Feniletanoidni glikozidi Cistanche Deserticola: mehanizem nevroprotektivnega učinka

Maiquan Li, et al

Povzetek:Jedrnemu faktorju eritroidni 2-povezan faktor 2 (Nrf2) je ključni transkripcijski faktor proti oksidativnemu stresu in nevrodegenerativnim motnjam.Feniletanoidni glikozidi(PhGs; salidrozid,akteozid, izoakteozid inehinakozid) kažejo antioksidant innevroprotektivnobioaktivnosti. Ta študija je bila izvedena, da bi raziskalinevroprotektivnoučinek in molekularni mehanizemPhGs. PhGspredhodna obdelava je znatno zavrla citotoksičnost, ki jo povzroča H2O2-, v celicah PC12 s sprožitvijo jedrske translokacije Nrf2 in obračanjem znižane ekspresije proteinov heme oksigenaze 1 (HO-1), NAD(P)H kinon oksidoreduktaze 1 (NQO1). ), katalitsko podenoto glutamat-cistein ligaze (GCLC) in podenoto modifikatorja glutamat-cistein ligaze (GCLM). Nrf2 siRNA ali zaviralec HO-1 cinkov protoporfirin (ZnPP) je zmanjšalnevroprotektivnoučinek. PhG so pokazali potencialno interakcijo z veznim mestom Nrf2 v Kelchu podobnem ECH-asociacijskem proteinu 1 (Keap1). Ta rezultat lahko podpira hipotezo, da so PhG aktivatorji Nrf2. Dokazali smo potencialno vezavo med PhG in potjo Nrf2/ARE, aktivirano s Keapl, in da so imeli PhG z več glikozidi okrepljene učinke.

Ključne besede:Keap1; Nrf2;Nevroprotektivno; celice PC12;PhGs(NQO1), med drugim [5-7]. Ta proces predstavlja ključni korak pri zaščiti celic pred oksidativnim stresom in se pojavlja kot obetavna terapevtska tarča za nevroprotekcijo [8]. Gaia je poročala, da Nrf2 ublaži LRRK2- in nevrodegeneracijo, povzročeno z a-sinukleinom, tako da močno spodbuja homeostazo nevronskih beljakovin na celično avtonomen in od časa odvisen način [9].

Feniletanoidni glikozidi (PhGs) so značilni cimetova kislina in hidroksi fenil etil deli, vezani na ap-glukopiranozo prek estrskih oziroma glikozidnih povezav. Te molekule so člani skupine vodotopnih naravnih produktov, ki so široko razširjeni v rastlinskem kraljestvu [10]. Študije in vitro in in vivo so pokazale, da imajo te spojine antioksidant [11],nevroprotektivno[12], antibakterijsko,

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cistanche ima nevroprotektivne lastnosti, kliknite tukaj, če želite izvedeti več

1. Uvod

Oksidativni stres, ki je neravnovesje antioksidativne homeostaze, povzroči peroksidacijo lipidov, poškodbe beljakovin in DNA, staranje celic in celično smrt. Ta proces verjetno prispeva k številnim nevrodegenerativnim motnjam, kot so Alzheimerjeva bolezen (AD), Parkinsonova bolezen (PD) in ishemija/reperfuzija [1]. Znano je, da vodikov peroksid (H2O2), ki je ena glavnih reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS), povzroča peroksidacijo lipidov in poškodbe DNA [2]. Poleg tega je H2O2 endogeni vir prostih hidroksilnih radikalov, ki prispevajo k ravni celičnega oksidativnega stresa v ozadju [3,4]. Zato imajo lahko terapevtske strategije za preprečevanje apoptoze, ki jo povzroča oksidativni stres, potencial pri zdravljenju nevrodegenerativnih bolezni.

Jedrnemu faktorju eritroidni 2-povezan faktor 2 (Nrf2) je transkripcijski faktor, ki je močno povezan z oksidativnim stresom. Aktivacija Nrf2 inducira transkripcijo številnih antioksidativnih in razstrupljevalnih genov, vključno s hem oksigenazo-1 (HO-1), NAD(P)H kinon oksidoreduktazo 1

protivnetno [13] in imunomodulatorno [14] bioaktivnost. Osmanthusfragrans je običajna sestavina v več azijskih živilih in se že dolgo uživa. Prej smo pokazali, da izvlečki cvetov O.fragrans izboljšajo prostorsko učenje in spomin, zavirajo oksidativno škodo in kažejo nevroprotektivne aktivnosti pri staranju, ki ga povzroča d-galaktoza, v modelu miši ICR [15]. Salidrozid, akteozid in izoakteozid so glavni odziv PhG za antioksidativne aktivnosti izvlečkov cvetov O.fragrans [16].

Študije nevroprotektivnega učinka PhG so dale zaželene rezultate. Salidrozid je znatno zmanjšal celično apoptozo celic PC12, ki so bile izpostavljene v MPP plus [17,18]. Akteozid je ublažil tudi apoptozo in oksidativni stres, povzročeno z MPP plus, v celicah PC12 [19] in A p25-35-povzročeno poškodbo celic SH-SY5Y [20].Ehinakozidso raziskovali na apoptozi, ki jo povzroča faktor tumorske nekroze-a (TNFa) v celicah SH-SY5Y [21], dopaminergični toksičnosti, ki jo povzroča MPTP, pri miših [22], z glutamatom poškodovanih primarnih kulturah kortikalnih celic podgan [23] in {{ 9}}Poškodbe, ki jih povzroči OHDA v celicah PC12 [24]. Rezultati so pokazali, da imajo PhGs citoprotektivni učinek in so potencialna sredstva za zdravljenje nevrodegenerativnih bolezni. Študije so pokazale, da so antioksidativne lastnosti PhG v osnovi številnih drugih bioaktivnosti teh spojin [25]. Vendar pa je malo študij raziskalo molekularni mehanizem PhG proti oksidativni toksičnosti.

