Receptor 1, aktiviran s proteazo, prispeva k okvari mikrocirkulacije in tubularni poškodbi pri ledvični ishemiji-reperfuzijski poškodbi pri miših

Yu Guan,¹Daisuke Nakano,²Lei Li,³Haofeng Zheng,³Akira Nishiyama,²Ye Tian,¹in Lei Zhang¹

za lajšanje dejanskega neuspeha zzelišče cistanche

1. Uvod

Theledvicase ne more izogniti ishemično-reperfuzijski (IR) poškodbi med delno nefrektomijo inledvicapresaditev [1], za katero je znano, da povzroči zadrževanje odpadnih produktov presnove in povzroči akutnoledvicapoškodba (AKI) inAKI-kroničnaledvicabolezen (AKI-CKD) [2]. Do danes ni klinično na voljo nobene posebne terapije z zdravili za AKI in AKI-CKD [3]. Pri AKI se pojavi več pogostih patoloških sprememb, kot je okvara mikrocirkulacije [4], vključno s kongestijo in krvavitvijo, ter akutna tubularna nekroza [5]. Zato so se študije osredotočile na te patološke spremembe kot potencialne terapevtske kandidate. Prej smo dokazali, da vzdrževanje peritubularnih kapilar poledvičnaPoškodba IR je zmanjšala kapilarno kongestijo in izboljšala prehod AKI v KLB [6]. Akutno tubularno nekrozo je lahko težko zdraviti; tako je lahko regeneracija tubulov s proliferacijo tubulnih celic pomemben pristop za preprečevanje nadaljnje izgube ledvične funkcije [7].

S proteazo aktivirani receptor-1 (PAR-1) spada v družino s proteazo aktiviranih receptorjev (PAR) in je znano, da ga stimulira trombin, da inducira koagulacijo trombocitov. Nedavno smo pokazali, da je PAR-1 prispeval k razvoju akutno povzročene glomerulne poškodbe [8]. Poleg tega so poročali, da ima trombin/PAR-1 vlogo pri proliferaciji in apoptozi epitelijskih celic. Na podlagi teh značilnosti smo domnevali, da je PAR-1 pospešil resnost AKI z uravnavanjem peritubularne kapilarne koagulacije krvi ali tubularne regeneracije. V tej študiji smo preučili vlogo PAR-1 z uporabo Q-94, selektivnega negativnega alosteričnega modulatorja PAR-1-, pri mišihledvičnaModel IR poškodbe in s trombinom stimulirane gojene človeške tubularne celice.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

2. Materiali in metode

2.1. Akutni IR mišji model ledvic.

Vsi poskusi na živalih so bili izvedeni v skladu z eksperimentalnimi smernicami Institucionalnega odbora za oskrbo in uporabo živali Medicinske univerze v prestolnici. TheledvicaIR model miške je bil vzpostavljen, kot je opisano prej [8]. Na kratko, 8-teden stare mišje samce C57/BL6 smo anestezirali z injekcijo natrijevega pentobarbitala (50 mg/kg; i.p.) in jih naključno razdelili v naslednje skupine: lažno, I/R plus nosilec in I/R (nosilec: fiziološka raztopina 10 mg/kg iv) plus skupine Q94 (antagonist PAR-1 pri 10 mg/kg iv) (n=7–8 v vsaki skupini). Za protokol ledvične poškodbe s toplim IR so miši opravili uninefrektomijo, da bi ocenili poškodbo ledvične funkcije; po enem tednu je bil ledvični pedikel za 30 minut pritrjen z žilnimi sponkami brez poškodb. Po reperfuziji 48 ur smo miši žrtvovali; njihovi vzorci ledvičnega tkiva so bili zbrani in fiksirani v 4-odstotni raztopini paraformaldehida za pripravo parafinskih blokov. Dobili smo plazmo za merjenje dušika sečnine v krvi (BUN) in kreatinina.

