PRAT 1 Cistanches Deserticola PhG-RE z zaviranjem mehanizma apoptoze ERS za zaščito apoptoze miokardnih celic pred stresom endoplazmatskega retikuluma, ki ga povzroči H2O2-

Za več informacij se obrnite na:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola ima številne učinke, kliknite tukaj za več informacij

Department of Pharmacy, China-Japan Union Hospital of Jilin University, Changchun 130033, Kitajska

Korespondenca mora biti naslovljena na Qian Yu; yuqian@jlu.edu.cn

Prejeto 9. junija 2020; Spremenjeno 15. julija 2020; Sprejeto 24. julija 2020; Objavljeno 25. septembra 2020

Akademski urednik: Michel Mansur Machado

Avtorske pravice © 2020 Tianwei Lan in Qian Yu. To je članek z odprtim dostopom, ki se distribuira pod licenco Creative Commons Attribution License, ki dovoljuje neomejeno uporabo, distribucijo in reprodukcijo v katerem koli mediju, če je izvirno delo pravilno citirano.

ZeliščeCistanchedeserticolaima nekaj zaščitnih učinkov na miokard. Ta študija je poskušala razložiti mehanizem, s katerim PhG-RE ščiti miokardne celice, in preveriti, ali se ta zaščita pojavi z uravnavanjem mehanizma apoptoze, povezanega s stresom endoplazmatskega retikuluma (ERS). Podganje miokardne celice so bile 24 ur izpostavljene 150 ug mL-1 PhG-RE in nato 18 h 100 μmol mL-1 H2O2, da so inducirali ERS in vzpostavili model celične poškodbe. Thapsigargin (TG), specifičen aktivator ERS, in 4- fenil maslena kislina (4-PBA), zaviralec ERS, sta bila uporabljena za validacijo točnosti poskusa. Naši rezultati so pokazali, da je PhG-RE bistveno izboljšal sposobnost preživetja celic, zaščitil celice ter zmanjšal poškodbe in apoptozo celic. PhG-RE je igral podobno vlogo kot zaviralec ERS 4-PBA pri zaščiti miokardnih celic pred apoptozo in poškodbami, ki jih povzroča stres ER. Poleg tega je PhG-RE znatno oslabil ekspresijo mRNA z ERS povezanih apoptotičnih faktorjev GRP78, CHOP in kaspaze-12 ter ekspresijo beljakovin z ERS povezanih apoptotičnih faktorjev GRP78, CHOP, kaspaze-12, in p-JNK. Te ugotovitve skupaj kažejo, da lahko PhG-RE učinkovito ščiti miokardne celice ter zmanjša apoptozo in poškodbe celic, kar je lahko povezano z regulacijo apoptoze, povezane z ERS.

1. Uvod

Cistanche deserticola(C. deserticola) je ena od zeliščnih rastlin, ki se uporabljajo v tradicionalni kitajski medicini in rastejo v puščavskih okoljih. Thefeniletanoidglikozid-bogati ekstrakt (PhG-RE) je glavna aktivna sestavinaC. deserticola. Raziskave so pokazale, da lahko PhG-RE zaščiti miokard pred ishemično-reperfuzijsko (I/R) poškodbo [1].