V naši študiji smo izbrali štiri tipične PhG, kot sledi: salidrozid (feniletanoidni monosaharidi), akteozid (feniletanoidni disaharidi), izoakteozid (feniletanoidni disaharidi) inehinakozid(feniletanoidni trisaharidi). Uporabili smo model nevronske smrti z uporabo diferenciranih celic PC12 [26], da bi raziskali zaščitni učinek in molekularni mehanizem PhG na modelu celic PC12, ki ga povzroča H2O2-. Dokazali smo, da so PhG aktivirali pot Nrf2/ARE z vezavo na Kelchu podoben ECH-povezan protein 1 (Keap1). Ta proces je povečal antioksidativne encime in povečal odpornost celic PC12 na oksidativni stres.

2. Rezultati

2.1. PhG zavira citotoksičnost, ki jo povzroča H2O2-, v celicah PC12

Testirani so bili citotoksični učinki H2O2 in PhG (0.1,1,5 in 10 卩g/mL) na celice PC12. Rezultati so pokazali, da je H2O2 povzročil izgubo viabilnosti celic PC12 na način, odvisen od koncentracije in časa (slika 1A). Izpostavljenost celic PC12 200 H2O2 za 2 uri je povzročila viabilnost celic 57,4 odstotka. Predobdelava celic s PhG pri 0,1, 1, 5 in 10 -/ml ni vplivala na viabilnost celic (slika 1B) in je izrazito zaščitila celice PC12 pred poškodbami, ki jih povzroča H2O2-, tako da je izboljšala viabilnost celic kot 9.549-22.141 odstotkov, 12.092-25.289 odstotkov, 1.470-9.289 odstotkov oziroma 3.411-11.441 odstotkov (slika 1C) . Vendar pa salidrozid (0,1 ^g/mL), izoakteozid (0,1, 1, 5 in 10 ^g/mL),ehinakozid(0.1,1 in 5 ^g/mL) predhodna obdelava ni pokazala pomembne razlike pri poškodbi celic, ki jo povzroča HzOz. Predobdelava celic s PhG je tudi izboljšala morfološke značilnosti, ki jih povzroča H2O2 (slika 1D).

Slika 1. PhG zavirajo citotoksičnost, ki jo povzroči H2O2-, v celicah PC12. Preživetje celic je bilo odkrito s testom MTT. Citotoksični učinek H2O2 (A) in PhG (B) pri različnih koncentracijah na celice PC12. (C) PhG so oslabili H2O2-inducirano zmanjšanje viabilnosti celic. Celice PC12 smo 24 ur inkubirali s PhG ({{10}}.1 in 10 wg/mL) in nato še en čas inkubirali z 200 pM H2O2 2 uri po odstranitvi PhG. (D) Morfološko opazovanje. Celice po obdelavi smo opazovali s faznokontrastnim mikroskopom (x100), CK: normalna skupina, H2O2: skupina, zdravljena s H2O2, HL: skupina, zdravljena z nizkim odmerkom salidrozida, HH: skupina, zdravljena z visokim odmerkom salidrozida, ML: skupina, zdravljena z nizkim odmerkom akteozida, MH: skupina, zdravljena z visokim odmerkom akteozida, IL: skupina, zdravljena z nizkim odmerkom izoakteozida, IH: skupina, zdravljena z visokim odmerkom izoakteozida, SL: skupina, zdravljena z nizkim odmerkom ehinakozida, SH: skupina, zdravljena z visokim odmerkom ehinakozida. ** p < 0,01="" v="" primerjavi="" z="" nezdravljeno="" skupino;="" #="" p="">< 0,05,="" v="" primerjavi="" s="" skupino,="" zdravljeno="" s="" h2o2;="" ##="" p="">< 0,01="" v="" primerjavi="" s="" skupino,="" zdravljeno="" s="">

2.2. PhG zavira znotrajcelično kopičenje ROS, ki ga povzroča H2O2-, peroksidacijo lipidov (MDA) in povečano aktivnost superoksid dismutaze (SOD) v celicah PC12

Izpostavljenost celic PC12 200 pM H2O2 za 2 uri je povečala ravni ROS, vsebnost MDA in zmanjšala aktivnost SOD (slika 2). Predhodna obdelava s PhGs je zmanjšala raven ROS, salidrozida in akteozida, visoko odmerjanje izoakteozida in predhodne obdelave z ehinakozidom pa je znatno zmanjšalo raven ROS (p < 0,01).="" predobdelava="" salidrozida="" ni="" pokazala="" vpliva="" na="" vsebnost="" mda,="">akteozidpredhodna obdelava znatno oslabila vsebnost MDA (p < 0,05).="" predobdelava="" z="" izoakteozidom="" in="" ehinakozidom="" je="" znatno="" zmanjšala="" vsebnost="" mda="" na="">

Slika 2. PhG so blokirali kopičenje ROS in MDA ter povečali aktivnosti SOD v celicah PC12. Celice PC12 smo 24 ur inkubirali s PhG (0.1 in 10 4g/mL) in nato še en čas inkubirali z 200 |^M H2O2 2 uri po odstranitvi PhG. (A) PhG so blokirali kopičenje ROS in MDA. (B) PhG so blokirali kopičenje MDA. (C) PhG so povečali aktivnosti SOD. CK: normalna skupina, model: skupina, zdravljena s H2O2, salidrozid: skupina, zdravljena s salidrozidom, akteozid: skupina, zdravljena z akteozidom, izoakteozid: skupina, zdravljena z izoakteozidom, ehinakozid: skupina, zdravljena z ehinakozidom. ** p < 0.01="" v="" primerjavi="" z="" nezdravljeno="" skupino;="" #="" p="">< 0,05,="" v="" primerjavi="" s="" skupino,="" zdravljeno="" s="" h2o2,="" ##="" p="">< 0,01,="" v="" primerjavi="" s="" skupino,="" zdravljeno="" s="">

