Promitotično delovanje Oenothera Biennis na starajoče se človeške dermalne fibroblaste 1. del
Jul 04, 2023
Povzetek: Kopičenje starajočih se dermalnih fibroblastov spodbuja staranje kože. Ponovna aktivacija proliferacije je ena od strategij za modulacijo staranja celic. Pred kratkim smo poročali o natančni kemični sestavi hidrofilnega izvlečka celičnih kultur Oenothera biennis (ObHEx) in pokazali njegove lastnosti proti staranju kože. Namen tega dela je oceniti njegov biološki učinek posebej na staranje celic. Delovanje ObHEx je bilo ovrednoteno na normalnih človeških dermalnih fibroblastih, ki so bili podvrženi prezgodnjemu staranju zaradi stresa (SIPS) z ultra globoko proteomsko analizo, kar je vodilo do najbolj globalnega proteoma, povezanega s staranjem, doslej. Podatki masne spektrometrije kažejo, da zdravljenje z ObHEx ponovno vzpostavi ravni ključnih mitotičnih proteinov, ki so v starajočih se celicah močno znižani. Za potrditev naših proteomskih ugotovitev smo dokazali, da lahko ObHEx delno obnovi aktivnost 's staranjem povezane ß-galaktozidaze', ki je najpogostejši znak starajočih se celic. Poleg tega so bili izvedeni poskusi FACS, da bi ocenili, ali se uravnavanje ravni mitotičnega proteina prevede v ponovni vstop v celični cikel, ki je pokazalo majhno, a pomembno reaktivacijo proliferacije starajočih celic z ObHEx. Skratka, tukaj objavljeno globalno profiliranje proteoma, povezano z globokim staranjem, zagotavlja skupino na stotine proteinov, ki jih je SIPS dereguliral in ki jih lahko skupnost uporabi za nadaljnje razumevanje staranja in učinka novih potencialnih modulatorjev. Poleg tega je analiza proteomike pokazala na specifičen promitotični učinek ObHEx na starajoče se celice. Zato predlagamo ObHEx kot močan adjuvans proti staranju, povezanem s staranjem kože.
Glikozid cistanche lahko tudi poveča aktivnost SOD v srčnem in jetrnem tkivu ter znatno zmanjša vsebnost lipofuscina in MDA v vsakem tkivu, učinkovito lovi različne reaktivne kisikove radikale (OH-, H₂O₂ itd.) in ščiti pred povzročeno poškodbo DNK z OH-radikali. Cistanche feniletanoidni glikozidi imajo močno sposobnost lovljenja prostih radikalov, večjo redukcijsko sposobnost kot vitamin C, izboljšajo aktivnost SOD v suspenziji semenčic, zmanjšajo vsebnost MDA in imajo določen zaščitni učinek na delovanje membrane semenčic. Cistanche polisaharidi lahko povečajo aktivnost SOD in GSH-Px v eritrocitih in pljučnem tkivu eksperimentalno starajočih se miši, ki jih povzroča D-galaktoza, pa tudi zmanjšajo vsebnost MDA in kolagena v pljučih in plazmi ter povečajo vsebnost elastina. dober čistilni učinek na DPPH, podaljša čas hipoksije pri starajočih se miših, izboljša aktivnost SOD v serumu in upočasni fiziološko degeneracijo pljuč pri eksperimentalno starajočih se miših. Pri celični morfološki degeneraciji so poskusi pokazali, da ima Cistanche dobro antioksidativno sposobnost in ima potencial, da postane zdravilo za preprečevanje in zdravljenje bolezni staranja kože. Hkrati ima ehinakozid v Cistanche pomembno sposobnost čiščenja prostih radikalov DPPH in lahko lovi reaktivne kisikove vrste, preprečuje razgradnjo kolagena, ki jo povzročijo prosti radikali, in ima tudi dober učinek popravljanja poškodb anionov prostih radikalov timina.