Ko se ERS začne pojavljati v miokardnih celicah, se raven z glukozo reguliranega proteina 78 (GRP78) poveča, da prepreči poškodbo, ki jo povzroči ERS. Ko ERS napreduje, se sproži apoptoza in ekspresija homolognega proteina CCAAT/proteina, ki veže ojačevalec (CHOP), c-Jun N-terminalne kinaze (JNK) in proteinaze, specifične za cisteinil aspartat-12 (kaspase{{8). }}) poveča. Na primer, izražanje GRP78, CHOP in razcepljenega ATF6 (c-ATF6) v miokardnih celicah podgan s HF je znatno povečano in aktivirani so PERK (p-PERK), IRE1 (p-IRE1) in p-JNK [2]. Poleg tega ERS, ki ga povzroči poškodba I/R, poveča izražanje GRP78 in CHOP [3]. Stopnje fosforilacije PERK in eIF2 so povečane [4]. Ekspresija proapoptotičnih proteinov Bax in kaspaze -3 se poveča, kar povzroči rupturo celic in preoblikovanje miokarda [5], povečata se območje miokardnega infarkta in miokardna encimska aktivnost [3]. Med našimi prejšnjimi raziskavami smo ugotovili, da lahko PhG-RE zaščiti miokard pred ishemično-reperfuzijsko poškodbo in lahko znatno zmanjša območje miokardnega infarkta, ki ga povzroči I/R [1]. Vendar pa ni jasno, ali lahko PhG-RE zavira apoptozo, povezano z ERS, in s tem zmanjša izgubo miokardnih celic in apoptozo. V tej študiji so bile celice predhodno obdelane s PhG-RE, da bi ugotovili, ali lahko PhG-RE zavira ERS, ki ga povzroči H2O2-, in tako zmanjša izgubo miokardnih celic in apoptozo. Tapsigargin (TG), specifični aktivator ERS, in 4-fenilmaslena kislina (4-PBA), zaviralec ERS, sta bila uporabljena za nadaljnje preverjanje, ali lahko posredovanje ERS učinkovito zmanjša celično apoptozo in ali ta proces je povezan z ravnmi izražanja GRP78, CHOP, JNK in kaspaze-12, za katere je bilo dokazano, da posredujejo ERS, povezaneapoptoza.

Cistanche lahko prepreči celično apoptozo

2. Materiali in metode

2.1. Reagenti.

Razdelek o materialih in metodah mora biti izčrpen, da je mogoče vse postopke ponoviti. Če je opisanih več metod, se lahko razdeli na pododdelke z naslovom. Miokardne celice H9c2 podgan so bile pridobljene iz Cell Bank Kitajske akademije znanosti (Šanghaj, Kitajska).C. deserticolaCistanchedeserticolaPhG-RE je bil pridobljen pri Changchun Medicinal Material Co. (Changchun, Kitajska), identificiral ga je dr. Zhong-ying Liu (Šola za farmacevtske vede, Univerza Jilin) ​​in deponiran v herbariju Oddelka za farmacijo Univerze Jilin (vzorec vavčerja). številka: YQCD2014). Dulbeccov modificiran Eagleov medij (DMEM) je bil pridobljen pri GIBCO (Grand Island, NY). Thapsigargin in 4-PBA sta bila pridobljena pri Sigmi (St. Louis, MO). Komplet za testiranje aktivnosti laktat dehidrogenaze (LDH) in komplet CCK-8 sta bila kupljena pri Dojindo Molecular Technologies (Tokio, Japonska). Fetalni goveji serum (FBS) je bil kupljen pri HyClone (Utah, ZDA). Komplet za testiranje celične apoptoze Annexin V-FITC je bil kupljen pri Beyotime Biotechnology (Šanghaj, Kitajska). Tripsin je bil kupljen pri Beijing Solarbio Life Sciences (Peking, Kitajska). Komplet ReverTra Ace qPCR RT je bil kupljen pri TOYOBO (Tokio, Japonska). FastStart Universal SYBR Green master mix (Rox) je bil kupljen pri Roche (Basel, Švica).

2.2. Protitelesa.

Zajčji poliklonski GADD153/CHOP in zajčji poliklonski GRP78/HSPA5 Abs so bili kupljeni pri Novus (Colorado, ZDA). Mišje/podgana afinitetno prečiščena poliklonska antiteletika s kaspazo-12 je bila kupljena pri R&D Systems (Minnesota, ZDA). Phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) (81E11) kunčja in -aktinska (13E5) kunčja mAbs so bila kupljena pri Cell Signaling Technology (Massachusetts, ZDA). Fluorescentne sekundarne Abs so bile kupljene pri LI-COR Biosciences (Nebraska, ZDA).