2.3.PhGs obrnjena H2O2-inducirana apoptoza v celicah PC12

Zdravljenje s H2O2 (200 |1M) za 2 uri je bistveno povečalo apoptozo v celicah PC12, s skupno stopnjo apoptoze do 16,02 odstotka (slika 3). Vendar pa je predhodno zdravljenje s PhG (0,1 in 10 µg/mL) 24 ur zmanjšalo stopnjo apoptoze na način, ki je odvisen od koncentracije (p <0,01).>akteozid, izoakteozid inehinakozidopazno zmanjšal odstotek celične apoptoze za 4.750-6.627 odstotkov, 4.413-5.800 odstotkov, 6.593-10.047 odstotkov in 1.530-7. 510 odstotkov oz.

Slika 3. PhG so obrnili apoptozo, ki jo je povzročil H2O2-, v celicah PC12. Celice PC12 smo 24 ur inkubirali s PhG (0.1 in 10 μg/mL) in nato še 2 uri po odstranitvi PhG inkubirali z 200 pM H2O2. Nato smo apoptozo izmerili s pretočno citometrijo z uporabo PI/FITC fluorescentne sonde.

CK: normalna skupina, model: skupina, zdravljena s H2O2, salidrozid: skupina, zdravljena s salidrozidom, akteozid: skupina, zdravljena z akteozidom, izoakteozid: skupina, zdravljena z izoakteozidom,Ehinakozid: ehinakozidzdravljena skupina. ** p < {{0}}.01="" v="" primerjavi="" z="" nezdravljeno="" skupino;="" ##="" p="">< 0,01="" v="" primerjavi="" s="" skupino,="" zdravljeno="" s="">

2.4. PhG ublažili H2O2-disregulacijo poti Nrf2-ARE v celicah PC12

Pot Nrf{{0}}ARE, kot ena glavnih antioksidativnih poti v večini vrst celic, je pomembna pri uravnavanju celične rasti in celične smrti. Zato smo z imunofluorescenčno in Western blot analizo z uporabo specifičnih protiteles raziskali, ali je pot Nrf2-ARE vključena v apoptozo, ki jo povzroči H2O2-. Imunofluorescenčni test je pokazal, da so PhG (0,1 in 10 pg/mL) inducirali jedrsko translokacijo Nrf2 (slika 4). Po zdravljenju s PhGs, izoakteozid inehinakozidpovzročila delno obnovitev normalne morfologije celice. Rezultati Western blotting analize in analize gostote sive barve so pokazali, da PhG ({{0}}.1 in 10 pg/mL) nima pomembnega vpliva na izražanje Nrf2 v citoplazmi (slika 5A, B) (p > {{20}}.05), vendar povečana ekspresija Nrf2 v jedru (slika 5C, D) (p < 0,01).="" nato="" smo="" proučevali="" vlogo="" nrf2="" pri="" apoptozi,="" ki="" jo="" povzroča="" h2o2-,="" z="" uvozom="" sirna="" nrf2.="" ekspresija="" proteina="" in="" mrna="" nrf2="" je="" bila="" znatno="" znižana="" v="" vseh="" skupinah,="" zdravljenih="" s="" sirna="" nrf2="" (slika="" 5e-h).="" phg="" (0,1="" in="" 10="" pg/ml)="" so="" preprečili="" citotoksičnost,="" ki="" jo="" povzroča="" h2o2-,="" v="" skupinah="" brez="" zdravljenja="" z="" nrf2="" sirna="" (p=""><0,01), vendar="" je="" bila="" taka="" zaščita="" obrnjena="" z="" nrf2="" sirna.="" po="" zdravljenju="" s="" sirna="" nrf2="" se="" je="" viabilnost="" celic="" znatno="" zmanjšala="" tudi="" pri="" zdravljenju="" s="" phg="" (slika="">

Slika 5. Zaščitni učinek PhG na Nrf2 v celicah PC12, obdelanih s H2O2-. (A) Ekspresija proteina Nrf2 v citoplazmi je bila odkrita z imunoblotingom z uporabo specifičnega protitelesa. p-Aktin je bil uporabljen kot kontrola obremenitve. (B) Kvantitativna denzitometrična analiza proteina Nrf2 v citoplazmi. (C) Ekspresija proteina Nrf2 v jedru je bila odkrita z imunoblotingom z uporabo specifičnega protitelesa. Histoni H3 so bili uporabljeni kot kontrola obremenitve. (D) Kvantitativna denzitometrična analiza proteina Nrf2 v jedru. (E, F) PC12 celice so bile predhodno inkubirane brez (E) ali z (F) Nrf2 siRNA 24 ur, nato inkubirane z ali brez PhG (0.1 in 10 昭/mL) 24 ur in inkubirali s H2O2 še 2 uri po odstranitvi PhG. Ekspresija celotnega proteina Nrf2 je bila odkrita z imunoblotingom z uporabo specifičnega protitelesa, p-aktin pa je bil uporabljen kot kontrola obremenitve. (G) Kvantitativna denzitometrična analiza celotnega proteina Nrf2. (H) Kvantitativna analiza mRNA Nrf2. (I) Celice PC12 so bile predhodno inkubirane z ali brez siRNA 24 ur, nato inkubirane z ali brez PhGs (0,1 in 10 -/mL) 24 ur in inkubirane s H2O2 še 2 uri po odstranitvi PhGs. Po zdravljenju smo celice preživetja določili z MTT testom. CK: normalna skupina, model: skupina, zdravljena s H2O2, kontrolni Si: kontrolna skupina, zdravljena s siRNA, negativna SiRNA: skupina, zdravljena s siRNA, pozitivna SiRNA: skupina, zdravljena s SiRNA, salidrozid: skupina, zdravljena s salidrozidom, akteozid: skupina, zdravljena z akteozidom, izoakteozid: zdravljena z izoakteozidom skupina,Ehinakozid: skupina, zdravljena z ehinakozidom. ** p < {{0}}.01="" v="" primerjavi="" z="" nezdravljeno="" skupino;="" #="" p="">< 0.05,="" v="" primerjavi="" s="" skupino,="" zdravljeno="" s="" h2o2="" (brez="" obdelane="" s="" sirna="" nrf2),="" ##="" p="">< 0,01,="" v="" primerjavi="" s="" skupino,="" zdravljeno="" s="" h2o2="" (brez="" obdelane="" s="" sirna="" nrf2);="" &="" p="">< 0,05="" v="" primerjavi="" s="" skupino,="" zdravljeno="" s="" h2o2="" (z="" obdelano="" s="" sirna="" nrf2),="" in="" p="">< 0,01="" v="" primerjavi="" s="" skupino,="" zdravljeno="" s="" h2o2="" (z="" obdelano="" s="" sirna="">

