Preparativna izolacija in čiščenje štirih spojin iz Cistanches Deserticola YC Ma s hitro protitočno kromatografijo

1. Uvod

Cistanches deserticolaYC Ma, vrstaCistančiki pripadaOrobanchaceaedružine, je dobro znana tradicionalna kitajska medicina za zdravljenje odpovedi ledvic, ženske neplodnosti, morbidne levkoreje, nevrapraksije in senilnega zaprtja [1]. Je parazitska rastlina, ki je zelo razširjena na severozahodu Kitajske. Doslej je bilo več spojin, vključno zfeniletanoidni glikozidi (PhG), iridoidi in lignani so bili izolirani iz te vrste [2]. Poročali so, da imajo nekateri PhG antioksidativne, hepatoprotektivne in nevroprotektivne aktivnosti [3–6]. Vendar je postopek izolacije in čiščenja PhG težak in dolgotrajen. Poleg tega klasične večkratne kromatografske metode ne uporabljajo le velike količine organskih topil, ampak dajejo tudi nižji izkoristek vzorca. Protitočna kromatografija visoke hitrosti (HSCCC), tehnika porazdelitve tekočina-tekočina brez nosilca, nudi odlično pridobitev vzorcev v primerjavi z nekaterimi običajnimi metodami in se pogosto uporablja za ločevanje in čiščenje različnih naravnih produktov [7–9]. . Čeprav je bilo več PhG očiščenih izCistančirodu in drugih po HSCCC [10–14], noben dokument ni poročal o čiščenju akteozida, izoakteozida, siringalida A 3'- -L-ramnopiranozid in 2'-acetilakteozid v enem dvofaznem sistemu.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

V tem članku poročamo o preprosti metodi za ločevanje in čiščenje štirih PhG iz C. deserticola. Končno smo v enostopenjski ločitvi dobili 30,9 mg akteozida, 13,0 mg izoakteozida, 12,5 mg siringalida A 3'- -L-ramnopiranozida in 7,2 mg 2'-acetilakteozida. iz 297 mg frakcije s čistostjo 99 %, 95 %, 99 % oziroma 98 %. Njihove strukture so bile karakterizirane na podlagi 1H- in 13C-NMR spektralnih podatkov in HR-MS spektrov. Strukture štirih PhG, identificiranih v tej preiskavi, so prikazane na sliki 1.

2. Rezultati in razprava

2.1. HPLC analiza surovega ekstrakta

Sestavno obogateno frakcijo ekstrakta n-butanola iz C. deserticola smo analizirali s HPLC-UV. Uporabljena kolona je bila Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, id 5 μm) (Thermo-Fisher Scientific Instruments, mesto, državna okrajšava, ZDA), mobilna faza je bila metanol-voda (30:70, v/v). Hitrost pretoka je bila 1 ml/min. Valovna dolžina detektorja je bila nastavljena na 254 nm. Kromatogram HPLC je prikazan na sliki 2. Vrhovi od 1 do 4 ustrezajo akteozidu (1), izoakteozidu (2), siringalidu A 3'- -L-ramnopiranozidu (3) oziroma 2'-acetilakteozidu (4). .

2.2. Izbira dvofaznega sistema topil

Uspešno ločevanje s HSCCC je v veliki meri odvisno od izbire primernega dvofaznega sistema topil, dvofazni sistem topil je bil izbran glede na vrednosti porazdelitvenega koeficienta (K) vsake ciljne komponente, optimalno območje K pa mora biti od {{ 2}}.5 proti 2.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE IMUNNOSTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

V poskusu so vrednosti K za ciljne komponente več dvofaznih sistemov topil prikazane v tabeli 1 (čeprav malo višje za vrh 4, so se rezultati izkazali za sprejemljive). Med njimi je etil acetat–n-butanol–etanol-voda (40:6:6:50, v/v/v/v) dal ustrezne porazdelitvene koeficiente za ciljne spojine. Sčasoma je bil sistem topil, sestavljen iz etil acetat–n-butanol–etanol-voda (40:6:6:50, v/v/v/v), uporabljen za izolacijo in čiščenje štirih spojin C. deserticola, kot je prikazano v Slika 3. Kot je prikazano na sliki 2, je analiza HPLC vsake frakcije HSCCC pokazala, da so štirje čisti PhG (akteozid, 99 %; izoakteozid, 95 %; siringalid A 3′- -L-ramnopiranozid 99 % in 2′- acetilakteozid 98%) je bilo mogoče pridobiti iz surove frakcije.