2.3. Skupine in zdravljenje.

Celice H9c2 v logaritemski fazi rasti smo izbrali in obdelali v naslednjih skupinah: (1) kontrolna skupina: miokardne celice H9c2 smo gojili v popolnem gojišču; (2) skupina PhG-RE: celice smo 24 ur obdelovali v mediju, ki je vseboval 150 ug mL-1 PhG-RE; (3) Skupina modela poškodbe, povzročene z ERS (skupina H2O2): celice so bile 18 ur obdelane v mediju, ki je vseboval 100 μmol mL-1 H2O2; (4) (PhG-RE) –H2O2 skupina: celice smo 24 h obdelovali v mediju, ki je vseboval 150 ug mL-1 PhG-RE in nato 18 h v 100 μmol mL-1 H2O2; (5) (4-PBA)

–H2O2 skupina: celice smo 24 h obdelovali v gojišču s 5 mmol·mL−1 4-PBA in nato 18 h v 100 μmol·mL−1 H2O2; (6) Skupina TG: celice so bile zdravljene

18 h v mediju, ki vsebuje 50 nmol·mL-1 TG; in (7) (PhG-RE) -TG: celice smo 24 ur obdelovali v mediju, ki je vseboval 150 ug·mL-1 PhG-RE in nato 18 ur v 50 nmol·mL-1 TG.

2.4. Celična kultura.

Miokardne celice H9c2 smo gojili v DMEM, ki je vseboval 10 odstotkov FBS in 1 odstotek penicilin-streptomicina pri 37 stopinjah v inkubatorju s 5 odstotki CO2. Celoten medij je bil zamenjan vsaka 2 d. Celice so bile opazovane pod mikroskopom in dobro so rasle v fuziformni obliki. Ko je gostota rasti dosegla 70–85 odstotkov, so bile celice subkultivirane v razmerju 1:4.

2.5. CCK-8 Ocena sposobnosti preživetja celic.

Celice H9c2 smo mikroskopsko pregledali in izbrali celice v logaritemski fazi rasti. Suspenzijo celic smo pridobili s tripsinsko razgradnjo in centrifugirali 5 minut v 5 ml centrifugalni epruveti pri 1000 r/min. Ko smo preostalo tekočino zavrgli, smo uporabili 3 ml popolnega medija DMEM za resuspendiranje celičnih peletov v 100 μL na jamico in

Pod mikroskopom smo prešteli 5.0 103 celic. Celice smo prenesli na 96-ploščo z vdolbinicami in jih gojili v inkubatorju (37 stopinj, 5 odstotkov CO2) 24 ur, da smo dobili popolnoma sprijete celice. Optično gostoto (OD) smo izmerili pri valovni dolžini 450 nm.

Preživetje celic (odstotki) (poskusna skupina OD − slepa skupina OD)/(kontrolna skupina OD − slepa skupina OD) × 100 odstotkov.

2.6. Spektrofotometrična meritev celične poškodbe.

Laktat dehidrogenaza (LDH) je encim v citoplazmi, ki se sprosti ob poškodbi celice, ki nato stabilno obstaja v gojišču. Stopnjo celične poškodbe lahko določimo z merjenjem aktivnosti LDH v mediju. Ta poskus je bil izveden v skladu z navodili za komplet. OD je bila izmerjena pri valovni dolžini 490 nm. V vsaki skupini so bili trije vodnjaki.

2.7. Odkrivanje apoptoze z barvanjem z aneksinom V-FITC/PI.

Supernatant smo odstranili in prenesli v epruveto za pretočno citometrijo. Pripravili smo celično suspenzijo z adherentnimi celicami na dnu posode za prebavo tripsina. Potem ko smo suspenzijo centrifugirali 6 minut pri 1.2 103 r min-1, smo supernatant zavrgli in celične pelete trikrat sprali s PBS. Ta poskus je bil izveden v skladu z navodili za komplet za apoptozo celic Annexin V-FITC. Ko smo celice gojili 15 minut pri sobni temperaturi v temi, smo celice analizirali s pretočnim citometrom.