2.4. PhGs obrnil H2O2-inducirano znižanje ekspresije proteinov HO-1, NQO1, GCLC in GCLM

HO{{0}}, NQO1 in glutamat-cistein ligaza (GCL) so pomembni celični antioksidativni encimi, HO-1, NQO1 in katalitične ali modificirane podenote GCL (GCLC ali GCLM) pa so Nrf2-regulirani nižji geni [27]. Po zdravljenju so opazili izražanje beljakovin HO-1, NQO1, GCLC in GCLM. Ugotovljena je bila očitna razlika med izražanjem beljakovin HO-1 in NQO1 z ali brez H2O2 (slika 6A-C) (p < 0.01).="" phg="" (0.1="" in="" 10="" p^g/ml)="" so="" obrnili="" h2o2-inducirano="" znižano="" regulacijo="" izražanja="" beljakovin="" ho-1="" (razen="" salidrozida="" pri="" {{32}="" },1="" pg/ml),="" nqo1="" (razen="" akteozida="" pri="" 0,1="" pg/ml)="" (p="">< 0,01).="" h2o2="" je="" prav="" tako="" znižal="" ekspresijo="" beljakovin="" gclc="" in="" gclm="" (p=""><0,05) (slika="" 6a,="" d,="" e).="" phg="" (0,1="" in="" 10="" pg/ml)="" so="" obrnili="" h2o2-inducirano="" znižano="" regulacijo="" izražanja="" beljakovin="" gclc="">ehinakozidpri {{0}}.1 pg/mL) (p < 0.{01)="" in="" gclm="" (razen="" salidrozida="" pri="" 0.1="" pg/ml)="" (="" p="">< 0.01).="" nato="" so="" bili="" kemični="" inhibitorji="" za="" ho="" -1="" uporabljeni="" za="" nadaljnjo="" oceno="" vloge="" antioksidativnih="" encimov="" pri="" uravnavanju="" zaščite="" phg="" pred="" citotoksičnostjo,="" ki="" jo="" povzroča="" h2o2-.="" phg="" (0,1="" in="" 10="" pg/ml)="" so="" preprečili="" citotoksičnost,="" ki="" jo="" povzroča="" h2o2-,="" vendar="" je="" bil="" tak="" zaščitni="" učinek="" obrnjen="" z="" zaviralcem="" ho-1="" znpp="" (p="">< 0,01)="" pri="" 20="" pm="" (slika="" 6f,="" p="">< 0,01)="">

2.5. Ekspresija Keap1 in analiza molekularnega priklopa

V fizioloških pogojih Keap1 deluje kot represorski protein Nrf2 z vezavo na domeno Neh2 Nrf2 in usmerjanjem Nrf2 na ubikvitin ligazo E3 na osnovi Cul3- za vseprisotnost in kasnejšo razgradnjo s proteasomom 26S [28]. Sposobnost vezave PhG na Keap1 je bila ovrednotena z analizo molekularnega priklopa, da bi raziskali mehanizem pod njihovim antioksidativnim učinkom.

3. Razprava

Raziskali smo nevroprotekcijo PhG na citotoksičnost, ki jo povzroča H2O2, v celicah PC12. Rezultati kažejo, da je predhodno zdravljenje s PhG znatno zavrlo citotoksičnost, ki jo povzroča HzOz, zmanjša znotrajcelično raven ROS, izboljša raven znotrajceličnih antioksidativnih encimov in končno obrne citotoksičnost, ki jo povzroča H2O2-, v celicah PC12. Poleg tega so PhG povečali transkripcijsko aktivacijo Nrf2, obrnili z HzOz inducirano znižanje ekspresije proteina HO-1, NQO1, GCLC in GCLM. Poleg tega so PhG pokazali potencialno interakcijo z veznim mestom Nrf2 v proteinu Keap1.