2.2. Materiali.

Q94 je bil kupljen pri Tocris Bioscience (Bristol, Združeno kraljestvo). Druge kemikalije so bile pridobljene pri Sigma Aldrich (St. Louis, MO, ZDA), razen če je navedeno drugače.

2.3. Test za kreatinin in BUN.

Za merjenje kreatinina so bili uporabljeni komercialni testni kompleti (Creatinine Assay Kit ab65340; Abcam, Cambridge, UK). Kompleti za analizo BUN so bili kupljeni pri ABSBio™ (Komplet DUŠIK SEČNINE, CNHAO BIO, Peking, Kitajska).

2.4. Histologija.

Pred vdelavo v parafin je bilo ledvično tkivo fiksirano s 4 odstotki paraformaldehida. Parafinske bloke ledvic smo razrezali na odseke velikosti 2 μm in čez noč namestili na stekelca pri 25 stopinjah C. Po deparafinizaciji smo odseke obarvali s hematoksilinom in eozinom (H&E). Slike so bile pridobljene z uporabo mikroskopa (BX-51/DP-72; Olympus, Tokio, Japonska). Kot je bilo že opisano [9], je bila poškodba ledvičnih tubulov diagnosticirana na podlagi več histopatoloških sprememb, kot so tubularna dilatacija, kongestija/krvavitev, izguba krtačnega roba, tvorba tubulnega odlitka in celična liza z oluščenimi ostanki v tubularnem lumnu. Tubularna poškodba je bila ocenjena glede na odstotek poškodovanih tubulov: 0, brez poškodb; 1,<25%; 2,="" 25–50%;="" 3,="" 51–75%;="" and="" 4,="">75 odstotkov. Točkovanje je potekalo na slepo.

2.5. Imunofluorescenca in imunohistokemija.

Odrezke smo pripravili, kot je opisano za histološki (H&E) test, in jih nato 30 minut inkubirali s 0,3-odstotnim vodikovim peroksidom, da blokiramo endogene peroksidaze po deparafinizaciji s ksilenom. Za pridobivanje antigena smo odseke inkubirali s proteinazo K (DAKO Cytomation, Glostrup, Danska) 10 minut. Po blokiranju z 10-odstotnim kozjim serumom smo odseke inkubirali s primarnimi protitelesi čez noč pri 4 stopinjah C (protitelo proti Kim 1, ab47635, Abcam; protitelo proti Ki67, ab15580, Abcam; protitelo proti PAR-1, ab32611 , Abcam). Po inkubaciji s primarnim protitelesom smo odseke 1 uro inkubirali s sekundarnim protitelesom pri 25 stopinjah C. Substrat DAB (DAKO) je bil uporabljen za vizualizacijo rezultatov imunohistokemije (IHC) barvanja. Fluorescenčne signale smo zaznali z uporabo sekundarnega protitelesa, označenega z Alexa Fluor 594-. Slike so bile zajete s FL fluorescenčnim mikroskopom (BX51; Olympus) z ustreznim filtrom. Za analizo pozitivnih področij je bila uporabljena programska oprema ImageJ (NIH, Bethesda, MD, ZDA).

2.6. PCR v realnem času.

Za ovrednotenje regulacije ekspresije mRNA pod temi pogoji smo mRNA izolirali iz ledvičnega tkiva. Sistem PCR (7300 Fast Real-Time; Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA) in komplet Light Cycler Fast Start DNA Master SYBR Green I (Applied Biosystems) sta bila uporabljena za odkrivanje ravni 18S in PAR-1 mRNA. Zaporedja primerjev so bila naslednja: 18S —5' -GTAACCCGTTGAACCCCATT-3', 5'-CCATCCAATCG GTAGTAGCG-3'; PAR-1—5′-GTTGATCGTTTCCACG GTCT-3′, 5′-GCTGCCTCTGTACCAGGACT-3′. Relativne ravni mRNA so bile določene z metodo 2−ΔΔCq. Vrednost ΔΔCq je bila izračunana z uporabo podatkov iz kontrolne skupine.

