Fotozaščitne in antimelanogene lastnosti različnih izvlečkov Kadsura Coccinea

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Sončno ultravijolično (UV) sevanje, za katerega so značilni UVA (320–400 nm), UVB (280–320 nm) in UVC (100–280 nm), je najbolj kritičen okoljski dejavnik, ki povzroča kožnega raka in fotostaranje zaradi citotoksičnosti, genotoksičnosti , in fototoksičnost. Natančneje, sevanje UVA in UVB obsega več kot 95 odstotkov oziroma 3 odstotke dnevnega UV obsevanja [8]. Obsevanje UVA in UVB lahko povzroči posredno ali neposredno reaktivne kisikove spojine (ROS), tako da prodre v epidermalne in/ali dermalne plasti kože, kar povzroči oksidativno poškodbo in celično smrt. V zadnjih desetletjih je UV-sevanje postalo resna skrb za zdravje kože in se še vedno nevarno širi po vsem svetu [9–11]. UV-obsevanje je neposreden in dosleden stimulator keratinocitov, ki predstavljajo približno 95 odstotkov celične mase kožne epidermalne celice. Keratinociti delujejo kot prva ovira pred mikrobnimi, kemičnimi in fizikalnimi nevarnostmi ter pomagajo pri obrambi pred sevanjem UVA in UVB. Ko so keratinociti izpostavljeni UVA in UVB, nastanejo znotrajcelični ROS, kar sproži apoptozo [12–14].

Melanociti so odgovorni za proizvodnjo in količino pigmentov melanina, ki so pomembni akterji pri biološki obrambi povrhnjice kože; njihova disregulacija lahko povzroči motnje hiperpigmentacije ali hipopigmentacije [15,16]. Melanociti so razporejeni v bazalni plasti kožne povrhnjice, na katero vplivajo tudi izpostavljenost sončni svetlobi, reaktivne kisikove vrste (ROS) in hormoni, ki stimulirajo melanocite (-MSH) [17,18]. Tirozinaza, član družine bakrovih proteinov tipa -3, je evolucijsko ohranjen metaloprotein, ki ima ključno vlogo pri melanogenezi ter pri aktivnostih monofenol monooksigenaze, kateholaze in difenolov. Znižana regulacija tirozinaze, s tirozinazo povezane beljakovine-1 (TRP-1) in s tirozinazo povezane beljakovine-2 (TRP-2) ima izrazite katalitične učinke. TRP-1 je 5,6-dihidroksiindol-2-oksidaza karboksilne kisline, TRP-2 pa DOPAkrom tavtomeraza [19,20]. Poleg tega sta transkripcijski faktor, povezan z mioftalmozo (MITF) in cAMP-responsive element-binding protein (CREB) transkripcijska faktorja, ki primarno uravnavata melanogenezo in kodira informacije o načinu in intenzivnosti stimulacije [17,21]. Številne študije so pokazale, da poti MITF in CREB uravnavata melanogenezo. MITF je ključni dejavnik pri transkripciji encimov, povezanih z melanogenezo, in osrednji regulator melanogeneze. -MSH vodi do izražanja MITF preko signalnega mehanizma, ki vključuje cAMP-povezan vezni protein (CREB). Nato MITF vstopi v jedro z zaporedjem M-box (AGTCATGTGCT), da spodbudi transkripcijo specifičnih melanogenih genov in encimov. Znano je tudi, da fosforilirani CREB stimulira -MSH, ki se veže na konsenzni element CRE v promotorju Mitf za uravnavanje transkripcije Mitf [21–24].

V tej študiji so izčrpno primerjali izvlečke korenine KC (KCR), stebla (KCS), listov (KCL) in sadja (KCF) ter izvedli večkratne ocene njihovih fotozaščitnih in antimelanogenih lastnosti.

