Zaščitni učinki in mehanizmi procianidinov na Parkinsonovo bolezen in vivo in in vitro 2. del

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

2.7. Učinki osebnih računalnikov na oksidativni stres cebric Larae, zdravljenih z MPTP

Zdravljenje ličink cebrice s PC-ji je zmanjšalo MPTP-inducirano povečano znotrajcelično tvorbo ROS (slika 7a, b). Poleg tega so rezultati testa lipidne peroksidacije pokazali, da je izpostavljenost PC-ju （16 ug/mL） blokirala MPTP-inducirane ravni MDA v ličinkah cebric (slika 7c). Poleg tega je bilo z MPTP povzročeno zmanjšanje aktivnosti GSH-Px obrnjeno z zdravljenjem s PC（16 ug/mL） (slika 7d）, PCs (4,8 in 16 ug/mL) pa je povečalo z MPTP povzročeno zmanjšanje CAT in SOD aktivnost (Slika 7e,f).

Figure 7. Effects of PCs on oxidative stress of zebrafish larvae treated with MPTP. (a)ROS levels were measured by fluorescent microscopy and imaging analysis;(b)ROS levels were measured via imageJ software;(c) MDA levels;(d) GSH-Pxactivity;(e)CATactivity;(f) SOD activity. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart.The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns, p>0.05;*,p<><0.01;***, p=""><0.001; the="" error="" bars="" are="">

Za več informacij kliknite tukaj

2.8. Učinki osebnih računalnikov na Nr2/ARE Patlhroay pri MPTP-inducirani zebrici Laroa

Zdravljenje ličink cebrice s PC-ji je poudarilo predpostavko, da je aktivacija poti Nr2/ARE vključena v PC-posredovane zaščitne lastnosti. Izražanje markerjev Nrf2, HO-1, NQO1, GCLC in GCLM je bilo z zdravljenjem s PCs povečano v primerjavi z izpostavljenostjo samo MPTP (slika 8a-e).

Figure 8. Effects of PCs on Nrf2/ARE pathway in MPTP-induced zebrafish larvae. (a) Nrf2 levels;(b)HO-1 levels;(c)NQO1 levels;(d) GCLClevels;(e) GCLM levels. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns,p>0.05;*,p<><><0.001:the error="" bars="" are="">

3. Razprava

Osebni računalniki izkazujejo močne sposobnosti čiščenja radikalov in antioksidativno aktivnost, oksidativni stres, ki ga povzroča čezmerno nastajanje ROS in/ali okvarjen antioksidativni obrambni sistem, pa igra ključno vlogo pri PD [37-39]. Vendar ostaja nejasno, ali lahko osebni računalniki igrajo nevroprotektivno vlogo z antioksidativnimi učinki. Namen te raziskave je bil raziskati molekularni mehanizem osebnih računalnikov proti modelom PD, ki jih povzroča MPP plus /MPTP.

Cistanche lahko izboljša imuniteto

V tej študiji so osebni računalniki v primerjavi s skupino, ki je prejemala MPP plus/samo MPTP, opazno zvišali raven aktivnosti antioksidativnih encimov (vključno z GSH-Px, CAT in SOD) ter znižali ravni ROS in MDA. Trenutne ugotovitve so skladne s prejšnjo študijo, ki kaže, da dodatek z nizko vsebnostjo PC prek prehrane izboljša aktivnosti GSH-Px, CAT in SOD pri odstavljenih pujskih [40]. Druga študija tudi nakazuje, da osebni računalniki znatno povečajo aktivnosti CAT in SOD ter zmanjšajo vsebnost MDA, s čimer izboljšajo kakovost kozje sperme[41]. Te ugotovitve kažejo, da imajo osebni računalniki zaščitni učinek na oksidativne poškodbe živčnih celic. Poleg tega so osebni računalniki izboljšali sposobnost preživetja celic v primerjavi s skupino, ki je prejemala sam MPP plus, v celicah PC12, induciranih z MPP plus, izrazito povečali skupno prevoženo razdaljo in zmanjšali gostoto celic TH plus glede na skupino MPTP v ličinkah cebric, ki jih je povzročil MPTP. Ti podatki kažejo, da imajo osebni računalniki zaščitni učinek na živčne celice.