2.7. Kirurški postopek in nastavitve večfotonskega slikanja In Vivo.

Miši so bile anestezirane z 2-odstotnim izofluranom (Mylan, Osaka, Japonska). Po traheotomiji je bila vratna vena kanilirana za injiciranje fluorescentnega barvila in infuzijo vzdrževalne tekočine, ki je vsebovala 1.0μL/min 2-odstotnega albumina v fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom. Leva ledvica vsake miši je bila eksteriorizirana skozi majhen zarez na boku in pritrjena na pokrovček. Mikroskopsko mizo in živali so med vsemi eksperimentalnimi postopki ogrevali z grelno blazino. Intravitalno večfotonsko mikroskopijo smo izvedli z uporabo večfotonskega konfokalnega fluorescenčnega slikovnega sistema Olympus FV1000MPE, ki ga poganja laser Chameleon Ultra-II MP pri 860nm (Coherent, Inc., Santa Clara, CA, ZDA). Objektiv mikroskopa je bila 25-kratna vodna imerzijska leča z numerično odprtino 1,05. Nastavitve slikanja za mikroskop (ojačanje in zamik za vse tri kanale; modra, zelena in rdeča) so bile med poskusom nespremenljive. Po 30-minutnem obdobju okrevanja je bil intravensko injiciran rodamin B- 70kD dekstran in posnete so bile 3-D z-skladne slike na globini 5–50 μm (2 μm narazen) od površine ledvic.

2.8. Celična kultura.

Celice človeške ledvice 2 (HK2) so bile pridobljene iz Cell Bank of Academy Sciences (Šanghaj, Kitajska) in kultivirane, kot je opisano prej [10]. Celice so gojili v Dulbeccovem modificiranem Eagleovem mediju, dopolnjenem z 10 odstotki fetalnega govejega seruma in 1 odstotkom penicilin-streptomicina v vlažnem ozračju s 95 odstotki zraka in 5 odstotki CO2 pri 37 stopinjah.

2.9. WST-1 testi za oceno celične proliferacije.

Celice HK2 so bile posejane v 6-plošče z vdolbinicami z gostoto 1 × 104 celic/vdolbinico. Po stimulaciji celic HK2 s trombinom so bili izvedeni testi WST- 1 v skladu s protokolom proizvajalca (kataloška št. C0035; Beyotime, Šanghaj, Kitajska), da se določi proliferativna sposobnost celic. Po 2 urah inkubacije s 100 μL reagenta WST-1 v vsaki vdolbinici smo izmerili absorbanco vzorcev z uporabo bralnika mikroplošč pri valovni dolžini 450 nm.

2.10. Test kaspaze-3.

Aktivnost kaspaze-3 je bila izmerjena s komercialno dostopnim kompletom aktivnosti kaspaze-3 (kataloška št. C1116; Beyotime, Šanghaj, Kitajska) [11]. Po inkubaciji z reagentom za aktivnost kaspaze-3 je bila absorbanca vzorcev odkrita z bralnikom mikroplošč (Spectra-Max M2, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ZDA) pri 405 nm v skladu z navodili proizvajalca.

2.11. Podatkovna in statistična analiza.

Za primerjavo več skupin je bila uporabljena enosmerna analiza variance, ki ji je sledil Tukeyjev test večkratne primerjave. Za primerjavo dveh posameznih skupin smo uporabili Studentov t-test. Šteje se, da p < 0:05="" označuje="" statistično="" pomembne="">

Cistanche tubulosapreprečuje bolezni ledvic

3. Rezultati

3.1. Izražanje PAR-1 v IR ledvicah.

Najprej smo potrdili izražanje PAR-1 in učinke IR na njegovo raven izražanja vledvica. Opazili smo skoraj 2-kratno povečanje stopnje izražanja mRNA PAR-1 v primerjavi s tistim pri lažno kirurških miših po 48 urah (slika 1(a)). Izmerili smo tudi izražanje PAR-1 z imunofluorescenco 48 ur po IR. PAR-1 je bil izražen v membrani cevaste celične ščetke. Raven fluorescence PAR-1 FL je bila povečana v primerjavi z mišmi iz lažne skupine (sliki 1(b) in 1(c)). Ti podatki kažejo, da sta se lokalizacija PAR-1 v tubularnih celicah in raven njegove ekspresije povečali po IR v ledvicah.