2.8. Merjenje RT-qPCR relativne ekspresije mRNA GRP78, CHOP, JNK in kaspaze-12.

Celotno celično RNA smo ekstrahirali z reagentom TRIzol. Dva mikrolitra celotne RNA smo ločili z gelsko elektroforezo, da bi ocenili celovitost ekstrakcije. Za merjenje in izračun vrednosti OD (260)/OD (280) smo uporabili spektrofotometer. Celotno RNA smo reverzno prepisali, da smo proizvedli cDNA v skladu z navodili za komplet TOYOBO ReverTra Ace qPCR RT. Tabela 1 prikazuje seznam primerjev. V skladu z navodili za glavno mešanico Roche FastStart Universal SYBR Green (Rox) so bili reakcijski pogoji naslednji: začetna denaturacija pri 95 stopinjah 10 minut, 95 stopinjah 10 s, 58 stopinjah 30 sekund in 72 stopinjah 30 sekund. s za skupno 45 ciklov.

2.9.Western blot analiza izražanja beljakovin GRP78, CHOP, JNK, p-JNK in kaspaze-12.

Proteinski lizat (50 ug) smo ločili z elektroforezo na 10-odstotnem ločevalnem gelu, čemur je sledil prenos na PVDF membrano. Membrana PVDF je bila blokirana v TBS-Resolution, ki je vsebovala 5 odstotkov posnetega mleka, pri sobni temperaturi 90 minut. Blokirano PVDF membrano smo čez noč inkubirali s protitelesi 1, 2, 3 in 4 pri 4 stopinjah in nato 90 minut s kozjim anti-kunčjim IgG (1: 1000) pri sobni temperaturi. Končno je bila membrana razvita z dvobarvnim infrardečim laserskim slikovnim sistemom.

2.10. Statistične in analitične metode.

Podatki v tej študiji so bili obdelani s programsko opremo SPSS 24.0, rezultati pa so predstavljeni kot povprečje ± SD. Podatke iz več skupin smo primerjali z ANOVA, podatke iz dveh skupin pa s t-testi. Šteje se, da je vrednost P < 0.05="" statistično="" pomembna.="" programska="" oprema="" imagej="" je="" bila="" uporabljena="" za="" kvantitativno="" analizo="" sivinskih="" vrednosti="" beljakovinskih="">

FeniletanoidGlikozidivcistanche

3. Rezultati

3.1. Vpliv PhG-RE na viabilnost celic.

Kot je prikazano na sliki 1, se v primerjavi s kontrolno skupino sposobnost preživetja celic H9c2 v skupini PhG-RE ni bistveno spremenila (P > 0.05), vendar se sposobnost preživetja celic celic v obeh skupinah H2O2 in TG se je občutno zmanjšalo. V primerjavi s skupino H2O2 se je sposobnost preživetja celic v obeh skupinah (PhG-RE)-H2O2 in (4-PBA)-H2O2 znatno povečala. V primerjavi s skupino TG se je viabilnost celic v skupini (PhG-RE)-TG znatno povečala. Vsi rezultati so bili statistično značilni (P <>

3.2. Vpliv PhG-RE na poškodbo celic.

Kot je prikazano na sliki 2, čeprav so bile celice v skupini PhG-RE poškodovane v primerjavi s celicami v kontrolni skupini, ta poškodba ni dosegla statistične pomembnosti (P ​​> 0.05). Poškodba celic v skupinah H2O2 in TG se je znatno povečala. V primerjavi s skupino H2O2 se je poškodba celic v skupinah (PhG-RE)-H2O2 in (4-PBA)-H2O2 občutno zmanjšala (P < 0,01).="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" tg="" se="" je="" celična="" poškodba="" v="" skupini="" (phg-re)-tg="" znatno="" zmanjšala="" (p=""><>

