za lizo radioimunoprecipitacijskega testa (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Peking, Kitajska) 20 minut na ledu. Po centrifugiranju pri 10,000 xg 10 minut pri 4˚C smo zbrali supernatante in določili koncentracije beljakovin s kompletom bicinhoninske kisline (Thermo Fisher Scientific, Inc.) v skladu s protokoli proizvajalca. Western blot analiza je bila izvedena v skladu z našim prejšnjim opisom (24). Protitelesa proti kaspazi-7 (kat. št. D120077), kaspazi-8 (kat. št. D155240), kaspazi-9 (kat. št. D220078), B-celični limfom{ {13}} (Bcl-2), povezana z X (Bax) (kat. št. D220073) in Bcl-2 (kat. št. D260117), in anti-mišji IgG-hrenova peroksidaza (HRP) ) (kat. št. D111050) in anti-kunčji IgG-HRP (kat. št. D110058) sta bila kupljena pri BBI Life Sciences (Šanghaj, Kitajska). Protitelesa proti kaspazi-3 (kat. št. E-AB-10050) in aktivni kaspazi-3 (kat. št. E-AB-22115) so bila kupljena pri Elabscience ( Wuhan, Kitajska). Druga protitelesa proti kaspazi-7 (kat. št. 9492), poli (ADP-riboza) polimerazi (PARP) (kat. št. 9542), citokromu c (kat. št. AC909), c-Jun NH{ {37}}terminalna kinaza (JNK) (kat. št. 9252S) in -aktin (kat. št. 58169) sta bila pridobljena pri Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, ZDA). Vsa primarna in sekundarna protitelesa so bila razredčena v razmerju 1:1,000. Primarna protitelesa so bila inkubirana pri 4 °C čez noč, sekundarna protitelesa pa so bila inkubirana pri 37 °C 1 uro.

Slika 3. Apoptoza celic Eca-109, inducirana s CTPG-W. Celice smo 24 ur obdelali z različnimi koncentracijami CTPG-W. (A) Apoptotične in nekrotične celice Eca-109 so bile analizirane s pretočno citometrijo. Zgornja plošča prikazuje posamezne pikčaste grafikone, spodnja plošča pa prikazuje povzetek podatkov. * P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubuloza.

Ciljne beljakovine so bile odkrite s kompletom za izboljšan kemiluminescenčni test (Beyotime Institute of Biotechnology) v skladu s protokolom proizvajalca.

Statistična analiza. Statistična značilnost je bila izračunana z enosmerno analizo variance s Tukeyjevim post hoc testom, rezultati pa so bili analizirani s programsko opremo GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, ZDA) med zdravljenimi in kontrolnimi skupinami. Vsi podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± standardni odklon. p<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

IZVLEČEK CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE DELOVANJA LEDVIC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Rezultati

CTPG-W zavira rast celic Eca-109.

Komponente CTPG-W smo kvalificirali in kvantificirali s HPLC (slika 1), ki smo jih primerjali s standardoma ehinakozida in akteozida. Glede na največje retenzijske čase in površine vrhov je CTPG-W vseboval 39,16 % ehinakozida in 2,44 % akteozida. Najprej smo s testom MTT določili učinek CTPG-W na sposobnost preživetja celic Eca-109. CTPG-W smo raztopili v DMSO pri 200 mg/ml in razredčili z medijem RPMI-1640, ki je vseboval 10 % toplotno inaktiviranega FBS, do navedenih koncentracij. Celice Eca-109 smo obdelali s CTPG-W in viabilnost celic analizirali s testom MTT v navedenih časovnih točkah. Zdravljenje s CTPG-W je znatno zmanjšalo sposobnost preživetja celic Eca-109 na način, odvisen od odmerka in časa (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Slika 4. Učinek CTPG-W na porazdelitev celičnega cikla v celicah Eca-109. Za 24-urno obdelavo celic Eca-109 smo uporabili različne koncentracije CTPG-W, porazdelitev celičnega cikla pa analizirali s pretočno citometrijo. * P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubuloza.