3.2. Ledvična funkcija in histopatološke spremembe. Ocenili smoledvicadelovanje z zaznavanjem ravni BUN in kreatinina v plazmi. I/R je povzročil zvišanje ravni BUN in kreatinina v primerjavi z mišmi, ki so bile podvržene lažni operaciji. Poleg tega se je z IR povzročeno povečanje ravni BUN znatno zmanjšalo pri miših, zdravljenih z Q94- (slika 2(a)). Raven kreatinina v serumu je bila zavirana pri miših, zdravljenih z Q94-, v primerjavi z mišmi, ki so bile podvržene le operaciji IR (slika 2(b)). Ti podatki kažejo, da lahko uporaba Q94 zaščitiledvicadelovanje po poškodbi IR.

Ocenili smo tudi histopatološke spremembe ledvic z barvanjem s H&E. Ledvična IR je znatno povečala tvorbo odlitka, tubularno dilatacijo in izgubo čopiča ter zastoje/krvavitev pri miših, zdravljenih z vehiklom, v primerjavi z lažnimi mišmi. Zdravljenje s Q94 je izrazito zatrlo te spremembe, ki jih povzroča IR (sliki 2(c) in 3(a)). Analiza rezultatov obarvanja H&E med skupinami je razkrila rezultat kongestije/krvavitve in rezultat tubularne poškodbe za vsako skupino. Miši skupine Q94 so pokazale precej nižji rezultat (sliki 2(e) in 3(c)). Kim-1 smo tudi obarvali kotledvicamarker poškodb ledvičnih tubularnih celic z IHC [12]. Kim-1-pozitivna območja so bila povečana v predelu ledvičnih tubulov pri miših z IR insultom, ki jih je znatno zavrl Q94 (sliki 2(d) in 2(f)). Ti podatki kažejo, da lahko Q94 zaviraledvicatubularna poškodba, ki jo povzroči poškodba IR.

3.3. Nenormalen pretok krvnih celic pri slikanju in vivo.

PAR-1 in njegov ligand trombin igrata pomembno vlogo pri kongestiji; Q94 je znatno izboljšal zastoje. Zato smo izvedli intravitalno slikanje z večfotonsko mikroskopijo. To omogoča opazovanje krvnih celic v peritubularni kapilari v realnem času pri živih miših (slika 3(c)). Plazmo smo vizualizirali s 70 kDa dekstranom, konjugiranim z rodaminom B (slika 3(d)). Krvne celice, ki ne ustvarjajo FL fluorescence kot odziv na laser, so bile uporabljene za vzbujanje rodamina B in upodobljene kot sence. Kot je prikazano na sliki 3(e), je IR ledvic motil redno sledenje krvnih celic in povzročil odpoved mikrocirkulacije. Q94 izboljša peritubularne kapilarne krvne celice.

3.4. Proliferacija tubularnih celic po poškodbi IR.

Poročali so, da ima proliferativna regeneracija tubularnih celic pomembno vlogo pri obnovi tubularne strukture in delovanja ledvic po poškodbi IR. Znano je, da PAR-1 spremeni proliferacijo epitelijskih celic, ko ga aktivira trombin. Tako smo odkrili proliferacijo ledvičnih tubularnih celic v testu Ki-67 IHC. 48 ur po IR se je povečalo število proliferirajočih Ki-67-pozitivnih tubularnih celic. Q94 je dodatno povečal povečano število Ki-67-pozitivnih tubularnih celic po IR v primerjavi s tistim pri miših, zdravljenih samo z IR (sliki 4(a) in 4(b)). Poleg tega smo preverili, ali je na sposobnost celične proliferacije vplivalo zaviranje PAR-1 in vitro poskusov z uporabo celic HK2, inkubiranih s trombinom, agonistom PAR-1. Proliferativno aktivnost celic HK2 smo merili s testom WST-1. Kot je prikazano na sliki 4(c), je bila proliferacija celic HK2 dramatično zatrta po zdravljenju s trombinom. Vendar je bilo to zaviranje, ki ga povzroča trombin, Q94 skoraj odpravilo. Ti podatki kažejo, da je PAR-1 negativno reguliral proliferacijo ledvičnih tubularnih celic, ki jo je antagonist Q94 PAR-1 skoraj odpravil.