2. Materiali in metode

2.1. Priprava izvlečkov KC

Tri leta staro rastlino KC 15 so gojili v 9-litrskem plastičnem loncu v kampusu Miryang Nacionalne univerze Pusan. KC je identificiral profesor Young Whan Choi, avtor te študije. Ti vzorci so bili deponirani kot vavčerski vzorci (pristopna številka KC- PDRL-1) v herbariju Oddelka za hortikulturno bioznanost Visoke šole za naravne vire in znanost o življenju Nacionalne univerze Pusan. Rastline so bile zadostno zalite s popolno hranilno raztopino s stopnjo prevodnosti 1.0 mS·cm−1, ki vsebuje naslednje elemente (v me·L−1): NO3-N, 16; NH4-N, 1,34; P, 4; K, 8; Ca, 8; in S, 4. Obleka KC v pristanišču je bila pridelana decembra 2020 z razvrščanjem korenin, stebel, listov in plodov (slika 1A). Pobrane vzorce smo takoj liofilizirali v zamrzovalnem sušilniku in do analize shranili v vinilne vrečke pri 20 ◦C. Posušene korenine, stebla, liste in plodove KC (20 g) zmeljemo v fin prah in ekstrahiramo pri sobni temperaturi z etilnim alkoholom. Na kratko, filtracijo in uparjanje EtOH ekstraktov KC smo izvedli pod znižanim tlakom pri 45 ◦C, čemur je sledila liofilizacija. Končno smo trdni ekstrakt (50 mg/mL) raztopili v dimetil sulfoksidu (DMSO) za nadaljnje poskuse.

cistancheherba epimedium sagittatumekstrakt

2.2. Skupna vsebnost polifenolov in flavonoidov v izvlečkih KC

Kot je bilo opisano prej [25], so bile skupne vsebnosti polifenolov in flavonoidov v izvlečkih korenine, stebla, listov in sadja KC izmerjene s kolorimetričnimi metodami Folin–Ciocalteu (skupni polifenol) in aluminijev klorid (flavonoid). Absorbanco smo izmerili pri 700 nm (skupni polifenol) z uporabo Ultrospec 6300 Pro (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, Združeno kraljestvo) in pri 510 nm (flavonoid) z uporabo VICTOR Multilabel Plate Reader (Perkin-Elmer, Waltham, MA, ZDA) .

Standardne krivulje so bile izdelane z uporabo galne kisline (skupni polifenol) in kvercetina (flavonoid) kot standardov, rezultati pa so bili izraženi kot ekvivalenti galne kisline na gram (GAE/g) izvlečkov korenine, stebla, listov in sadja KC ter ekvivalenta kvercetina na gram (QE/g) izvlečkov korenin, stebel, listov in sadja KC.

2.3. Test DPPH in ABTS

Aktivnosti odstranjevanja radikalov DPPH in ABTS izvlečkov korenine, stebla, listov in sadja KC ({{0}},5 mg/mL) so izmerili v skladu s prej opisano metodo [25] z manjšimi spremembami. Ekstrakte korenine, stebla, listov in sadja KC (0,5 mg/mL) smo zmešali z raztopino DPPH (60 µM) v mikroploščah. Ko smo vzorce močno pretresli, smo jih 0,5 ure hranili v temi pri 25 ◦C. Založne raztopine 7 mM ABTS in 2,6 kalijevega persulfata so bile pripravljene v destilirani vodi pri sobni temperaturi v temi 18 ur. Ekstrakte korenin, stebel, listov in plodov KC (0,5 mg/mL) smo zmešali z delovno raztopino in nato pustili stati 0,5 ure pri sobni temperaturi v temi. Absorbanco mešanic vzorcev smo spremljali pri 510 nm (DPPH) ali 734 nm (ABTS).

2.4. Celična kultura

Prilepljene keratinocite (HaCaT) in prilepljene melanocite (B16F10) smo cepili v raztopino kulture DMEM (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, ZDA), ki je vsebovala 10 odstotkov FBS (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, ZDA) in 1 odstotek penicilina/streptomicina (Invitrogen). Corporation, Carlsbad, CA, ZDA) in gojene pri 37 ◦C s 5 odstotki CO2. Redno smo opazovali adherirano rast celic HaCaT in B16F10, gojišče pa smo menjali vsake dva do tri dni. Celice iz logaritemske faze rasti so bile uporabljene za nadaljnje poskuse.

2.5. UVA in UVB obsevanje

Keratinociti so bili izpostavljeni UVA ali UVB obsevanju (Bio-Link BLX-365, Villber-Lourmat, Eberhardzell, Nemčija) z 5 8 W cevmi, ki oddajajo večino svoje energije na vrhu emisije pri 365 nm ( UVA) ali 312 nm (UVB). Doze obsevanja UVA so bile 20 J/cm2, doze obsevanja UVB pa 50 mJ/cm2.