CTPG-W inducira apoptozo v celicah Eca-109. Da bi raziskali, ali je CTPG-W zaviral rast celic Eca-109 z indukcijo apoptoze ali nekroze, smo celice obdelali z različnimi koncentracijami CTPG-W. Po 24 urah smo z barvanjem z aneksinom V/PI odkrili apoptozo in nekrozo celic Eca-109. Kot je prikazano na sliki 3A, so bile celice aneksina V- /PI+ zaprte kot nekrotične celice, celice aneksina V+ /PI+ in aneksina V+ /PI- pa so bile zaprte kot apoptotične celice. CTPG-W je primarno induciral apoptozo celic Eca-109 na način, ki je bil odvisen od odmerka, čeprav se je tudi število nekrotičnih celic Eca-109 znatno povečalo pri zdravljenju s 600 in 800 µg/ml CTPG-W (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG‑W inducira zaustavitev celičnega cikla v fazi S v celicah Eca‑109. Motnje cikla rakavih celic bodo zavirale rast celic in spodbujale apoptozo (27). Porazdelitev celičnega cikla v celicah Eca-109 smo odkrili z barvanjem s PI po 24-urnem zdravljenju s CTPG-W. Ugotovljeno je bilo, da se je število celic v fazi S povečalo, celice v fazah G0/G1 pa so pokazale splošno znatno zmanjšanje po zdravljenju s CTPG-W (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG-W zmanjša Δψm in inducira sproščanje citokroma c. Apoptozo lahko sproži pot, ki je odvisna od mitohondrijev (28, 29). Pro- in anti-apoptotični člani družine beljakovin BCL-2 igrajo pomembno vlogo pri uravnavanju celovitosti mitohondrijske membrane (30,31). Po zdravljenju s CTPG-W 24 ur je bil Δψm ocenjen z barvanjem JC-1. Agregat JC‑1 (rdeča fluorescenca, zaznana v FL-2), bo razpadla v monomer (zelena fluorescenca, zaznana v FL-1), ko se Δψm zmanjša (32). Kot je prikazano na sliki 5A, so se frekvence celic FL-1+ FL-2-/+ znatno povečale v odvisnosti od odmerka, kar kaže, da se je Δψm celic Eca-109 zmanjšal. Spremembe fluorescence v celicah Eca‑109 so opazili tudi z invertnim fluorescenčnim mikroskopom (slika 5B). Z naraščajočimi koncentracijami CTPG-W se je rdeča fluorescenca zmanjšala, zelena pa povečala, kar je skladno s podatki iz pretočne citometrije. Opazili so tudi, da se je raven citokroma c v citosolu opazno povečala (slika 5C), kar je posledica zmanjšanja Δψm. To krepi sklep iz povečanega števila celic FL-1+ FL-2-/+, da se je Δψm zmanjšal kot posledica zdravljenja s CTPG-W. Poročali so, da lahko JNK uravnava aktivacijo družine beljakovin BCL-2, kar povzroči sproščanje citokroma c (33-35). Ugotovljeno je bilo tudi, da je bila raven JNK opazno povečana po zdravljenju s CTPG-W (slika 5C). Rezultati so pokazali, da lahko CTPG-W inducira apoptozo celic Eca-109 po od mitohondrijev odvisni poti.

Slika 5. Zmanjšanje Δψm in uravnavanje citokroma c in JNK. Celice Eca-109 smo 24 ur obdelali z različnimi koncentracijami CTPG-W. (A) Δψm je bil odkrit z barvanjem JC-1 in vzorci so bili analizirani s pretočno citometrijo. Posamezni pikčasti grafikoni prikazujejo spremembe v fluorescenci JC‑1. Na spodnji plošči so upodobljene frekvence celic FL-1+ FL-2-/+. ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Slika 6. Ravni ROS v celicah Eca-109 po zdravljenju s CTPG-W in antioksidativna aktivnost CTPG-W. (A) Celice Eca-109 so bile obdelane z različnimi koncentracijami CTPG-W in ravni ROS so bile analizirane s pretočno citometrijo v navedenih časovnih točkah. * P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