za lajšanje kronične ledvične bolezni zcistanche

3.5. Apoptoza ledvičnih tubularnih celic.

Nadalje smo preučili apoptozo ledvičnih celic z uporabo kaspaze -3, ki je najpomembnejša izvršilna kaspaza in se med apoptozo aktivira tako po intrinzični kot po zunanji poti [13]. Z uporabo kultiviranih celic HK2, inkubiranih s trombinom, smo ugotovili, da je trombin povečal aktivnost kaspaze-3. Poleg tega je dajanje Q94 zatrlo aktivnost kaspaze-3 (slika 4(d)). Ti podatki kažejo, da je s trombinom inducirano apoptozo celic HK2 zaviral antagonist Q94 PAR-1.

4. Razprava

LedvicaZa poškodbo IR je značilna kongestija/krvavitev, akutna tubularna nekroza, vnetje in odlaganje odlitka [5]. Tukaj smo pokazali, da je inhibicija PAR-1 izboljšala spremembe, povezane s krvjo, in tubulointersticijske spremembe. Dobro je znano, da imata PAR-1 in njegov ligand, trombin, pomembno vlogo pri koagulaciji trombocitov in motnje tega sistema, na primer s trombomodulinom [14, 15], lahko preprečijo AKI. Pokazali smo, da je inhibicija PAR- 1 zavrla kongestijo in izboljšala pretok krvi v peritubularnih kapilarah pri miših z ledvično poškodbo IR, kar kaže, da je sistem PAR-1 poslabšal mikrocirkulacijo. Poleg tega je bila raven izražanja PAR-1 v tubulih po poškodbi IR ledvic povečana, kar kaže, da sistem, odvisen od PAR-1- v tubulih, prav tako poveča poškodbo IR ledvic. Ugotovljeno je, da je regeneracija tubularnih celic pomemben proces pri obnovi tubularne strukture in pri okrevanju delovanja ledvic po poškodbi IR [16, 17]. Odvisno od stopnje poškodbe ta zmogljivost popravila ni neomejena [18]. Zato so nujno potrebne možnosti zdravljenja za zmanjšanje poškodb v tubularnih celicah ali pospešitev njihove proliferacije. Naša študija in vitro je pokazala, da je PAR- 1/trombin negativno uravnaval proliferacijo tubularnih celic, ki je bila nato pospešena po inhibiciji PAR-1. Poleg tega se je pokazalo, da poškodba IR pri miših poveča tubularno proliferacijo po 48 urah, z nadaljnjim povečanjem po inhibiciji PAR-1. Ugotovili smo, da je bil PAR-1 povečan v membrani krtačastega roba proksimalnih tubulov. Ker so poročali, da je delovanje pregrade za glomerulno filtracijo zmanjšano med poškodbo IR ledvic [19], lahko filtrirani trombin iz glomerulov aktivira povečan PAR- 1 in s tem moti tubularno regeneracijo.

Naši rezultati kažejo, da je sistem PAR-1/trombin zavrl proliferacijo tubularnih celic in povečal apoptozo. Vendar pa je druga študija pokazala nasprotne učinke PAR-1, ko ga aktivira protein C [20, 21]. Ta navidezna nasprotujoča si vloga PAR-1 je lahko odvisna od metode njegove aktivacije. V naši študiji je bila možna razlaga njegove pripisane vloge ta, da je bil PAR-1 aktiviran s filtriranim trombinom. Velikost proteina C je nad 60 kDa, kar je podobno velikosti albumina [22, 23] in veliko večje od trombina (36 kDa). Poleg tega je njegova koncentracija v plazmi (<100 nm)="" is="" less="" than="" 10%="" of="" thrombin="" (="">1 μM), kar kaže, da je protein C manj filtriran in je proizvedel šibkejši signal v primerjavi s trombinom.