2.6. Merjenje viabilnosti celic in citotoksičnosti z analizo CCK-8 in LDH

Za analizo viabilnosti celic smo keratinocitom HaCaT dodali raztopino kompleta za štetje celic-8 (CCK-8) iz kompleta za testiranje CCK-8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA). in B16F10 suspenzije melanomskih celic v skladu z navodili proizvajalca in inkubirane pri 37 ◦C 4 ure. Na kratko, 2 104 celice so bile posejane v vsako vdolbinico 24-plošče z vdolbinicami in inkubirane s 5 odstotki CO pri 37 ◦C 24 ur. Na kratko, 2 104 celice so bile posejane v vsako vdolbinico 24-plošče z vdolbinicami in inkubirane s 5 odstotki CO pri 37 ◦C 24 ur. Po 24 urah inkubacije smo v vsako vdolbinico dodali reagent CCK-8 in celice nadalje inkubirali 4 ure. Za določanje sproščanja zunajcelične laktat dehidrogenaze (LDH) v gojišču keratinocitov HaCaT smo uporabili komplet za odkrivanje citotoksičnosti (Roche Applied Science, Švica). Absorbanco smo analizirali pri 450 nm (CCK-8) in 490 nm (LDH) z uporabo čitalnika plošč VICTOR Multilabel Plate Reader.

2.7. Vrednotenje intracelularne proizvodnje ROS v keratinocitih

Intracelularne ravni ROS so bile analizirane z uporabo {{0}}(in-6)-klorometil-2',7'-diklorid-hidrofluorescein diacetat acetil estra (CM-H2DCFDA; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA). Vsi postopki so bili izvedeni po navodilih proizvajalca. Na kratko, po obdelavi z drugimi delnimi ekstrakti KC (0.5 mg/mL) smo keratinocite (HaCaT) sprali s fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS) in inkubirali s CM-H2DCFDA (5 µM) 0,5 ure v Mrak. Nato smo generiranje znotrajceličnega ROS vizualizirali s fluorescenčnim mikroskopom Carl Zeiss; intenzivnost fluorescence je bila izmerjena na podlagi fluorescentnega barvila (CM-H2DCFDA) z uporabo pretočnega citometra (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, ZDA).

2.8. Analiza apoptoze

Po izpostavljenosti in zdravljenju so keratinocite HaCaT tripsinizirali in centrifugirali. Nato smo ovrednotili apoptozo pridobljenih celic z uporabo fluorescein izotiocianata (FITC) Annexin V/Dead CellApoptosis Kit (Invitrogen Life Technologies, Carls-bad, CA, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Na kratko, keratinocite smo dvakrat splaknili s PBS in pridobili keratinocite v pufru za vezavo aneksina ter zmešali s FITC/Aneksinom V (komponenta A) in delovno raztopino propidijevega jodida (PI). Po inkubaciji pri sobni temperaturi 15 minut v temi smo izmerili apoptozo keratinocitov in izračunali odstotek apoptotičnih celic z uporabo pretočnega citometra (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, ZDA). Zaznani so bili signali za kanale FL1 (FITC/Nexin V) in FL3 (PI), vzpostavljeno je bilo obarvanje kvadrantnega markerja in pikčasti izrisi obarvanih celic.

2.9. Analiza znotrajcelične vsebnosti melanina in aktivnosti tirozinaze

Intracelularni testi vsebnosti melanina in aktivnosti tirozinaze so bili izmerjeni z razlago, kje se nekoliko spremenjeni postopek razlikuje [24]. Melanocite smo 48 ur obdelali s končno koncentracijo 0,5 µM -MSH in 0,5 mg/mL KC drugih delnih ekstraktov. Melanocitne pelete smo lizirali z 1 N NaOH v 10 odstotkih DMSO pri 80 ◦C 1 uro. Relativno vsebnost melanina je bila določena z merjenjem absorbance pri 475 nm z uporabo VICTORMultilabel Plate Readerja. Aktivnost znotrajcelične tirozinaze je bila določena z merjenjem hitrosti proizvodnje dopakroma z uporabo L-DOPA. Melanocite smo sprali z ledeno mrzlim PBS in lizirali v PBS, ki je vseboval 1 odstotek (m/v) Tritona X-100. Substrat tirozinaze L-DOPA (2 mg/mL) smo pripravili v istem pufru za lizo fosfata. Vsak ekstrakt smo dali v 96-ploščo z vdolbinicami in z dodajanjem raztopine L-DOPA smo začeli analizo encimov. Po 1-urni inkubaciji smo izmerili absorbanco pri 475 nm z uporabo VICTOR Multilabel Plate Readerja za analizo proizvodnje dopakroma. Vrednost vsake meritve je bila izražena kot odstotek kontrole. Arbutin (A, 0,5 mg/mL) je bil uporabljen kot pozitivna kontrola.