Učinek CTPG-W na znotrajcelično nastajanje ROS.ROS bi lahko zmanjšal Δψm za induciranje apoptoze (36). Da bi raziskali, ali lahko CTPG-W poveča proizvodnjo ROS, so celice Eca-109 obdelali z različnimi koncentracijami CTPG-W. Celice smo zbrali ob navedenih časovnih točkah in obarvali z DCFH-DA. Proizvodnja znotrajceličnega ROS v celicah Eca-109 je bila določena s pretočno citometrijo. Kot je prikazano na sliki 6A, je 800 µg/ml CTPG-W znatno povečalo proizvodnjo ROS od 2-6 h in zmanjšalo od 12-24 h. Poleg tega je 400 µg/ml CTPG‑W znatno povečalo proizvodnjo ROS od 12-24 h. Poleg tega 200 µg/ml CTPG-W ni bistveno spremenilo proizvodnje ROS. Dinamične spremembe v proizvodnji ROS so lahko povezane z apoptozo celic Eca-109. Ugotovljeno je bilo tudi, da ima CTPG-W aktivnost lovljenja prostih radikalov (slika 6B), kar je lahko povezano z zmanjšano proizvodnjo ROS v celicah Eca-109, zdravljenih z 800 µg/ml CTPG-W po 12 urah.

Slika 7. Ravni razcepljenih kaspaz in razcepljenih PARP po zdravljenju s CTPG-W. Beljakovine smo izolirali iz celic Eca-109, obdelanih s CTPG-W 24 ur, in nivoje razcepljenih kaspaz in razcepljenih PARP smo odkrili z Western blot analizo. DMSO, dimetil sulfoksid; CTPG-W, vodotopni feniletanoidni glikozidiC. tubuloza; PARP, poli (ADP-riboza) polimeraza.

CTPG-W uravnava aktivnost kaspaze-3, kaspaze-7, kaspaze-9 in PARP. Sproščanje citokroma c zaradi zmanjšanja Δψm bi lahko aktiviralo proteaze kaspaze za induciranje apoptoze (29, 30, 37). Po 24-urnem zdravljenju s CTPG-W je bila z Western blot analizo odkrita aktivacija kaspaze -3, 7, 8, 9 in PARP. V primerjavi s kontrolo so bile ravni cepljene kaspaze-9, cepljene kaspaze-7, cepljene kaspaze-3 in cepljene-PARP, vendar ne ravni cepljene kaspaze{{20 }}, so bile regulirane z zdravljenjem s CTPG na način, odvisen od odmerka (slika 7). Ti rezultati so pokazali, da je CTPG-W zmanjšal Δψm in spodbudil sproščanje citokroma c za aktiviranje kaspaz, ki inducirajo apoptozo celic Eca-109.