Kliknite na dodatek Cistanche Tubulosa
【Za več informacij:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
Ključne besede: hidrofilni izvleček Oenothera biennis; staranje; fibroblasti; proteomika; masna spektrometrija; diaPASEF; mitoza; staranje kože
1. Uvod
Staranje je glavni vzrok staranja in s starostjo povezanih bolezni. Stare celice so podvržene zaustavitvi proliferacije kot odziv na fiziološko erozijo telomera (replikacijsko staranje) ali na sprožilce stresa, vključno s poškodbo DNA, oksidativnim stresom, sevom organelov in aktivacijo onkogena (prezgodnje staranje, povzročeno s stresom, SIPS) [1]. Kljub zaustavitvi rasti, ki jo povzroča odziv na poškodbe DNA (DDR), kažejo starajoče se celice visoko presnovno stanje in lizosomsko aktivnost, ki je ključnega pomena za njihovo povečano sekretorno aktivnost, znano kot sekretorni fenotip, povezan s staranjem (SASP) [2,3]. Faktorji SASP vključujejo več družin topnih (interlevkini, kemokini, rastni faktorji, izločene proteaze) in netopnih (izločene netopne beljakovine in komponente zunajceličnega matriksa) beljakovin, ki negativno vplivajo na okoliško tkivo in povzročajo kronično vnetno stanje nizke stopnje.
Kopičenje starajočih se fibroblastov v dermi poganja staranje kože, poslabša celovitost zunajceličnega matriksa (ECM) in delovanje sosednjih mikrovaskularnih endotelijskih celic, epidermalnih melanocitov in keratinocitov [4–6]. Tri glavne strategije za preprečevanje staranja vključujejo (i) odstranitev starajočih se celic z indukcijo apoptoze ali imunske aktivacije; (ii) modulacija SASP in (iii) reaktivacija celične proliferacije. Čeprav je bilo staranje prvotno opisano kot ireverzibilna zaustavitev celičnega cikla, trenutni dokazi kažejo, da je proliferacijo mogoče obnoviti [7–9].
V tem scenariju so sestavine, ki lahko preprečijo in/ali modulirajo celično staranje, zelo zanimive na kozmetičnem področju kot dragoceno orožje za preprečevanje staranja kože. Zlasti izvlečki, pridobljeni iz vrste Oenothera biennis (O. biennis, večerni jeglič), ki pripada družini Onagraceae, se tradicionalno uporabljajo za kozmetične namene zaradi njihovega protivnetnega in antioksidativnega delovanja [10]. Metanolni izvlečki, pripravljeni iz nadzemnih delov, in vodni izvlečki listov vsebujejo predvsem fenolne kisline in flavonoide, medtem ko metanolni izvlečki, pridobljeni iz korenin, vsebujejo večinoma sterole in triterpene [11]. Čeprav je biološka aktivnost alkoholnih in hidroalkoholnih izvlečkov nadzemnih delov dokazana [12–14], so najpogosteje uporabljeni izvlečki O. biennis olja, pridobljena iz semen, ki so izjemno bogata z maščobnimi kislinami. Zaradi visoke vsebnosti linolne kisline (LA) in -linolenske kisline (GLA) olja semen O. biennis izboljšujejo pravilno delovanje kože in so zlasti pokazala ugodne učinke pri bolnikih s kroničnim dermatitisom [11, 15].
Nedavno je bilo predlagano, da izvlečki, pridobljeni iz celičnih kultur O. biennis, v celoti nadomestijo izvlečke iz spontanih rastlin, saj so biološko trajnostne, brez kontaminantov in standardizirane mešanice sekundarnih metabolitov [16]. Prav kombinacija spojin z njihovim sinergističnim učinkom je odgovorna za celotno delovanje botaničnih izvlečkov [17].
Tu smo se osredotočili na hidrofilni izvleček celičnih kultur O. biennis (ObHEx), bogat z lignani in triterpeni, saj je pokazal lastnosti proti staranju kože pri testiranju na modelih in vitro in ex vivo [18]. Kemična karakterizacija tega ekstrakta na osnovi masne spektrometrije je pokazala, da vsebuje več razredov zanimivih sekundarnih metabolitov. Spadajo med lignane (salvadorazid in liriodendron) in triterpene (muriatična kislina, arjunolna kislina, asparaginska kislina in hederagenin), od katerih so nekatere predhodno povezovali s proizvodnjo pro-kolagena I v človeških fibroblastih [19,20]. Zlasti smo predhodno dokazali, da ObHEx spodbuja kontrakcijo matričnega kolagena, polimerizacijo aktina in proizvodnjo proteinov ECM, s čimer izboljša čvrstost in elastičnost kože, s povečanjem ekspresije gena za kinazo lahke verige miozina (MYLK).
Do danes še niso bili raziskani molekularni mehanizmi učinkov ObHEx na staranje kože in celično staranje. Namen tega dela je raziskati aktivnost ObHEx na starajočih se človeških dermalnih fibroblastih. Uporabili smo od podatkov neodvisen masni spektrometrični ultra-globoki proteomski pristop, da smo pridobili namige o mehanizmu delovanja in bioortogonalne metode za njegovo validacijo in raziskavo (slika 1).