Cistancheehinakozidje zaviralec tirozinaze.

2.10. Kvantitativni PCR v realnem času

Celotno RNA smo izolirali iz vsake skupine melanocitov z uporabo RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Nemčija). Reverzna transkripcija je bila izvedena z visokozmogljivim kompletom za reverzno transkripcijo cDNA (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, ZDA), v skladu z navodili proizvajalca, da smo dobili prvo verigo cDNA. Prameni so bili nato uporabljeni kot predloge za kvantitativno PCR v realnem času (qRT-PCR) z uporabo instrumenta Bio-Rad Chromo4TM in glavne mešanice SYBR Green qPCR (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, ZDA). PCR je bil izveden pod preddenaturacijo pri 95 ◦C 5 minut, denaturacijo pri 95 ◦C 15 s in žarjenjem pri 55–58 ◦C 30 s. MRNA GAPDH je bila uporabljena kot interna referenca za mRNA tirozinaze, TRP-1 in TRP-2. Relativna vrednost izražanja ciljnega gena=2−∆∆CT. Primerna zaporedja so bila naslednja: Tirozinaza-smisel (5′-ggccagctttcaggcagaggt-3′), Tirozinaza-anti-smisel (5′-tggtgcttcatgggc aaaatc-3′), TRP-1-smisel (5 ′-agccccaactctgtcttttc-3′), TRP-1-protičutno (5′-ggtctccctacatttccagc-3′), TRP-2-čutno (5′- tccagaagtttgacagccc-3 ′), TRP-2-protismisel (5′-ggaaggagtgagccaagttatg-3′), GAPDH-smisel (5′-aggtggtctcctctgacttc-3′) in GAPDH-protismisel (5′-taccaggaaatgagcttgac -3′).

2.11. Western Blotting

Melanocite smo pobrali in lizirali z uporabo reagenta za ekstrakcijo beljakovin sesalcev (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA). Vsi postopki so bili izvedeni po navodilih proizvajalca. Vse koncentracije beljakovin so bile določene z uporabo kompleta za analizo beljakovin Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA). Nato smo proteinskemu supernatantu dodali nakladalni pufer in premešali. Zmes smo kuhali 10 minut in proteine ​​ločili z uporabo Mini-PROTEAN Precast Gels (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA) in prenesli na poliviniliden difluoridno membrano Hybond (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, ZDA). Imunodetekcija je bila izvedena z uporabo tirozinaze (1:1000), TRP-1 (1:1000), TRP-2 (1:1000), MITF (1:1000), fosforiliranega CREB(p-CREB 1: 1000), CREB(1:1000) in -tubulin (1:1000) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, ZDA) z uporabo kompleta SignalBoost Immunoreaction Enhancer Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA). Membrano smo čez noč inkubirali s primarnimi protitelesi pri 4 ◦C. Kozje anti-kunčje (IgG) sekundarno protitelo (1:5000, Cell Signaling Technology) je bilo dodano membrani in inkubirano pri sobni temperaturi 1 uro. Proteinske pasove smo opazili z uporabo izboljšanega substrata Pierce ECL Western blotting (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) in kvantificirali kot razmerje med intenzivnostjo ciljnega proteinskega pasu in intenzivnostjo pasu -tubulina.

2.12. Statistična analiza

Vsi testi so bili neodvisno ponovljeni vsaj trikrat. Vsi statistični parametri so predstavljeni kot povprečna standardna napaka povprečja (SEM). Statistične analize so bile izvedene z uporabo enosmerne analize variance (ANOVA), ki ji je sledil Dunnov post-hoc test. Vrednost p < 0.01="" ali="" p="">< 0,05="" je="" veljala="" za="">