Trombotične epizode so dejavnik tveganja za bolnike s končno odpovedjo ledvic [24]. Študija je pokazala, da pomanjkanje PAR-1 ščiti pred diabetično CKD [25]. V naši študiji smo opazovali učinek inhibicije PAR-1 na delovanje ledvic v zgodnji fazi po IR. V nadaljnjih študijah nameravamo razviti kroničnoledvicaModel bolezni, povzročene z IR [2] za oceno možne povezave med PAR-1 in kronično ledvično boleznijo.

Za zaključek smo dokazali, da je PAR-1 poslabšal odpoved mikrocirkulacije in negativno reguliral proliferacijo tubularnih celic. Nasprotno pa je inhibicija PAR-1 prispevala k izboljšanju mikrocirkulacije in proliferacije tubularnih celic ter po IR, kar je služilo kot pomemben mehanizem okrevanja ledvic in bi ga bilo treba obravnavati kot novo strategijo pri zdravljenju AKI.

Cistanche tubulosa preprečuje bolezni ledvic, kliknite tukaj za vzorec

1 Oddelek za urologijo, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Peking, Kitajska

2Oddelek za farmakologijo, Univerza Kagawa, Kagawa, Japonska

3. Oddelek za presaditev ledvic, Oddelek za kirurgijo, Tretja pridružena bolnišnica Univerze Sun Yat-sen,

Guangzhou, Kitajska

Korespondenca mora biti naslovljena na Ye Tian; kidney@ccmu.edu.cn in Lei Zhang; leizhangkidney@gmail.com Prejeto 1. januarja 2021; Spremenjeno 25. januarja 2021; Sprejeto 8. februarja 2021; Objavljeno 23. februarja 2021

Akademski urednik: Junyan Liu

Avtorske pravice © 2021 Yu Guan et al. To je članek z odprtim dostopom, ki se distribuira podLicenca Creative Commons Attribution, ki dovoljuje neomejeno uporabo, distribucijo in reprodukcijo v kateremkoli mediju, pod pogojem, da je izvirno delo pravilno citirano.

Poškodbi ledvic, povzročeni z ishemijo in reperfuzijo (IR-), se je težko izogniti med presaditvijo ledvic in robotsko asistirano delno nefrektomijo. Za poškodbo IR ledvic so značilne tubularne poškodbe, odpoved mikrocirkulacije in vnetje, ki koordinirano povečuje ledvično poškodbo; vendar za ta stanja ni na voljo posebnega zdravljenja. S proteazo aktivirani receptor-1 (PAR-1) in njegov ligand, trombin, sodelujeta pri koagulaciji in dokazano je, da sta povezana s poškodbo epitelijskih celic. Tukaj smo domnevali, da je PAR-1 pretirano z ledvičnim IR-inducirano poškodbo tubularnih celic in odpovedjo mikrocirkulacije ter da bi lahko farmakološka inhibicija PAR-1 s Q94 preprečila te poškodbe. Ledvična topla IR je povečala izražanje PAR-1 v ledvičnih tubulih. Q94 oslabi ledvične spremembe, ki jih povzroči IR, in histopatološke poškodbe. Odpoved mikrocirkulacije je bila analizirana s kongestijo v histopatologiji in pretok krvnih celic, pregledan z intravitalno večfotonsko mikroskopijo, je bil zavrt z zdravljenjem s Q94. Q94 je tudi dramatično povečal proliferacijo tubularnih celic kljub manjši poškodbi ledvic. Trombin je zaviral celično proliferacijo in induciral apoptozo v tubulih; te učinke je preprečilo zdravljenje s Q94. Skupaj je bil PAR-1 povezan s poškodbo IR ledvic. Inhibicija PAR-1 je ublažila poškodbo, verjetno z izboljšanjem ledvične mikrocirkulacije in preživetja/proliferacije tubularnih celic.