Pri poškodbi celic PC12, ki jo povzroči H2O2-, je peroksidacija lipidov, ki se nanaša na oksidativno razgradnjo lipidov, povečala prepustnost membran, kar je povzročilo poškodbe celic [29]. Tvorba MDA se pogosto uporablja kot indeks peroksidacije lipidov [30]. H2O2 je povečal proizvodnjo ROS in izčrpal antioksidativne obrambne encime, kot so SOD, katalaza in GPx. Ta proces vodi do oksidativnega stresa [31], ki ima ključno vlogo pri vzročnosti in napredovanju večine nevrodegenerativnih motenj. V skladu s prejšnjimi študijami smo opazili povečano raven ROS, zmanjšane intracelularne antioksidativne encime in povečano apoptozo celic PC12 po zdravljenju s H2O2. Predhodna obdelava s PhGs je znatno oslabila z HzOz povzročeno povečanje znotrajceličnega ROS, izboljšala znotrajcelične antioksidativne encime in na koncu odpravila citotoksičnost, ki jo je povzročil HzOz v celicah PC12.

Kuang et al. [32] je poročal o temehinakozidje pokazalo pomemben nevroprotektivni učinek na citotoksičnost, ki jo povzroča H2O2-, v celicah PC12 prek mitohondrijske apoptotične poti. V tej študiji smo ugotovili, da so ehinakozid, salidrozid, akteozid in izoakteozid pokazali nevroprotektivne učinke s povečanjem antioksidativne aktivnosti celic PC12, ker so povečali transkripcijsko aktivacijo Nrf2 in navzgor regulirali ekspresijo beljakovin HO-1, NQO1, GCLC in GCLM. Številne študije so jasno pokazale, da aktivacija ciljnih genov Nrf2, zlasti HO -1, v astrocitih in nevronih močno ščiti pred vnetjem, oksidativnimi poškodbami in celično smrtjo. Poročali so, da je sistem HO -1 zelo aktiven v centralnem živčnem sistemu in njegova modulacija očitno igra ključno vlogo v patogenezi nevrodegenerativnih motenj [33]. Nedavne študije so tudi pojasnile vlogo Nrf2 pri napredovanju in tveganju za PD [9] in Keap1 kot učinkovito tarčo za ponovno aktivacijo Nrf2 pri AD [34]. Rezultati podpirajo nove dokaze za Nrf2 kot terapevtski cilj pri nevrodegenerativnih boleznih.

Analiza molekularnega priklopa je pokazala, da se PhG lahko vežejo na Keap1 z naslednjimi vezavnimi sposobnostmi:ehinakozid>izoakteozid > akteozid > salidrozid. V skladu s temi rezultati je predhodna obdelava s PhG vodila do jedrske translokacije Nrf2 z naslednjim izražanjem Nrf2 v jedru:ehinakozid>izoakteozid * akteozid > salidrozid. Predpostavili smo, da je število glikozidov vplivalo na možen način vezave PhGs in Keap1, način vezave pa je dodatno povzročil sproščanje Nrf2 iz Keap1. Ta proces je povzročil aktivacijo Nrf2 in spodnjih genov ter končno zaščiti celice PC12 pred oksidativnim stresom, ki ga povzroči H2 O2 -.

4. Materiali in metode

4.1. Kemične spojine in reagenti

salidrozid (št. CAS 10338-51-9), akteozid (št. CAS 61276-17-3), izoakteozid (št. CAS 61303-13-7) inehinakozid(CAS št. {{0}}) so bili kupljeni pri YYuanye Biotechnology Company (Šanghaj, Kitajska). PhGs so bili raztopljeni v PBS, da je nastala osnovna raztopina 10 mg/mL, ki je bila shranjena pri -20 stopinjah. H2O2 je bil kupljen pri Aladdin® (Šanghaj, Kitajska). Medij RPMI-1640 in fetalni goveji serum sta bila kupljena pri Hyclone (Logan, UT, ZDA), 0,5-odstotni tripsin EDTA, penicilin in streptomicin pa so bili kupljeni pri Keyi (Hangzhou, Kitajska). Diagnostični kompleti MDA, SOD, MTT in DCFH-DA so bili kupljeni pri Beyotime Institute of Biotechnology (Nanjing, Jiangsu, Kitajska). Komplet za dvojno barvanje Annexin V-FITC/PI je bil kupljen pri Solarbio Life Sciences (Peking, Kitajska). Protitelesa proti Nrf2, histonu H3, Keap1, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM in p-aktinu, proti mišjemu hrenovemu peroksidu (HRP) IgG in proti kunčjemu HRP-IgG so bila kupljena pri Abcam (London, Združeno kraljestvo). Inhibitorji HO-1 in ZnPP so bili kupljeni pri Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, ZDA). RNAiso Plus, reagentni komplet PrimeScript™RT z radirko gDNA in SYBR® Premix Ex Taq™ II so bili kupljeni pri Takari (Shiga, Japonska). Transfekcijski reagent Lipofectamine® RNAiMAX je bil kupljen pri Thermo Fisher Scientific (Waltham, UK). Zaporedja siRNA Nrf2 so bila naslednja: naprej, CCGAAUUACAGUGUCUUAA; in obratno, UUAAGACACUGUAAUUCGG. Medtem so bile kontrolne sekvence siRNA naslednje: naprej, UUCUCGAACGUGUCACGU; in obratno ACGUGACACGUUCGGAGAA.

4.2. Celična kultura

Linija mišjega nadledvičnega feokromocitoma (celice PC12) je bila pridobljena z Inštituta za biokemijo in celično biologijo, SIBS (CAS, Šanghaj, Kitajska). Celice so vzdrževali v RPMI-1640 (Hyclone), ki je vseboval 10 odstotek fetalnega govejega seruma (Hyclone), 100 U/mL penicilina in 0,1 mg/mL streptomicina pri 37 stopinjah s 5 odstotki CO2. Medij smo menjali vsak drugi dan.