test za flavonoide

3. Rezultati

3.1. Primerjava antioksidativnih lastnosti več delnih izvlečkov KC

The total polyphenol and flavonoid contents and ABTS and DPPH scavenging activities were compared to determine the potential effects of KCR, KCS, KCL, and KCF extracts on antioxidant capacity. As shown in Figure 1B, the KCR extract(197.6 27.2 mg GAE/g) exhibited the highest phenol content, followed by KCL (153.7 6.7 mg GAE/g) and KCS (88.1 7.8 mg GAE/g); the KCF (21.8 4.8 mg GAE/g) extract had the lowest phenol content. Moreover, the results of flavonoid content analyses showed that KCL (94.5 6.3 mg QE/g) had the highest flavonoid content followed by KCR (79.6 4.2 mg QE/g); the KCS (14.9 1.3 mg QE/g) and KCF (6.4 2.0 mg QE/g) extracts had the lowest flavonoid content (Figure 1C). To further investigate the antioxidant properties of KCR, KCS, KCL, and KCF, ABTS and DPPHradical scavenging assays were performed. As shown in Figure 1D, KCL (94.7 ± 2.9%) and KCR (82.8 ± 5.9%) exhibited the highest ABTS radical scavenging activity, followed by the KCS (29.7 ± 2.0%) and KCF extract (15.9 ± 2.0%). DPPH radical scavenging activity was also shown in the order of KCL (99.9 ± 0.1%) > KCR (95.5 ± 3.6%) >KCS (25,7 ± 2,1 odstotka) > KCF (8,7 ± 1,1 odstotka) (slika 1E).

3.2. Primerjava živih in poškodovanih keratinocitov, obdelanih z več delnimi izvlečki KC v prisotnosti UVA, UVB ali brez obsevanja

Izvedli smo naslednje poskuse, da bi raziskali učinke KCR, KCS, KCL in KCF na keratinocite. Najprej so bili vsi izvlečki naneseni na keratinocite HaCaT v prisotnosti UVA, UVB ali brez obsevanja. Analiza CCK-8 je pokazala, da izvlečki niso pomembno spremenili viabilnosti keratinocitov pri koncentracijah 0,5 mg/mL. Kasneje so keratinocite obdelali s KCR, KCS, KCL in KCF v prisotnosti UVA ali UVB obsevanja. Obsevanje UVA in UVB je znatno zaviralo sposobnost preživetja keratinocitov, kot je pokazala analiza CCK-8 na sliki 2A. Vendar smo ugotovili, da se je sposobnost preživetja UVA- in UVB-obsevanih keratinocitov povečala v naslednjem vrstnem redu: KCL, KCR, KCS in KCF (slika 2A). Poškodovane keratinocite smo spremljali tudi z merjenjem zunajceličnega sproščanja LDH. Rezultati so pokazali, da UVA ali UVB obsevanje bistveno olajša sproščanje LDH; vendar so KCL, KCR, KCS in KCF znatno oslabili sproščanje LDH z izpostavljenostjo UVA ali UVB v tem vrstnem redu (slika 2B). Zgornji eksperimentalni rezultati so pokazali, da so bili antiproliferativni in citotoksični učinki UVA ali UVB obsevanja na keratinocite ublaženi v vrstnem redu KCL, KCR, KCS in KCF. Predvsem lahko KCL obnovi sposobnost preživetja celic na nadzorovane ravni.

Slika 2. Viabilnost keratinocitov in citotoksični učinki ekstrakta KCR, KCS, KCL in KCF v prisotnosti UVA, UVB ali brez obsevanja.

3.3. Primerjava znotrajcelične proizvodnje ROS v keratinocitih, obdelanih z več delnimi izvlečki KC v prisotnosti ali odsotnosti UVA in UVB obsevanja

Ker intracelularna proizvodnja ROS povzroča hude poškodbe keratinocitov, se štejejo za potencialne mediatorje poškodb, ki jih povzroča sevanje UVA ali UVB. Več študij je pokazalo, da UVA ali UVB obsevanje inducira endogeno proizvodnjo ROS [12,14]. Želeli smo ugotoviti, ali je prišlo do povečanja ravni endogenih ROS v UVA- ali UVB-obsevanih keratinocitih. V skladu s tem smo analizirali intracelularno fluorescenčno intenzivnost sonde CM-H2DCFDA z uporabo fluorescenčne mikroskopije in pretočne citometrije. Kot rezultat fluorescenčne mikroskopije so slike obarvanja s CM-H2DCFDA pokazale rahlo obarvanje kontrolnih keratinocitov, obdelanih s KCR, KCS, KCL in KCF, ter znatno obarvanje keratinocitov, obsevanih z UVA ali UVB (slika 3A). Glede na kvantificirane rezultate pretočne citometrije je obsevanje UVA in UVB povečalo znotrajcelične ravni ROS v keratinocitih za 27,2 ± 4,5 odstotka oziroma 34,1 ± 4,2 odstotka v primerjavi s tistim pri kontroli (5,7). ±0.2 odstotka ). Poleg tega je bilo, podobno kot pri rezultatih fluorescenčne mikroskopije, potrjeno, da je bila znotrajcelična raven ROS potisnjena z ekstrakti KC v vrstnem redu KCL > KCR > KCS > KCF v prisotnosti UVA ali UVB obsevanja (slika 3B). Ti rezultati kažejo, da je več delnih izvlečkov KC znatno zaviralo poškodbe keratinocitov z zmanjšanjem ravni endogenih ROS.