3. Eksperimentalno

3.1. Aparat HSCCC

oprema, ki je bila uporabljena v tej študiji, je bil TBE{{0}}B visokohitrostni protitočni kromatografski sistem (Shanghai Tauto Biotech Co., Šanghaj, Kitajska) s tremi preparativnimi večplastnimi kolonami za ločevanje tuljav, povezanimi zaporedno (premer epruvete=2.6 mm, skupna prostornina=300 mL) in 2{{10}} ml vzorčne zanke. Vrtilni radij ali razdalja med osjo držala in centralno osjo centrifuge (R) je bil 5 cm, vrednost pa se je spreminjala od 0,5 na notranjem terminalu do 0,8 na zunanjem terminalu (= r/R, kjer r je razdalja od tuljave do gredi držala). Za nadzor temperature v poskusu je bil uporabljen krožni instrument HX 105 s konstantno temperaturo (Beijing Changliu Lab Instrument Company, Peking, Kitajska). Sistem HSCCC je bil opremljen z modelom TBP-5002 srednjetlačne črpalke s konstantnim pretokom, modelom TBP-2000 UV detektorja, ki deluje pri 254 nm, in modelom delovne postaje V4.0 (Jinda Bio-chemistry Instrument Podjetje, Šanghaj, Kitajska).

Uporabljena oprema za tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) je bil sistem Agilent 1200, ki je sestavljen iz binarne črpalke G1312A, samodejnega vzorčevalnika G1329A, detektorja spremenljive valovne dolžine (VWD) G1314A, termostatiranega predelka za kolono G1316A, razplinjevalnika G1379B in delovne postaje Agilent LC. . Za odkrivanje čistosti je bil uporabljen alltech 3300 ELSD. Za strukturno identifikacijo spojin sta bila uporabljena 500-NMR spektrometra Agilent 6520 Q-TOF in Bruker AVANCE III. 1H in 13C-NMR spektri (pri 500 oziroma 125 MHz) so bili izmerjeni pri sobni temperaturi (22 stopinj/295,1 K).

3.2. Reagenti in materiali

Etil acetat, n-butanol in etanol so bili analitske kakovosti, metanol pa HPLC stopnje. Vsa topila so bila kupljena pri podjetju Tianjin Concord Technology Company (Tianjin, Kitajska). Voda Milli-Q (18,2 MΩ) (Millipore, Bedford, MA, ZDA) je bila uporabljena za vse raztopine in razredčitve. Korenik C. deserticola je bil zbran v provinci Notranja Mongolija, Ljudska republika Kitajska, junija 2009. Rastlino je identificiral prof. Lijuan Zhang, primerek vavčerja (št. 20091001) pa je bil deponiran v našem laboratoriju.

3.3. Priprava surovega vzorca

Uprašena na zraku posušena mesnata stebla C. deserticola (1 kg) so dvakrat refluktirala z vodnim etanolom (8 L, 60 % v/v) vsakič 2 uri. Ekstrakt smo uparili pri znižanem tlaku in pri temperaturi 60 stopinj do popolnega izhlapevanja etanola. Ostanek smo suspendirali v vodi in trikrat zaporedno ekstrahirali s kloroformom, etil acetatom in n-butanolom, kar je dalo 5,16 g n-butanolnega ekstrakta po uparjenju do suhega pod znižanim tlakom. N-butanojski ekstrakt smo nato ločili na koloni silikagela (200–300 mesh) z uporabo progresivnega gradientnega eluiranja (CHCl3–MeOH, 10:1→1:1), da smo dobili osem frakcij. Frakcijo 6 (297 mg) smo uporabili za nadaljnjo izolacijo in ločevanje HSCCC.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA TRADICIONALNA KITAJSKA ZDRAVILA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.4. Izbira dvofaznih sistemov topila

Dvofazni sistemi topil so bili izbrani glede na porazdelitveni koeficient (K) ciljnih komponent v frakciji C. deserticola. Vrednosti K so bile določene z analizo LC, kot sledi: Ustrezna količina praškastega ekstrakta (frakcija 6) je bila raztopljena v spodnji fazi sistema topil in analizirana s HPLC. Območja vrhov so bila zapisana kot A1. Nato raztopini dodamo enako količino zgornje faze in temeljito premešamo, da dosežemo porazdelitveno ravnovesje. Spodnjo fazo smo nato ponovno analizirali s HPLC. Slednje površine vrhov so bile zabeležene kot A2. K-vrednosti so bile izračunane po naslednji enačbi: K=(A1 − A2)/A2 [15,16].