Data Availabality

Avtorji potrjujejo, da so podatki, ki podpirajo ugotovitve te študije, na voljo v članku.

Cnaflicts of Interest

Vsi avtorji so izjavili, da nimajo konkurenčnih interesov.

Authors' Cnatributinas

Yu Guan in Daisuke Nakano sta napisala rokopis in izvajala poskuse na živalih. Lei Li je izvajal poskuse in vitro. Haofeng Zheng je opravil statistično analizo. Akira Nishiyama je popravil rokopis. Lei Zhang in Ye Tian sta oblikovala to študijo.

Acknjowledgments

To študijo sta podprli Nacionalna naravoslovna fundacija Kitajske (št. 82000712) in Kitajska podoktorska znanstvena fundacija (št. 2020M670385).

Reference

[1] MN Simmons, MJ Schreiber in IS Gill, "Kirurška ledvična ishemija: sodoben pregled," The Journal of Urology., vol. 180, št. 1, str. 19–30, 2008.

[2] Y. Guan, D. Nakano, Y. Zhang, L. Li, Y. Tian in A. Nishiyama, "Mišji model ledvične fibroze za premagovanje tehnične variabilnosti pri ishemiji/reperfuzijski poškodbi med operaterji," Scientific Poročila, let. 9, št. 1, str. 10435, 2019. 7 BioMed Research International

[3] M. Joannidis in PGH Metnitz, "Epidemiologija in naravna zgodovina akutne ledvične odpovedi na intenzivni negi," Critical Care Clinics, vol. 21, št. 2, str. 239–249, 2005.

[4] D. Nakano, K. Doi, H. Kitamura, et al., "Zmanjšanje hitrosti tubularnega pretoka kot mehanizem oligurije v zgodnji fazi endotoksemije, razkrite z intravitalnim slikanjem," Journal of the Ameri can Society of Nephrology. , vol. 26, št. 12, str. 3035–3044, 2015.

[5] D. Nakano in A. Nishiyama, "Multifotonsko slikanje ledvične patofiziologije," Journal of Pharmacological Sciences, vol. 132, št. 1, str. 1–5, 2016.

[6] Y. Zhang, D. Nakano, Y. Guan, et al., "Inhibitor natrijevega glukoznega kotransporterja 2 zmanjša poškodbo ledvičnih kapilar in fibrozo po poti, odvisni od vaskularnega endotelijskega rastnega faktorja po poškodbi ledvic pri miših," Ledvice Mednarodna, letn. 94, št. 3, str. 524–535, 2018.

[7] S. Nishioka, D. Nakano, K. Kitada, et al., "Od ciklina odvisen zaviralec kinaze p21 je bistven za ugodne učinke predkondicioniranja ledvične ishemije na ledvično ishemijo/reperfuzijsko poškodbo pri miših," Kidney International, vol. 85, št. 4, str. 871–879, 2014.

[8] Y. Guan, D. Nakano, Y. Zhang et al., "Antagonist receptorja, aktiviranega s proteazo-1, ščiti pred poškodbo podocitov v mišjem modelu nefropatije," Journal of Pharmacological Sciences, vol. 135, št. 2, str. 81–88, 2017.

[9] M. Jiang, Q. Wei, G. Dong, M. Komatsu, Y. Su in Z. Dong, "Avtofagija v proksimalnih tubulih ščiti pred akutno poškodbo ledvic," Kidney International, vol. 82, št. 12, str. 1271–1283, 2012.

[10] X. Hu, M. Su, J. Lin, et al., "Corin je znižan pri ledvični ishemiji/reperfuzijski poškodbi in je povezan z zapoznelim delovanjem presadka po presaditvi ledvice," Disease Markers, vol. 2019, ID artikla 9429323, 8 strani, 2019.

[11] P. Wang, H. Wang, Q. Huang et al., "Eksosomi iz M1- polariziranih makrofagov povečajo protitumorsko aktivnost paklitaksela z aktiviranjem vnetja, ki ga posredujejo makrofagi," Theranostics., vol. 9, št. 6, str. 1714–1727, 2019.