Slika 3. Učinek ekstrakta KCR, KCS, KCL in KCF na znotrajcelično proizvodnjo ROS v UVA, UVB ali neobsevanih keratinocitih

3.4. Primerjava apoptoze keratinocitov, obdelanih z več delnimi izvlečki KC v prisotnosti ali odsotnosti UVA in UVB obsevanja

Za odkrivanje apoptoze, ki je zanesljiv pokazatelj poškodbe keratinocitov, smo keratinocite obarvali z aneksinom V v kombinaciji s propidijevim jodidom. Za testiranje stopnje apoptoze v keratinocitih je bil uporabljen fluorescein izotiocianat (FITC) Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit. Obsevanje UVA in UVB je olajšalo aktivnost obarvanja z aneksinom V, medtem ko so KCR, KCS, KCL in KCF zmanjšali stopnjo aktivnosti obarvanja z aneksinom V v prisotnosti obsevanja UVA in UVB. KCR, KCS, KCL in KCF sami (0,5 mg/mL) niso povzročili aktivnosti obarvanja z aneksinom V. Kvantificirani podatki iz pretočne citometrije so pokazali, da je obsevanje UVA in UVB povečalo ravni apoptoze keratinocitov za 46,3± 1,5 odstotka in 48,7 ± 1.0 odstotkov v primerjavi s kontrolnim (5.0 odstotkov ± 0.7 odstotkov ). Pomembno je, da je bilo potrjeno, da je bila raven apoptoze zavrta z izvlečki KC v vrstnem redu KCL > KCR > KCS > KCF v prisotnosti UVA ali UVB obsevanja (slika 4A, B). Na splošno je obsevanje UVA in UVB povzročilo poškodbo keratinocitov, več delnih izvlečkov KC pa je oslabilo poškodbo keratinocitov, povzročeno z UV obsevanjem.

Slika 4. Učinek izvlečkov KCR, KCS, KCL in KCF na apoptozo v UVA, UVB ali neobsevanih keratinocitih.

3.5. Primerjava medcelične vsebnosti melanina in aktivnosti tirozinaze melanocitov, obdelanih z več delnimi izvlečki KC v prisotnosti ali odsotnosti zdravljenja z -MSH

Pred raziskovanjem biološkega potenciala KCR, KCS, KCL in KCF na melanogenezo, povzročeno z MSH, je bila viabilnost celic po zdravljenju s KCR, KCS, KCL in KCF (0,5 mg/mL) ocenjena z test CCK-8 v melanocitih B16F10 z ali brez -MSH. KCR, KCS, KCL in KCF (0,5 mg/mL) niso spremenili viabilnosti celic v prisotnosti ali odsotnosti -MSH (slika 5A). -MSH je pomembno melanogeno sredstvo, ki lahko poveča znotrajcelično vsebnost melanina z vezavo na receptor melanokortina 1 in aktiviranjem adenilat ciklaze. Da bi raziskali učinek KCR, KCS, KCL in KCF na melanogenezo v melanocitih, je bila vsebnost znotrajceličnega melanina določena z vizualnim opazovanjem in biokemičnimi meritvami. Kot je prikazano na sliki 5B, se je vsebnost znotrajceličnega melanina znatno povečala z -MSH. Vendar je sočasno zdravljenje s KCR, KCS, KCL in KCF pokazalo izjemno zmanjšanje znotrajcelične vsebnosti melanina v primerjavi z zdravljenjem z -MSH. Zaporedje biokemičnih meritev, ki kažejo na inhibicijo znotrajcelične vsebnosti melanina, je bilo naslednje: KCL > KCR > KCS > KCF (slika 5B). Test aktivnosti znotrajcelične tirozinaze je bil izveden v skladu s testom vsebnosti znotrajceličnega melanina. Aktivnost znotrajcelične tirozinaze melanocitov, stimuliranih z -MSH, se je povečala, medtem ko se je aktivnost melanocitov, stimuliranih z -MSH, zdravljenih s KCR, KCS, KCL in KCF, zmanjšala. Zaporedje biokemičnih meritev, ki kažejo na zaviranje intracelularne aktivnosti tirozina, je bilo naslednje: KCL > KCR > KCS > KCF (slika 5C). Ti rezultati kažejo, da je več delnih izvlečkov KC znatno zmanjšalo vsebnost znotrajceličnega melanina in zaviralo aktivnost tirozinaze, ne da bi spremenili viabilnost celic.