Razprava

Tradicionalni CHM bi lahko induciral apoptozo rakavih celic požiralnika po različnih poteh, vključno z zunanjim receptorjem smrti ter intrinzičnimi stresnimi potmi mitohondrijev in endoplazmatskega retikuluma (29). Naša prejšnja študija je pokazala, da je CTPG kot glavna sestavina C. tubulosa zaviral rast celic melanoma B16-F10 z indukcijo apoptoze po od mitohondrijev odvisni poti (24). V tej študiji so raziskovali protitumorski učinek CTPG-W na celice Eca-109 in ugotovili, da CTPG-W zavira rast celic Eca-109, povzroča apoptozo in zaustavitev celičnega cikla, zmanjšal Δψm, povečal sproščanje citokroma c in aktiviral kaspaze. CTPG in CTPG-W lahko povzročita apoptozo in zaustavitev celičnega cikla v rakavih celicah. Vendar so natančni mehanizmi različni zaradi različnih sestavin CTPG (26,64 % ehinakozida, 10,19 % akteozida in 1,71 % izoakteozida) in CTPG-W (39,16 % ehinakozida in 2,44 % akteozida). CTPG je aretiral celice B16-F10 v fazah G0/G1, CTPG-W pa je aretiral celice Eca-109 v fazi S (24). Proizvodnja ROS je bila odvisno od odmerka povečana s CTPG, vendar je pokazala spremembo na časovno odvisen način z visokim odmerkom CTPG-W, ki se je znatno povečal na začetku zdravljenja s CTPG-W (2-6 h) in se je po 12 urah znatno zmanjšalo v primerjavi s kontrolo. Možen razlog je, da je glavna sestavina CTPG-W ehinakozid. Več študij je poročalo, da bi lahko ehinakozid zaviral nastajanje ROS in apoptozo, ki jo povzroči ROS, da bi imel nevroprotektivne učinke in učinke proti staranju (38-40). Podobno so v tej študiji opazili aktivnost lovljenja prostih radikalov. Zato se je domnevalo, da lahko nekatere sestavine, vključno z verbaskozidom, izo-verbaskozidom in salidrozidom v visokem odmerku CTPG-W, takoj inducirajo nastajanje ROS, da povzročijo apoptozo celic Eca-109 (41,42), in nato ROS je očistil echinakozid. Drug možen razlog za razlike v proizvodnji ROS s CTPG in CTPG-W je, da so bile v tej in prejšnji študiji uporabljene različne celične linije (24). Dong et al (43) so poročali, da lahko ehinakozid inducira apoptozo človeških kolorektalnih rakavih celic SW480 z ustvarjanjem oksidativne poškodbe DNA brez povečanih ravni ROS.

Zdravljenje s CTPG-W je zmanjšalo Δψm in povzročilo sproščanje citokroma c, ki spodbuja cepitev kaspaze -9 (28). Konsistentno so bile ravni razcepljene kaspaze-9 regulirane z zdravljenjem s CTPG-W. Kasneje lahko aktivna kaspaza-9 aktivira kaspazo-3, da inducira apoptozo (44). Ravni razcepljene kaspaze-3 so bile tudi regulirane z zdravljenjem s CTPG-W. Vendar kaspaze -8 ni aktiviral CTPG-W, kar kaže, da zunanja pot receptorja smrti ni bila vključena v apoptozo, ki jo povzroča CTPG-W. Ta opažanja kažejo, da CTPG-W inducira apoptozo celic Eca-109 z aktivacijo od mitohondrijev odvisne poti.

PARP igra pomembno vlogo pri genomski stabilnosti in ga lahko razcepijo aktivne kaspaze, zlasti kaspaze -3 in -7 (45). Ugotovljeno je bilo, da je zdravljenje s CTPG-W aktiviralo kaspazo -3 in -7, ki lahko cepita PARP, da zavirata popravljanje DNA in povzročita apoptozo.

CTPG-W tudi odvisno od odmerka in časa zavira rast celic človeškega hepatocelularnega karcinoma BEL-7404 (neobjavljeni podatki). Čeprav CTPG-W zavira rast celic Eca-109 in BEL-7404, spodbuja proliferacijo splenocitov, kar je lahko posledica vsebnosti polisaharidov (~50 %) v CTPG-W (46 ). Podobno je več študij poročalo, da lahko polisaharidi spodbujajo proliferacijo splenocitov (46-49). Pri mišjem modelu je bilo ugotovljeno, da je CTPG-W znatno povečal vranični indeks v primerjavi s kontrolno skupino, ni pa vplival na telesno težo in druge organske indekse, vključno s srcem, jetri, ledvicami in pljuči (neobjavljeni podatki), kar kaže, da CTPG-W nima citotoksičnega učinka na normalne celice.

Podatki skupaj kažejo, da CTPG-W zavira rast celic Eca-109 z indukcijo apoptoze po od mitohondrijev odvisni poti

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%