Nadalje smo opazili, da so osebni računalniki znatno povečali jedrsko kopičenje Nrf2 v primerjavi s samim MPP plus v celicah PC12. Dejansko so osebni računalniki izrazito povečali ravni izražanja NQO1, HO-1, GCLM in GCLC[42]. Poleg tega je bilo utišanje gena Nfr2 prek siRNA Nrf2 uporabljeno za raziskovanje vloge aktivacije Nrf2/ARE pri nevroprotekciji, ki jo posreduje osebni računalnik, pred oksidativno škodo, povzročeno z MPP plus: celice, transficirane z Nrf2-siRNA, so pokazale izrazito zmanjšanje izražanja Nrf2. Ta trenutna študija je tudi ugotovila, da je izločitev Nrf2 odpravila zaščito, posredovano s PC-ji, pred okvarami v viabilnosti celic, zdravljenimi z MPP plus, in antioksidativne učinke PC-jev. Ti rezultati so skladni s prejšnjo študijo, ki kaže, da izboljšanje aktivacije poti Nrf2/ARE prispeva k nevroprotekciji [43].

Pot Nrf2/ARE je pomembna antioksidativna pot [44-46]. Običajno se Nrf2 nahaja v citoplazmi, kjer je vezan na inhibitorni protein Keapl [47,48]. Ko so celice podvržene oksidativnemu stresu, Nrf2 disociira od Keap1, sproži endogeni antioksidativni obrambni sistem in se nato preseli v jedro [46,49,50]. Nato sodeluje z ARE, da aktivira vrsto genov za zaščito celic in antioksidantov, vključno z GCLC, GCLM, NQO1 in HO-1 [51-54]. Kot odziv na oksidativni stres Nrf2 disociira od Keap1 v citosolu in se nato prenese v jedro ter se veže na zaporedje ARE, da aktivira transkripcijo krioprotektivnih genov [53-58]. Trenutni rezultati kažejo, da lahko osebni računalniki aktivirajo pot Nrf2/ARE, prenesejo Nrf2 iz citoplazme v jedro, se kopičijo v jedru, povečajo izražanje GCLC, GCLM, NOO1 in HO-1 ter izboljšajo sposobnost celice, da se uprejo oksidativnemu stresu. Dejansko lahko pot Nrf2/ARE predstavlja farmakološko tarčo osebnih računalnikov za preprečevanje PD.

4. Materiali in metode

4.1. Kemične spojine in reagenti

Sredstva MPP plus in MPTP so bila kupljena pri Sigmi (St. Louis, MO, ZDA), komplet za štetje celic-8 pa pri Beyotime (Šanghaj, Kitajska). PCs, 2', 7/-diklorofluorescin diacetat, MDA, GSH-Px, SOD in CAT diagnostični kompleti so bili vsi pridobljeni od Solarbio (Peking, Kitajska). RNAiso Plus, reagentni komplet PrimeScriptTMRT z radirko gDNA in SYBRPremix Ex TaqTMⅡI so bili kupljeni pri Takari (Shiga, Japonska); Nrf2-siRNA, kontrolna-siRNA in Lipofectamine 2000 so bili pridobljeni pri GenePharma (Šanghaj, Kitajska). Končno so bila primarna protitelesa, Nrf2, HO-1, GCLC, GCLM, NAD(P)H: NQO1, Lamin B, GAPDH, antitirozin hidroksilaza (TH) in ustrezna sekundarna protitelesa pridobljena od Proteintech (Wuhan, Kitajska). ).

4.2.Celična kultura

Celice PC12 so bile pridobljene iz Nacionalne zbirke avtenticiranih celičnih kultur. Celice smo vzdrževali v DMEM, dopolnjenem z 10-odstotnim fetalnim govejim serumom in penicilin-streptomicinom (100 U/mL; 100 ug/mL) v inkubatorju z vlažno atmosfero pri 37 stopinjah s 5-odstotnim CO2 [59].

4.3. Test viabilnosti celic

Celice PC12 (1 × 104 celic/jamico) smo 24 ur inkubirali z 1,2 ali 4 ug/mL PC ali deprenvl （30 μM） in nato 24 ur inkubirali z 1,5 mM MPP plus. Nato smo v vsako vdolbino dodali 10 μL raztopine kompleta za štetje celic-8 in inkubirali 1 uro. Absorbanca je bila izmerjena pri 450 nm [60].