3.6. Primerjava ravni transkripcije in prevajanja tirozinaze, TRP-1 in TRP-2 v melanocitih, obdelanih z več delnimi izvlečki KC v prisotnosti ali odsotnosti- Zdravljenje z MSH

Da bi raziskali učinek KCR, KCS, KCL in KCF na znižanje ravni ekspresije beljakovin in mRNA markerjev melanogeneze (tirozinaze, TRP-1 in TRP-2), so melanocite obdelali s KCR , KCS, KCL in KCF v prisotnosti ali odsotnosti -MSH. Kot je prikazano na sliki 6A–C, so bile ravni mRNA tirozinaze, TRP-1 in TRP-2 znatno povečane z zdravljenjem z -MSH. Nasprotno pa so KCR, KCS, KCL in KCF v primerjavi z zdravljenjem z -MSH znižali ekspresijo mRNA tirozinaze, TRP-1 in TRP-2. Poleg tega KCR, KCS, KCL in KCF sami niso imeli pomembnega vpliva na ravni mRNA tirozinaze, TRP-1 in TRP-2. Western blot analiza je bila izvedena v sodelovanju s PCR v realnem času. Rezultati so pokazali, da je zdravljenje z -MSH povečalo ravni izražanja beljakovin tirozinaze, TRP-1 in TRP-2, te ravni pa so se zmanjšale s sočasnim zdravljenjem s KCR, KCS, KCL in KCF (slika 6D). ). Zaporedje kvantitativne PCR v realnem času in Western blotinding inhibicije tirozinaze, TRP-1 in TRP-2 mRNA in ekspresije beljakovin je bilo naslednje: KCL > KCR=KCS > KCF (slika 6). Ti rezultati kažejo, da ima več delnih izvlečkov KC potencial za spodbujanje anti-melanogeneze, kar se je pokazalo z znižano regulacijo markerjev melanogeneze.

3.7. Primerjava ekspresije MITF in fosforilacije CREB melanocitov, obdelanih z več delnimi izvlečki KC v prisotnosti ali odsotnosti zdravljenja z -MSH

Tirozinaza, TRP-1 in TRP-2 so bistveni pri melanogenezi. Njihovo izražanje je regulirano z ekspresijo MITF in fosforilacijo CREB [17, 21]. Western blot analiza je pokazala, da so KCR, KCS, KCL in KCF učinkovito zavirali povečanje ravni beljakovin MITF, ki ga povzroča zdravljenje z -MSH. Poleg tega so KCR, KCS, KCL in KCF sami komaj zaznali ekspresijo proteina MITF. Zaporedje kvantificiranih rezultatov Western blota, ki kažejo na inhibicijo ravni ekspresije proteina MITF, je bilo naslednje: KCL > KCR > KCS > KCF (slika 7A). Poleg tega so KCR, KCS, KCL in KCF obrnili učinke zdravljenja z -MSH na fosforilacijo CREB. KCR, KCS, KCL in KCF sami so imeli majhen učinek na fosforilacijo CREB. Zaporedje kvantificiranih rezultatov Western blota, ki kažejo na inhibicijo ravni fosforilacije CREB, je bilo naslednje: KCL > KCR > KCS > KCF (slika 7B). Ti rezultati so pokazali, da je več delnih izvlečkov KC zatrlo melanogenezo v melanocitih, vsaj delno, z izražanjem MITF in fosforilacijo CREB.