4.3. Test viabilnosti celic

Celice PC12 so bile zasejane v 96-plošče z vdolbinicami po 2 x 104 celic/vdolbinico. Po pritrditvi smo celice predhodno inkubirali z ali brez inhibitorja 20 minut, inkubirali z ali brez PhGs 24 ur in nato inkubirali s H2O2 še 2 uri po odstranitvi PhGs. Po inkubaciji smo celice obdelali s 5 mg/mL MTT 4 ure pri 37 stopinjah in medij skrbno odstranili. Kristale formazana, ki so jih oblikovale preživele celice, smo raztopili v 150 mL DMSO, da smo pridobili modro barvo [35], absorbanco pa smo izmerili pri 570 nm na bralniku plošč. Kontrole so uporabile enako koncentracijo medija samo z DMSO. Viabilnost celic je bila normalizirana kot odstotek kontrole.

Koncentracije PhG (0.1, 1, 5 in 10 Rg/mL) so bile izbrane glede na analizo citotoksičnosti PhG in poročanega citoprotektivnega učinka ehinakozida [32]. V skladu s poročilom ni bilo citotoksičnega učinka, ki bi se pokazal pod 10 Rg/mL, poročali pa so, da ima ehinakozid citoprotektivni učinek v modelu celic, poškodovanih z HzOz.

4.4. Test apoptoze

Apoptozo smo odkrili s kompletom za dvojno barvanje Annexin V-FITC/PI (Solarbio). Celice PC12 so bile zasejane v 6-plošče z vdolbinicami po 2 x 105 celic/vdolbinico. Po pritrditvi smo celice obdelali s PhG (0,1 in 10 ug/mL) 24 ur in inkubirali s H2O2 še 2 uri po odstranitvi PhG. Po inkubaciji smo celice sprali v hladnem PBS, dvakrat centrifugirali pri 1500 obratih na minuto 10 minut in resuspendirali v 500 rL vezavnega pufra. FITC-označen aneksin V (5 rL) in propidijev jodid.

4.5. Merjenje znotrajceličnega ROS, proizvodnje MDA in SOD

Znotrajcelično raven ROS smo določili z uporabo fluorescenčne sonde, občutljive na ROS, in sicer 2,7-diklorodihidrofluorescentnega diacetata (DCFH-DA). Celice PC12 so bile zasejane v 6-plošče z vdolbinicami po 2 x 105 celic/vdolbinico. Po pritrditvi smo celice obdelali s PhG (0,1 in 10 μg/mL) 24 ur in inkubirali s H2O2 še 2 uri po odstranitvi PhG. Po inkubaciji smo celice trikrat sprali s PBS in nato inkubirali z 10 µM DCFH-DA. Po inkubaciji pri 37 stopinjah 20 minut smo celice sprali s PBS in zbrali z nežnim centrifugiranjem. Znotrajcelični ROS je bil izmerjen s pretočnim citometrom Gallios™ (Beckman Coulter, Brea, CA, ZDA).

MDA in SOD sta bila izmerjena s kompleti za testiranje (Beyotime Biotechnology, Nanjing, Jiangsu, Kitajska). Vsi postopki so popolnoma v skladu z navodili proizvajalca. Vsebnosti MDA in SOD smo normalizirali z ustrezno skupno vsebnostjo beljakovin.

4.6. Imunofluorescenca z jedrsko translokacijo Nrf2

Celice PC12 so bile zasejane v stekelca 6-vdolbinic z gostoto 2 x 105 na vdolbinico. Po pritrditvi smo celice obdelali s PhG (0.1 in 10 卩g/mL) 24 ur in inkubirali s H2O2 še 2 uri po odstranitvi PhG. Po inkubaciji smo celice sprali v hladnem PBS in fiksirali v 4-odstotnem paraformaldehidu 15 minut pri sobni temperaturi, čemur je sledila permeabilizacija membrane z uporabo 0,5-odstotnega Tritona X-100 v PBS 5 minut. Celice smo inkubirali z anti-Nrf2 zajčjim IgG (Abcam) s 5 odstotki FBS čez noč pri 4 stopinjah. Nato smo sekundarna protitelesa proti kuncem, konjugirana s FITC, nanesli na celice 20 minut pri sobni temperaturi. Jedra so bila v končni fazi priprave obarvana s 4z,6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI). Predmetna stekelca smo na kratko splaknili s PBS, posušili na zraku in namestili v medij proti fluorescenci v bledečem. Diapozitivi so bili vizualizirani pod laserskim konfokalnim mikroskopom (LMS780, Zeiss, Nemčija).

4.7. Ekstrakcija beljakovin

Celice PC12 smo zasejali v 100 mm posode pri 1 x 107 celic/posodo. Po pritrditvi smo celice 24 ur obdelali s PhGs (0,1 in 10 卩g/mL) in nato še 2 uri inkubirali s H2O2 z odstranitvijo PhGs. Po inkubaciji smo celice dvakrat sprali s hladnim PBS in postrgali iz posod s 1000 µL PBS. Celične homogenate centrifugiramo pri 1500 obratih na minuto 10 minut. Po obdelavi smo celične proteine ​​ekstrahirali z uporabo pufra za lizo celic Beyotime RIPA z 1 mM PMSF v skladu z navodili proizvajalca. Poleg tega so bili izolirani citoplazemski in jedrski proteini, kot je opisano v kompletu Beyotime za jedrsko in citoplazemsko ekstrakcijo. Koncentracija beljakovin v vzorcih je bila zaznana s kompletom Beyotime BCA za analizo beljakovin in vsi vzorci so bili shranjeni pri -80 stopinjah za Western blot analizo.