4.4. Vzdrževanje rib

Etično odobritev za uporabo na živalih je podelil odbor za ohranitev in uporabo živali Centra za poskusne živali Univerze Zhejiang (ZJU20200125). Odrasle ribe cebrice (sev AB) so bile pridobljene iz centra za laboratorijske živali univerze Zhejiang (Hang Zhou, Kitajska) in vzdrževane pri 28 ± 1 stopinji pod cikli 14 ur svetlobe/10 ur teme. Ribe so bile hranjene z Artemia nauplii dvakrat na dan [61]. Za proizvodnjo zarodkov so odrasle cebrice čez noč dali v rezervoarje za vzrejo v razmerju 1:1 samci: samice. Drstenje se je sprožilo po prižigu luči naslednje jutro in končalo v 2 urah. Zarodki so bili vzgojeni v vodi za zarodke（13,7 mM NaCl, 540 µM KCl, 25 uM Na2HPOA44 uM KHPOA, 300 uM CaCl2, 100 µM MgSO, 420 µM NaHCO3, pH 7,4） pri 28 stopinjah 【62,63】.

4.5. Merjenje ROS

Za merjenje produkcije ROS smo celice PC12 (2×104 celic/vdolbinico) izpostavili 1,2 ali 4 ug/ml PCS ali deprenilu （30 μM） za 24 ur in jih nato inkubirali z 1,5 mM MPPt za 24 ur 【64】. Celice smo izpostavili 10 μM raztopini 2',7'-diklorofluorescin diacetata v temnih pogojih 30 minut; raztopino barvila smo nato odstranili in celice 3-krat sprali s fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS). Slike celic so bile opazovane z laserskim skenirnim konfokalnim mikroskopom Olympus (Olympus, prestolnica Tokio, Japonska). Intenzivnost fluorescence celic je bila kvantificirana s programsko opremo Image J v1.8.0 (Olympus, glavno mesto Tokio, Japonska). Rezultati so izraženi kot odstotek površine regij ROS v kontrolni skupini.

Za merjenje proizvodnje ROS so bile ličinke cebrice 3 dni po oploditvi (dpf) izpostavljene deprenilu (40 µM) ali 4,8 ali 16 ug/mL PC z ali brez 400 µM MPTP 4 dni. Ličinke ribice cebrice pri 7 dpf smo prenesli na 24-ploščo z jamicami (10 ličink na skupino), obdelali z 20 μM raztopino 2',7'-diklorofluorescin diacetata in inkubirali 60 minut v temi pri 28,5 stopinjah [65]. ]. Ličinke smo nato trikrat sprali z embrionalnim medijem, da smo odstranili presežek 2',7'-diklorofluorescin diacetata. Slike obarvanih ličink smo opazovali z laserskim skenirnim konfokalnim mikroskopom Olympus. Intenzivnost fluorescence posamezne ličinke je bila kvantificirana s programsko opremo Image J. Rezultati so izraženi kot odstotek površine regij ROS v kontrolni skupini. 4.6. Ocena MDA, GSH-Px, SOD in CAT

Celice PC12 (2 × 104 celic/jamico) so bile 24 ur izpostavljene 1,2 ali 4 ug/ml PCS ali deprenila （30 μM） in nato 24 ur inkubirane z 1,5 mM MPP plus. Nato smo 1 mL ekstrakta dodali celicam 4 × 10 stopinj in celice razbili z ultrazvočnim centrifugiranjem pri 8000 obratih na minuto pri 4 stopinjah 10 minut. Supernatant smo nato dali na led za testiranje in dodali reagente za določanje MDA, GSH-Px, SOD oziroma CAT. Vsak indeks je bil ponovljen v trojniku.

Ličinke cebrice pri 3dpf so bile 4 dni inkubirane z deprenilom（40 μM） ali 4,8 ali 16 ug/mL PC z ali brez 400 μM MPTP. Nato smo 0,05 g tkiva ličinke cebrice in 0,5 ml ekstrakta homogenizirali v ledeni kopeli in nato centrifugirali pri 4 stopinjah 10 minut. Supernatant smo dali na led za testiranje. Nato so bili dodani reagenti za določanje MDA, GSH-Px, SOD oziroma CAT. Vsak indeks je bil ponovljen v trojniku.

4.7. Priprava celoceličnega, citoplazemskega in jedrnega proteina

Za ekstrakcijo beljakovin iz celih celic so bile celice zbrane in inkubirane s pufrom za lizo RIPA, ki je vseboval 1 odstotek PMSF in 1 odstotek koktajla inhibitorja proteaze 30 minut na ledu. Celične lizate smo centrifugirali, supernatant pa zbrali in shranili. Za pripravo subcelularne frakcioniranja so bili vzorci celic obdelani z uporabo kompleta za ekstrakcijo jedrskih in citoplazemskih beljakovin. Vsebnost beljakovin je bila testirana s testom BCA (Beyotime, Šanghaj, Kitajska).