4. Razprava

Priljubljenost beljenja kože po vsem svetu narašča zaradi povečanja UV-sevanja in bo verjetno v naslednjih desetletjih dosegla visoke razsežnosti za estetske namene [8]. Na kozmetičnih in farmacevtskih trgih se uporabljajo številne vrste belil, kot sta kojična kislina in arbutin. Poleg tega so naravni izvlečki deležni vse večje pozornosti zaradi svojih potencialnih antioksidativnih, protivnetnih, protitumorskih, antibakterijskih in drugih aktivnosti [26,27]. Na podlagi značilnosti antioksidantov ter fotoprotektivnih in antimelanogeneznih sredstev je bilo razvitih več kozmetičnih in farmacevtskih kandidatov. Dobro je znano, da te lastnosti kandidatov za beljenje nepogrešljivo prispevajo k kozmetičnim in farmacevtskim raziskavam in razvoju [28]. TDM ima večkomponentne in večtarčne lastnosti ter močno izboljša človeško biološko učinkovitost in kakovost življenja [29]. Sodobne fitokemične raziskave kažejo, da KC vsebuje različne sestavine, pri čemer so glavne sestavine lignani in terpenoidi [30]. Identificiranih je bilo več kot 202 spojin, vključno z dibenzociklooktadien lignani, spirobenzofuranoid dibenzociklooktadien lignani, arilnaftalenski lignani, kadlongilakton triterpenoidi in seskviterpenoidi [31,32]. Posušene korenine, stebla in listi KC imajo široko tradicijo uporabe v TDM za zdravljenje revmatoidnega artritisa, razjed na dvanajstniku, gastrointestinalnih motenj in ginekoloških težav. Posušene korenine KC z delovanjem čiščenja toplote in izločanja toksinov povzročajo diurezo za odstranjevanje edema. Plodovi KC se večinoma uživajo v obliki svežega sadja, sokov in sadnega vina, kar kaže, da so koristni za zdravje ljudi [7,33,34]. Prejšnje študije so tudi pokazale, da je bogat z bioaktivnimi sestavinami, kot so lignani, triterpenoidi, flavonoidi, fenolne kisline, steroidi in aminokisline, ki imajo visoko hranilno in medicinsko vrednost [3,35]. V tej študiji so bili ekstrahirani različni deli KC. Predvsem je bila skupna vsebnost polifenolov in flavonoidov v listih in koreninah KC veliko višja kot v steblih in plodovih. Listi in korenine vsebujejo več kot dvakrat več polifenolov in flavonoidov kot stebla in plodovi. Posledično menimo, da skupni polifenoli in flavonoidi pomembno prispevajo k fotoprotektivnim in antimelanogenim učinkom KC.

Kožna fototoksičnost, ki jo povzroča UV-sevanje, je predvsem posledica celične citotoksičnosti, znotrajceličnega kopičenja ROS in apoptoze v keratinocitih. Zato se je bolj smiselno osredotočiti na zaviranje celične citotoksičnosti, intracelularnega kopičenja ROS in apoptoze v UVA- in UVB-obsevanih keratinocitih [36,37]. Kot je opisano v tej študiji [10,38], so rezultati intervencije z izvlečki KC na fotocitotoksičnost (UVA: 20 J/cm2, UVB: 50 mJ/cm2) pokazali, da so izvlečki KC znatno zmanjšali celično citotoksičnost, intracelularno kopičenje ROS in apoptoza. V skladu s prejšnjimi rezultati so bili fotozaščitni učinki listov in korenin KC veliko večji od učinkov stebla in plodov. Poleg tega so naši rezultati pokazali, da izvlečki KC kažejo zgoraj omenjene učinke s spodbujanjem antioksidativne aktivnosti. Melanogenezo pogosto opazimo po UV-sevanju in je povezana predvsem s pigmentacijo ali hiperpigmentacijo [39]. Glede na prejšnje študije je bila metoda indukcije melanogeneze z uporabo -MSH splošno priznana in uporabljena. Zato je ta študija temeljila na konstrukciji modela melanocitov, stimuliranih z -MSH [24,39]. Ugotovili smo, da izvlečki KC zavirajo -MSH stimulirano znotrajcelično vsebnost melanina in aktivnost tirozinaze. Poleg tega so izvlečki KC znižali transkripcijo in prevajanje markerjev melanogeneze, kot so tirozinaza, TRP-1 in TRP-2 v melanocitih, stimuliranih z -MSH. Poleg tega smo raziskali ekspresijo proteina MITF in fosforilacijo CREB v -MSH-stimuliranih melanocitih. Podobno smo v tej študiji ugotovili, da ekstrakti KC zavirajo -MSH-posredovano izražanje proteina MITF in fosforilacijo CREB v melanocitih. V skladu s fotoprotektivnimi rezultati so bili antimelanogeni učinki listov in korenin KC veliko večji od učinkov stebel in plodov.

rezine cistanche

Za več informacij kliknite tukaj.

5. Sklepi

Na splošno so bili v tej študiji ugotovljeni možni fotozaščitni in antimelanogeni učinki izvlečka KC. Ekstrakt KC z visoko vsebnostjo polifenolov in flavonoidov ima lahko fotozaščitne in antimelanogene učinke na keratinocite in melanocite. Ta študija zagotavlja utemeljitev in raziskovalno strategijo za kozmetične in farmacevtske posege za naravne belilne in fotoprotektivne agense.