4.8. Western Blot analiza

Western blot analiza je bila izvedena s standardnimi metodami. Na kratko, vzorce beljakovin (20 ali 30 µg) smo ločili s SDS-PAGE in jih prenesli na PVDF membrane. Membrane so bile blokirane v 5-odstotnem mleku-TBST in inkubirane čez noč pri 4 stopinjah v primarnem protitelesu. Uporabljena protitelesa so vključevala Nrf2 (Abcam), Keap1 (Abcam), HO-1 (Abcam), NQO-1 (Abcam), GCLC (Abcam), GCLM (Abcam), Histon H3 (Abcam) in p-aktin (Abcam). Kot sekundarno protitelo smo uporabili s peroksidazo konjugiran anti-mišji IgG (Abcam) ali anti-kunčji IgG (Abcam). Proteinske pasove smo vizualizirali s serijo ChemiScope (Clinx Science Instruments, Šanghaj, Kitajska). Siva vrednost beljakovinskih pasov je bila kvantificirana z uporabo ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, ZDA).

4.9. Kvantitativni PCR v realnem času

Skupno RNA smo ekstrahirali z uporabo RNAiso Plus (Takara, Shiga, Japonska) po navodilih proizvajalca. Skupne vzorce RNA smo reverzno prepisali s kompletom reagentov PrimeScript™RT z radirko gDNA (Takara, Shiga, Japonska) v skladu z navodili proizvajalca. Kvantitativni PCR v realnem času je bil izveden z uporabo SYBR® Premix Ex Taq™ II (Takara, Shiga, Japonska) v sistemu Applied Biosystems ViiA™ 7 Real-Time PCR System. Relativno izražanje ciljnih genov je bilo normalizirano na p-aktin in analizirano z metodo 2-AACt. Sekvence primerjev za Nrf2 so bile naslednje: naprej, ACAGTGCTCCTATGCGTGAA in nazaj, TCTGGGCGGCGACTTTAT. Zaporedja primerjev za p-aktin so bila naslednja: naprej, GCTGTCCCTGTATGCCTCT; in obratno, TTGATGTCACGCACGATTT.

4.10. Transfekcija siRNA

Celice PC12 smo gojili v 6-stekelcih z vdolbinicami pri gostoti 2 x 105 na vdolbinico (za Western blot analizo) ali v 96-stekelcih z vdolbinicami pri gostoti 2 x 104 na vdolbinico (za celice analiza sposobnosti preživetja). Kontrolno siRNA in Nrf2 siRNA smo transficirali v celice z uporabo Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Po 24 urah inkubacije so bile celice obdelane z ali brez PhGs in H2O2 za navedene čase in nato uporabljene v Western blot analizi, qRT-PCR ali analizi viabilnosti celic, kot je opisano zgoraj.

4.11. Molecular Docking Analiza

Molecular docking analysis was performed to investigate the possible binding mode of PhGs to Keap1. The 3D structure of ligands was obtained from NCBI. The crystallized structure of Keap1 (PDB Code: 4L7B) was prepared using correcting structure issues (such as break bond and miss loop) using SYBYL-X 2.0. In this software simulation, crash represents the inadequate penetration between the protein and the ligand. Polar represents the hydrogen bonding and electrostatic interactions between the protein and the ligand. G-score [36] represents the hydrogen bonding, complex (ligand-protein), and internal (ligand-ligand) energies between the protein and the ligand. PMF-score [37] represents the Helmholtz free energy between the protein and the ligand. D-score [38] represents the charge and van der Waals interactions between the protein and the ligand. Chem-score [39] represents the hydrogen bonding, metal-ligand interaction, lipophilic contact, and rotational entropy, along with an intercept term between the protein and the ligand. C score represents the consensus score between the protein and the ligand, comprehensively reflecting the G, PMF, D, and Chem-scores. Tota-score reflects the binding capacity of the ligand to the protein. The best modes were generated and evaluated using the Total-score (>6) and C-score (>4).

4.12. Statistična analiza

Podatki so bili analizirani z uporabo enosmerne ANOVA z analizami LSD z uporabo SPSS. Vsi rezultati so bili potrjeni s tremi neodvisnimi poskusi. Podatki so bili izraženi kot sredstva 土 SD. Statistično pomembne razlike so bile upoštevane pri p <>

Zahvala: To študijo so podprli Kitajski nacionalni večji raziskovalni in razvojni program (št. 2017YFD0400200), kitajska naravoslovna fundacija province Zhejiang (št. R15C200002) in posebni projekt ocene tveganja varnosti kakovosti kmetijskih proizvodov (št. GJFP2018015), Ministrstvo za kmetijstvo in podeželje Kitajske.

Avtorski prispevki:Baiyi Lu in Maiquan Li sta oblikovala študijo. Maiquan Li je opravil laboratorijsko delo, analizo podatkov in napisal prispevek. Maiquan Li, Tao Xu, Fei Zhou, Mengmeng Wang, Huaxin Song, Xing Xiao in Baiyi Lu so pregledali rokopis.

1 Nacionalni inženirski laboratorij za inteligentno živilsko tehnologijo in opremo,

Ključni laboratorij za ravnanje s kmetijskimi proizvodi po žetvi Ministrstva za kmetijstvo in podeželje, Ključni laboratorij za vrednotenje hranilne vrednosti kmetijskih proizvodov Ministrstva za kmetijstvo in podeželje, Ključni laboratorij Zhejiang za predelavo kmetijskih in živilskih izdelkov, Inštitut za živilstvo Fuli, Visoka šola za biosisteme Inženiring in živilstvo, Univerza Zhejiang, Hangzhou 310058, Kitajska;

2 College of The First Clinical Medical, Univerza kitajske medicine Guangzhou,

Reference

1. Sonce, AY; Chen, YM Oksidativni stres in nevrodegenerativne motnje. J. Biomed. Sci. 1998, 5, 401-414.

2. Maheshwari, A.; Mišro, MM; Aggarwal, A.; Sharma, RK; Nandan, D. Poti, vključene v apoptozo zarodnih celic testisov, inducirano s H2O2 in vitro. FEBS J. 2009,276, 870-881.