2. Rezultati
S stresom povzročeno prezgodnje staranje (SIPS) smo izvedli v normalnih človeških dermalnih fibroblastih (NHDF) z obdelavo z vodikovim peroksidom (H2O2). Stare celice, ki jih povzroča oksidativni stres, so odličen in vitro model za raziskave staranja in H2O2 se pogosto uporablja za doseganje tega [21,22].
Da bi razumeli biološke poti, ki jih je spremenil ObHEx na starajočih se celicah NHDF, smo uporabili ultra globok proteomski pristop. SIPS in kontrolne celice so bile 48 ur obdelane ali ne z izvlečkom pri 0,01 odstotka (p/v), saj iz testa MTT, navedenega v [18], to povzroči najvišjo koncentracijo, ki ne povzroči kakršne koli celične toksičnosti po 48 urah inkubacije.
Celične lizate smo nato izpostavili triptični razgradnji in nano-UPLC MS/MS analizi. Da bi pridobili optimalno globino proteoma, so bili podatki masne spektrometrije pridobljeni v načinu Data Independent Acquisition (DIA), kar je omogočilo robustno kvantifikacijo 9650 proteinov (tabela S1), s popolnostjo podatkov 98 odstotkov. Naša študija poroča o najpopolnejši analizi proteoma starajočih se celic doslej.
2.1. Ocena s stresom povzročenega prezgodnjega staranja (SIPS).
Najprej smo preverili, ali je bila indukcija staranja v NHDF uspešna, z analizo globalnega proteoma NHDF, obdelanega s H2O2-, z masno spektrometrijo (MS) in preučevanjem njihove morfologije s pretočno citometrijo.
2.1.1. Vrednotenje SIPS z masno spektrometrijo (MS)
Da bi ocenili indukcijo SIPS, smo primerjali skupni proteom celic NHDF, obdelanih s H2O2-, in neobdelanih. Med 3256 proteini, ki so bili deregulirani, je bilo ugotovljeno, da je več biomarkerjev staranja znatno spremenjenih (slika 2A, B). Prvič, opazili smo regulacijo najpogosteje uporabljenega biomarkerja starajočih se celic, 's staranjem povezane ß-galaktozidaze' (SA- -gal, GLB1). Zvišane ravni lizosomskih encimov GLB1 in tkivne alfa-L-fukozidaze (FUCA1), za katere je bilo ugotovljeno, da jih MS tudi regulira navzgor, odražajo značilno povečanje vsebnosti lizosomov v starajočih se celicah [23, 24]. Dejansko lizosomi dajejo prednost katabolnim procesom, ki zagotavljajo energijo in surovine, potrebne za izločanje, povezano s staranjem [25].
Drugič, ugotovljeno je bilo, da se je povečala tudi raven beljakovin serin/treonin-protein kinaze ATR in serin-protein kinaze ATM, ki sta vključeni v signalizacijo DDR [26]. DDR se aktivira s poškodbo jedrske DNA, ki je na splošno povezana z vzpostavitvijo celičnega staranja, in konvergira v aktivacijo tumorskega supresorja p53. Poleg tega so opazili tudi povečano regulacijo histonskih 2A različic MACROH2A1 in MACRO2A2. Ti proteini sodelujejo pri od ATR odvisni tvorbi žarišč heterokromatina, povezanih s staranjem (SAHF), gostih in represivnih struktur kromatina, značilnih za starajoče se celice [1,2,27].
Nazadnje, deregulirane ravni od ciklina odvisnega zaviralca kinaze 1A ali p21 (CDK1NA) in proteina markerja proliferacije Ki-67 (MKI67) odražajo zaustavitev starajočega se celičnega cikla v fazi G2 [28,29]. Dejansko p21 zviša ravni, kar spodbuja pot p53, ki jo povzroči poškodba DNK, in zavira kompleks CDK2-ciklin E. To povzroči defosforilacijo proteina retinoblastoma (RB), ki v hipofosforiliranem stanju sekvestrira E2F, transkripcijski faktor, ki spodbuja napredovanje celičnega cikla [2].
Poleg teh že znanih označevalcev staranja širša analiza obogatitve poti najbolj reguliranih proteinov v celicah, zdravljenih s H2O2, v primerjavi s kontrolnimi celicami kaže na aktivacijo poti p53/p21, ki jo povzroči poškodba DNK (slika 2C, tabela S2). Namesto tega so proteini, povezani s proliferacijo in mitozo, znižani, kar kaže na posledično zaustavitev proliferacije (slika 2D, tabela S3).