3.5. Priprava dvofaznega sistema topil in raztopine vzorca

V tej študiji je bil za ločevanje HSCCC uporabljen dvofazni sistem topil, sestavljen iz etil acetat–n-butanol–etanol-voda (40:6:6:50, v/v/v/v). Vsako topilo smo dodali v lij ločnik in temeljito uravnotežili pri sobni temperaturi. Zgornjo in spodnjo fazo smo ločili in razplinili z ultrazvočno obdelavo 30 minut malo pred uporabo. Raztopino vzorca smo pripravili z raztapljanjem 297 mg frakcije 6 v 15 mL spodnje faze etil acetat–n-butanol–etanol-voda (40:6:6:50, v/v/v/v).

3.6. Postopek ločevanja HSCCC

HSCCC je bil izveden na naslednji način. Večplastno zvito kolono smo najprej napolnili z zgornjo organsko stacionarno fazo. Spodnjo vodno mobilno fazo smo nato prečrpali v glavni konec kolone s hitrostjo pretoka 1,5 ml/min in istočasno je aparat HSCCC deloval pri vrtilni hitrosti 900 rpm. Ko je bilo vzpostavljeno hidrodinamično ravnovesje, kot je prikazano z eluiranjem bistre mobilne faze na izhodu iz repa (približno dve uri kasneje), je bila skozi injekcijski ventil vbrizgana 15 ml raztopine vzorca, ki je vsebovala 297 mg surovega ekstrakta (frakcija 6). Efluent kolone smo stalno spremljali pod 254 nm. Štiri vrhove frakcij smo zbrali v skladu s kromatogramom in nato uparili pod znižanim tlakom. Temperatura v napravi je bila nastavljena na 25 stopinj.

3.7. Analiza HPLC in identifikacija frakcij vrhov HSCCC

Frakcije vrhov iz HSCCC smo analizirali s HPLC-ELSD. Uporabljena kolona je bila Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, id 5 μm), mobilna faza pa je bila metanol-voda (30:70, v/v). Hitrost pretoka je bila 1 ml/min. ELSD je deloval pri naslednjih pogojih: temperatura 45 stopinj, plin 1,6 L/min. Strukturno identifikacijo štirih frakcij vrhov HSCCC smo izvedli s HR-ESI-MS, 1H in 13C-NMR spektroskopijo.

3.8. Strukturna identifikacija

Frakcija I: HR-ESI-MS opazovano pri m/z 623,2001 (M-H)-, izračunano za C29H35O15, 623,1981. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 ramnoze), 2,79 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 glukoze), 5,18 (1H, d, J=1 Hz, H{{34 }} ramnoze), 6,27 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,1 (6H, aromatski H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4) ), 116,4 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C- ), 36,6 (C- ), 127,7 (Caf-1), 115,3 (Caf{{89) }}), 146,9 (Caf-3), 149,8 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf- ), 114,8 (Caf-), 148,1 (Caf-), 104,3 (G-1), 76,1 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,5 (Glc-4 ), 76,3 (Glc-5), 62,4 (Glc-6), 103,1 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,1 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,5 (Rha-6). V primerjavi s podatki iz literature [17] je frakcija I ustrezala akteozidu.