3. Halliwell, B. Reaktivne kisikove vrste in centralni živčni sistem. J. Neurochem. 1992, 59, 1609-1623.

4. Richardson, JS; Subbarao, KV; Ang, LC O možni vlogi z železom povzročene peroksidacije prostih radikalov pri nevralni degeneraciji pri Alzheimerjevi bolezni. Ann. NY Acad. Sci. 1992, 648, 326-327.

5. Zhang, DD Mehanske študije signalne poti Nrf2-Keap1. Zdravilo Metab. Rev. 2006, 38, 769-789.

6. Itoh, K.; Tong, KI; Yamamoto, M. Molekularni mehanizem, ki aktivira pot Nrf2-Keap1 pri regulaciji adaptivnega odziva na elektrofile. Prosti Radič. Biol. med. 2004, 36, 1208-1213.

7. Kong, AN; Owuor, E.; Yu, R.; Hebbar, V.; Chen, C.; Hu, R.; Mandlekar, S. Indukcija ksenobiotičnih encimov s potjo kart kinaze in antioksidantnim ali elektrofilnim odzivnim elementom (ARE/EpRE). Zdravilo Metab. Rev. 2001, 33, 255-271.

8. Buendia, I.; Michalska, P.; Navarro, E.; Gameiro, I.; Egea, J.; Leon, R. Nrf2-ARE pathway: Nastajajoča tarča proti oksidativnemu stresu in nevrovnetju pri nevrodegenerativnih boleznih. Pharmacol. Ther. 2016, 157, 84-104. [CrossRef] [PubMed]

9. Skibinski, G.; Hwang, V; Ando, ​​DM; Daub, A.; Lee, AK; Ravisankar, A.; Modan, S.; Finucane, MM; Shabby, BA; Finkbeiner, S. Nrf2 ublaži LRRK2- in nevrodegeneracijo, ki jo povzroči a-sinuklein, z modulacijo proteostaze. Proc. Natl. Akad. Sci. ZDA 2016, 114, 1165-1170.

10. Jimenez, C.; Riguera, R. Feniletanoidni glikozidi v rastlinah: Struktura in biološka aktivnost. Nat. Prod. Rep. 1994, 11, 591-606.

11. Georgiev, M.; Alipijeva, K.; Orhan, I.; Abrašev, R.; Denev, P.; Angelova, M. Antioksidativne in inhibitorne aktivnosti holinesteraze Verbascum xanthophoeniceum Griseb. in njegovih feniletanoidnih glikozidov. Food Chem. 2011, 128, 100-105.

12. Li, N.; Wang, J.; Ma, J.; Gu, Z.; Jiang, C.; Yu, L.; Fu, X. Nevroprotektivni učinki zdravljenja s Cistanches Herba pri bolnikih z zmerno Alzheimerjevo boleznijo. Dopolnilo na podlagi dokazov. Altern. med. 2015, 2015, 103985.

13. Liu, YL; On, WJ; Mo, L.; Shi, MF; Zhu, YY; Pan, S.; Li, XR; Xu, QM; Yang, SL Protimikrobne, protivnetne aktivnosti in toksikologija feniletanoidnih glikozidov iz Monochasma savatieri Franch. ex Maxim. J. Ethnopharmacol. 2013,149, 431-437.

14. Dong, Q.; Yao, J.; Fang, JN; Ding, K. Strukturna karakterizacija in imunološka aktivnost dveh polisaharidov, ki jih je mogoče ekstrahirati s hladno vodo, iz Cistanche deserticola YC Ma. Ogljikovi hidrati. Res. 2007, 342, 1343-1349.

15. Xiong, L.; Mao, S.; Lu, B.; Yang, J.; Zhou, F.; Hu, Y.; Jiang, Y.; Shen, C.; Zhao, Y. Izvleček cvetov Osmanthusfragrans in Acteoside ščitita pred staranjem, ki ga povzroča d-galaktoza, v modelu miši ICR. J. Med. Hrana 2016, 19, 54-61.

16. Jiang, Y.; Mao, S.; Huang, W.; Lu, B.; Cai, Z.; Zhou, F.; Li, M.; Lou, T.; Zhao, Y. Profili feniletanoidnih glikozidov in antioksidativne aktivnosti Osmanthusfragrans Lour. Flowers z UPLC/PDA/MS in simuliranim modelom prebave. J. Agric. Food Chem. 2016, 64, 2459-2466.

17. Li, X.; Ja, X.; Li, X.; Sonce, X.; Liang, Q.; Tao, L.; Kang, X.; Chen, J. Salidroside ščiti pred MPP plus-inducirano apoptozo v celicah PC12 z zaviranjem poti NO. Brain Res. 2011,1382, 9-18.

18. Zhang, L.; Ding, W.; Sonce, H.; Zhou, Q.; Huang, J.; Li, X.; Xie, Y.; Chen, J. Salidroside ščiti celice PC12 pred apoptozo, ki jo povzroča MPP plus, z aktivacijo poti PI3K/Akt. Food Chem. Toxicol. 2012, 50, 2591-2597.

19. Sheng, GQ; Zhang, JR; Pu, XP; Ma, J.; Li, CL Zaščitni učinek verbaskozida na nevrotoksičnost, ki jo povzroča 1-metil-4- fenilpiridinijev ion, v celicah PC12. EUR. J. Pharmacol. 2002, 451, 119-124.

20. Wang, H.; Xu, Y.; Yan, J.; Zhao, X.; Sonce, X.; Zhang, Y.; Guo, J.; Zhu, C. Acteoside ščiti celice človeškega nevroblastoma SH-SY5Y pred celično poškodbo, ki jo povzroči beta-amiloid. Brain Res. 2009, 1283, 139-147.