2.1.2. Ocena SIPS s pretočno citometrijo
SIPS je bil potrjen tudi s pretočno citometrično analizo. Opazili smo povečanje citoplazemske zrnatosti celic, obdelanih s H2O2- (slika S1A, B), zaradi povečanja števila in velikosti lizosomov v starajočih se celicah. To je posledica ravnovesja med postopnim kopičenjem disfunkcionalnih lizosomov in proizvodnjo novih [25]. Poleg tega smo zaznali tudi intra-lizosomsko kopičenje agresomov lipofuscina: ta rast, povezana s povečanjem avtofluorescence v pasovnem kanalu 525/50 nm pretočnega citometra, je še en marker staranja, povezanega z lizosomsko okvaro (slika S1C, D) [30].
2.2. Delno obnovljeni mitotični proteini ObHEx znižani v starajočih celicah NHDF
Zdravljenje z ObHEx je uspelo delno obnoviti ravni 71 proteinov, dereguliranih v stanju staranja (dvosmerna ANOVA test q-vrednost < 0.05). Natančneje, ekstrakt je znižal 46 proteinov, 25 pa jih je reguliral navzgor (slika 3A, tabeli S4 in S5).
Analiza obogatitve reaktoma 46 proteinov, katerih ravni je znižal ObHEx, kaže, da lahko ekstrakt zmanjša aktivacijo poti p53 in vpliva na presnovo fosfatidilinozitola in signalizacijo Hedgehog, katerih spremembe so bile ugotovljene pri staranju [31, 32] (slika 3B, tabela S6).
Kar zadeva 25 upreguliranih proteinov, analiza obogatitve kaže na reaktivacijo poti mitotičnega celičnega cikla in zlasti na odvijanje in replikacijo DNK, kondenzacijo kromosomov in ločljivost sestrskih kromatid (slika 3C, tabela S7).
Poglobljena analiza kaže, da se 18 od 25 obnovljenih proteinov močno združuje (slika 4A). V tem grozdu je mogoče razbrati CDK1, vse podenote kompleksa kondenzina I (SMC2, SMC4, NCAPD2, NCAPH in NCAPG), tri s kinetohorom povezane beljakovine (KNTC1, NUF2 in TRIP13), vseh šest podenot kompleksa za vzdrževanje replikativnega minikromosoma (MCM) (MCM2-7) skupaj z IQGAP3, PBK in DHFR.
Sposobnost ObHEx, da delno obnovi ravni teh proteinov, je dobro prikazana v profilnih grafih na sliki 4B: nivoji izražanja proteinov so bili večinoma nespremenjeni v proliferirajočih celicah, zdravljenih z izvlečkom ali ne, padli so v starajočih se celicah in delno povečali po ObHEX zdravljenje.
2.3. Biološki testi so potrdili promitotični mehanizem delovanja ObHEx
Najpogostejši znak starajočih se celic je povečana aktivnost SA{{0}}gal, ki jo je mogoče ovrednotiti s testom obarvanja. Naši rezultati kažejo, da je zdravljenje s H2O2 povzročilo znatno povečanje števila pozitivnih celic SA- -gal (modro), s 4,7 odstotka na 22,9 odstotka (slika 5A, B). Inkubacija ObHEx je znatno zmanjšala aktivnost SA- -gal z zmanjšanjem za 38,4 odstotka (p < 0,01).
Poleg tega, da bi ocenili, ali obnovitev ekspresije mitotičnega proteina z ObHEx pomeni ponovno aktivacijo celičnega cikla, so bile kontrolne in senescentne celice 72 ur obdelane ali ne z ekstraktom in izvedeni so bili poskusi fluorescenčno aktiviranega razvrščanja celic (FACS). Rezultati starajočih se celic so pokazali blokado v fazah G2/M celičnega cikla (36,8 odstotka), medtem ko je bil le precej nižji delež kontrolnih celic (7,2 odstotka) v teh fazah, odkar so dosegle konfluenco, glede na literaturo [ 33] (Slika 5C, D). Zdravljenje starajočih se celic z ObHEx je zmanjšalo populacijo G2/M za 4,3 odstotka (p < 0.05). Opomba: v povezavi z delom starajoče se celice po SIPS (22,9 odstotka) bi lahko pobeg G2/M ocenili na 18,9 odstotka. Izvedeno je bilo isto zdravljenje z ObHEx 48 ur, vendar rezultati niso bili statistično značilni.
【Za več informacij:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