4.8. Transfekcija siRNA Nrf2

Nrf2-siRNA je bila uporabljena za knockdown Nrf2. Celice PC12 smo transficirali z Nrf2-siRNA (80 nM) ali kontrolno-siRNA z uporabo Lipofectamine 2000, v skladu s priročnikom. 4.9.Western blotting

Vzorce beljakovin smo ločili s SDS-PAGE in jih prenesli na membrane iz poliviniliden di-fluorida (PVDF). Blote smo izpostavili ustreznim primarnim protitelesom: Nrf2, Keap1, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM, Lamin B, GAPDH in s peroksidazo konjugiranim sekundarnim protitelesom. Proteinske trakove smo vizualizirali z uporabo ECL (Beyotime, Šanghaj, Kitajska) in reagentov za odkrivanje Western blotting [36, 43].

4.10.Lokomotorni vedenjski test

Ličinke cebrice pri 3dpf so bile 4 dni inkubirane z deprenilom (40 µM) ali 4,8 ali 16 ug/mL PC z ali brez 400 uM MPTP. Cebrice s 7 dpf so bile nato postavljene v 24-plošče z jamicami (1 riba na jamico in 12 ličink na skupino) in zabeležena je bila skupna razdalja, ki jo je vsaka riba preplavala v 10 minutah. Obnašanje cebric je bilo spremljano in analizirano z avtomatiziranim sistemom za video sledenje (Any-maze 4.73, Stoelting, Wood Dale, IL, ZDA) [66].

4.11 Ekstrakcija celotne RNK, povratna transkripcija in kvantitativna verižna reakcija polimeraze v realnem času

RNA je bila ekstrahirana z uporabo RNAiso Plus po navodilih proizvajalca. RNA je bila reverzno prepisana z uporabo PrimeScriptTMRT Reagent Kit z gDNA Eraser, po navodilih proizvajalca. Kvantitativno analizo PCR v realnem času smo izvedli na sistemu Applied Biosystems ViATM 7 Real-Time PCR z uporabo SYBRPremix Ex TaqTM II (Takara, Shiga, Japonska). -aktin je bil uporabljen kot referenčni gen in relativna genska ekspresija je bila izračunana z uporabo metode 2-△Ct. Sekvence primerjev, uporabljene v raziskavi, so navedene v tabeli 1.

4.12. Celotno imunsko obarvanje z antitirozin hidroksilazo (TH) cebrice

Ličinke cebrice pri 1 dpf so bile 2 dni inkubirane z deprenilom （40 μM） ali 4,8 ali 16 ug/mL PC z ali brez 400 uM MPTP (10 šarž rib/skupino). Ličinke smo fiksirali s 4 odstotki paraformaldehida v PBS 30 minut. Po fiksaciji so jih zdravili za imunsko obarvanje celotne gorinke TH [67]. Pri sobni temperaturi sta bila 2 odstotka (v/o) jagnječjega seruma in 0,1 odstotka （w/ø）govejega serumskega albumina （BSA） za 1 uro blokirana v fiziološki raztopini Tween-20(PBST) s fosfatnim pufrom. Nato so bili v blokirnem pufru izpostavljeni antitirozinhidroksilazno protitelo (razredčeno 1:200, Proteintech) 2 uri in nato 6-krat izperemo s PBST. Končni korak imunskega obarvanja celega nosilca smo izvedli v pufru za barvanje s 488 kozjim antikunčjim (1:500) 1 uro in ponovno sprali s PBST. Po zadostnem razvoju barve so bile cebrice plosko nameščene s 3,5 odstotkametilcelulozain posnet z Olympusovim laserskim skenirnim konfokalnim mikroskopom.

4.13. Statistična analiza

Za primerjavo povprečij različnih skupin je bila uporabljena enosmerna analiza variance (ANOVA), ki ji je sledil Tukeyjev test večkratne primerjave. Za statistično analizo in risanje grafov je bil uporabljen Graphpad Prism v6.01 (programska oprema GraphPad, San Diego, CA, ZDA).

5. Sklepi

Skratka, naše ugotovitve kažejo, da osebni računalniki izvajajo nevroprotektivne učinke prek aktivacije poti Nrf2/ARE in njene nižjerazstrupljanjeinantioksidant encimi. Ti vpogledi skupaj kažejo, da so lahko osebni računalniki koristni za zdravljenje PB.

Ta članek je izvleček iz Molecules 2021, 26, 5558. https://doi.org/10.3390/molecules26185558 https://www.mdpi.com/journal/molecules