3.3. Vpliv PhG-RE na celično apoptozo.

Kot je prikazano na sliki 3, se apoptoza celic v skupini s PhG-RE v primerjavi s kontrolno skupino ni bistveno spremenila (P > 0.05), medtem ko se tista v skupini s H2O2 in TG skupinah se je pomembno povečalo (P <0,01). v="" primerjavi="" s="" skupino="" h2o2="" je="" apoptoza="" celic="" v="" (phg-re)-h2o2="" in="">

skupinah se je znatno zmanjšalo (P < {{0}}.01).="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" tg="" se="" je="" apoptoza="" celic="" v="" skupini="" (phg-re)-tg="" pomembno="" zmanjšala="" (p=""><>

3.4. Vpliv PhG-RE na izražanje mRNA GRP78, CHOP, JNK in kaspaze-12.

Relativno izražanje mRNA v vsaki poskusni skupini smo kvantitativno izmerili z RT-qPCR. Kot je prikazano na sliki 4, se je v primerjavi s kontrolno skupino relativna ekspresija mRNA GRP78, CHOP in kaspaze-12 znatno povečala (P < 0.01)="" v="" h2o2="" in="" relativna="" ekspresija="" mrna="" jnk="" se="" je="" prav="" tako="" povečala="" (p="">< 0.05).="" v="" skupini="" tg="" se="" je="" relativna="" ekspresija="" mrna="" grp78,="" chop,="" jnk="" in="" kaspaze-12="" znatno="" povečala="" (p="">< 0.01).="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" h2o2="" se="" je="" relativna="" ekspresija="" mrna="" grp78,="" chop="" in="" kaspaze-12="" v="" skupinah="" (phg-re)-h2o2="" in="" (4-="" pba)-h2o2="" občutno="" zmanjšala="" (p="">< 0.01),="" medtem="" ko="" se="" relativna="" ekspresija="" mrna="" jnk="" ni="" bistveno="" spremenila="" (p=""> 0,05). V primerjavi s skupino TG se je relativna ekspresija mRNA GRP78, JNK in kaspaze-12 v skupini (PhG-RE)-TG zmanjšala (P < 0,01),="" relativna="" ekspresija="" mrna="" chop="" pa="" ni="" pomembno="" spremeniti="" (p="" ​​=""> 0,05).

3.5. Vpliv PhG-RE na izražanje beljakovin GRP78, CHOP in kaspaze-12.

Slika 5 prikazuje nivoje izražanja beljakovin GRP78, CHOP in kaspaze-12. V primerjavi s kontrolno skupino se je izražanje teh treh proteinov v skupinah H2O2 in TG po obdelavi celic znatno povečalo (P < 0.01).="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" h2o2="" se="" je="" izražanje="" grp78,="" chop="" in="" kaspaze-12="" znatno="" zmanjšalo="" v="" skupinah="" (phg-re)-h2o2="" in="" (4-pba)-h2o2="" (p="">< 0,01)="" .="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" tg="" se="" je="" izražanje="" grp78,="" chop="" in="" kaspaze-12="" v="" skupini="" (phg-re)-tg="" znatno="">

3.6. Vpliv PhG-RE na JNK in p-JNK.

Kot je prikazano na sliki 6, se je izražanje p-JNK v skupinah H2O2 in TG v primerjavi s tistim v kontrolni skupini znatno povečalo (P < 0.01).="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" h2o2="" se="" je="" izražanje="" p-jnk="" v="" skupinah="" (phg-re)-h2o2="" in="" (4-="" pba)-h2o2="" znatno="" zmanjšalo="" (p="">< 0.{{24}="" }1).="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" tg="" se="" je="" izražanje="" p-jnk="" v="" skupini="" (phg-re)-tg="" pomembno="" zmanjšalo="" (p="">< 0,01).="" kar="" zadeva="" izražanje="" jnk,="" ni="" bilo="" bistvenih="" sprememb="" v="" nobeni="" od="" poskusnih="" skupin="" (p=""> 0,05).

Cistanchelahko preprečicelicaapoptoza