Frakcija II: HR-ESI-MS opazovano pri m/z 623,1987 (M-H)-, izračunano za C29H35O15, 623,1981. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,25 (3H, d, J=6.5 Hz, CH3 ramnoze), 2,78 (2H, t, J=7 Hz, Ar-CH2-), 4,33 (1H, d, J=8 Hz, H-1 glukoze), 5,17 (1H, d, J { {33}} Hz, H-1 ramnoze), 6,28 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,56 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, aromatski H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4) ), 116,5 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C- ), 36,7 (C- ), 127,8 (Caf-1), 115,2 (Caf{{89) }}), 146,8 (Caf-3), 149,7 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 169,2 (Caf- ), 115,0 (Caf-), 147,3 (Caf-), 104,5 (G-1), 75,5 (Glc-2), 84,2 (Glc-3), 70,1 (Glc-4 ), 75,7 (Glc-5), 64,7 (Glc-6), 102,8 (Rha-1), 72,4 (Rha-2), 72,4 (Rha-3 ), 74,1 (Rha-4), 70,5 (Rha-5), 17,9 (Rha-6). Spektralni podatki 1H-NMR in 13C-NMR so se ujemali s tistimi za izoakteozid, kot je navedeno v literaturi [18].

Frakcija III: HR-ESI-MS opaženo pri m/z 6{{108}}7,2032 (M−H)−, izračunano za C29H35O14, 607,2032. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 ramnoze), 2,84 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 glukoze), 5,19 (1H, d, J=1).5 Hz, H{ {35}} ramnoze), 6,27 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=16 Hz, Ar- CH=CH-), 6,6–7,1 (7H, aromatski H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 130,8 (C-1), 116,2 (C-2), 130,9 (C-3), 156,8 (C-4) ), 130,8 (C-5), 116,2 (C-6), 72,4 (C- ), 36,4 (C- ), 127,8 (Caf-1), 114,8 (Caf{{88) }}), 149,8 (Caf-3), 146,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf- ), 115,4 (Caf-), 148,0 (Caf-), 104,3 (G-1), 76,3 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,4 (Glc-4 ), 76,1 (Glc-5), 62,5 (Glc-6), 103,0 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,2 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,4 (Rha-6). Po literaturi [18] je frakcija III ustrezala siringalidu A 3'- -L-ramnopiranozidu.

Frakcija IV: HR-ESI-MS opaženo pri m/z 665,21{{20}} (M−H)−, izračunano za C31H37O16, 665,2087. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 5 ppm: 1,09 (3H, d, J=6.5 Hz, CH3 ramnoze), 2,00 (3H, s, OAc), 2,72 (2H, t, J=7.5 Hz, Ar-CH2-), 4,55 (1H, d, J=8 Hz, H-1 glukoze), 4,90 (1H, d, J=1 Hz, H-1 ramnoze), 6,29 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,62 (1H, d , J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, aromatski H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 5 ppm: 131,9 (C-1), 117,3 (C-2), 146,1 (C-3), 144,7 (C-4) ), 116,4 (C-5), 121,4 (C-6), 72,7 (C- ), 36,4 (C- ), 127,7 (Caf-1), 115,4 (Caf{{93) }}), 146,9 (Caf-3), 149,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,1 (Caf- ), 114,7 (Caf-), 148,2 (Caf-), 101,8 (G-1), 75,3 (Glc-2), 80,3 (Glc-3), 70,8 (Glc-4 ), 76,2 (Glc-5), 62,3 (Glc-6), 103,3 (Rha-1), 72,0 (Rha-2), 71,8 (Rha-3 ), 73,7 (Rha-4), 70,8 (Rha-5), 18,5 (Rha-6), 171,5 (C=O), 20,9 (OAC). Podatki 1H-NMR in 13C-NMR spektra so se ujemali s tistimi za 2'-acetilakteozid [17].

4. Sklepi

Vzpostavljena je bila metoda HSCCC za preparativno ločevanje in čiščenje akteozida, izoakteozida, siringalida A 3'- -L-ramnopiranozida in 2'-acetilakteozida iz Cistanches deserticola YC Ma. Ta študija kaže, da je HSCCC zelo močna tehnika za preparativno ločevanje in čiščenje bioaktivnih komponent iz rastlinskih materialov. Poleg tega je mogoče spojine izolirati v dovolj velikem obsegu z visoko čistostjo in jih nato uporabiti kot referenčne snovi za kromatografijo ali študije bioaktivnosti. Metoda je izvedljiva, ekonomična in učinkovita tehnika za hitro preparativno izolacijo zapletenih naravnih produktov.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%