[12] L. Yang, CR Brooks, S. Xiao, et al., "KIM-1-posredovana fagocitoza zmanjšuje akutno poškodbo ledvic," The Journal of Clinical Investigation, vol. 125, št. 4, str. 1620–1636, 2015.

[13] L. Xu, X. Li, F. Zhang, L. Wu, Z. Dong in D. Zhang, "EGFR poganja napredovanje AKI v kronično ledvično boleznijo prek prekomerne ekspresije HIPK2," Theranostics., vol. 9, št. 9, str. 2712–2726, 2019.

[14] T. Hifumi, D. Nakano, J. Chiba et al., "Kombinirano zdravljenje z antitoksinom plinske gangrene in rekombinantnim človeškim topnim trombomodulinom za _Clostridium perfringens_ sepso pri podganjem modelu, " Toksikon, let. 141, str. 112–117, 2018.

[15] N. Hayase, K. Doi, T. Hiruma, et al., "Rekombinantni trombomodulin preprečuje akutno pljučno poškodbo, povzročeno z ledvično ishemijo-reperfuzijsko poškodbo," Scientific Reports, vol. 10, št. 1, str. 289, 2020.

[16] E. Lazzeri, ML Angelotti, A. Paired et al., "Hipertrofija tubularnih celic, povezana z endociklom, in proliferacija matičnih celic obnovita delovanje ledvic po akutni poškodbi ledvic," Nature Communications, vol. 9, št. 1, str. 1344, 2018.

[17] K. Takaori, J. Nakamura, S. Yamamoto, et al., "Resnost in pogostost poškodbe proksimalnega tubula določata ledvično prognozo," Journal of the American Society of Nephrology: JASN, vol. 27, št. 8, str. 2393–2406, 2016.

[18] BD Humphreys, MT Valerius, A. Kobayashi, et al., "Intrinzične epitelne celice popravljajo ledvico po poškodbi," Cell Stem Cell, vol. 2, št. 3, str. 284–291, 2008.

[19] R. Wakasaki, K. Matsushita, K. Golgotiu, et al., "Proteini glomerularnega filtrata pri akutnem kardiorenalnem sindromu," JCI Insight, vol. 4, št. 4. 2019.

[20] M. Riewald, RJ Petrovan, A. Donner, BM Mueller in W. Ruf, "Aktivacija receptorja 1, aktiviranega s proteazo endotelijskih celic, s potjo proteina C", Science, vol. 296, št. 5574, str. 1880–1882, 2002.

[21] MJ Ludeman, H. Kataoka, Y. Srinivasan, NL Esmon, CT Esmon in SR Coughlin, "PAR1 cepitev in signalizacija kot odziv na aktivirani protein C in trombin*," The Journal of Biological Chemistry, vol. 280, št. 13, str. 13122–13128,

2005.

[22] JH Griffin, BV Zlokovic in LO Mosnier, "Activated protein C: biased for translation," Blood, vol. 125, št. 19, str. 2898–2907, 2015.

[23] R. Essalmani, D. Susan-Resiga, J. Guillemot, et al., "Aktivacija proteina C s trombinom zahteva predhodno obdelavo z jetrno proproteinsko konvertazo," The Journal of Biological Chemistry, vol. 292, št. 25, str. 10564–10573, 2017.

[24] S. Van Laecke in W. Van Biesen, "Huda hipertenzija z ledvično trombotično mikroangiopatijo: kaj se je zgodilo z običajnim osumljencem?", Kidney International, vol. 91, št. 6, str. 1271–1274, 2017.

[25] M. Waasdorp, J. Duitman, S. Florquin in CA Spek, »Pomanjkanje receptorja, aktiviranega s proteazo-1, ščiti pred diabetično nefropatijo, ki jo povzroča streptozotocin pri miših,« Znanstvena poročila, vol. 6, št. 1, str. 33030, 2016.